第九章凝膠滲透色譜

1、凝 膠 色 譜 分 析二一一年九月九日第九章 凝膠色譜分析凝膠滲透色譜（Gel Permeation Chromatography, GPC），又稱尺寸排阻色譜（Size Exclusion Chromatography, SEC），其以有機溶劑為流動相，流經(jīng)分離介質多孔填料（如多孔硅膠或多孔樹脂）而實現(xiàn)物質的分離。GPC可用于小分子物質和化學性質相同而分子體積不同的高分子同系物等的分離和鑒定。凝膠滲透色譜是測定高分子材料分子量及其分布的最常用、快速和有效的方法1。凝膠滲透色譜（GPC）的創(chuàng)立歷程如下2,5：1953年Wheaton和Bauman用多孔離子交換樹脂按分子量大小分離了苷、多元醇和

2、其它非離子物質，觀察到分子尺寸排除現(xiàn)象；1959年Porath和Flodin用葡聚糖交聯(lián)制成凝膠來分離水溶液中不同分子量的樣品；1964年J. C. Moore將高交聯(lián)密度聚苯乙烯-二乙烯基苯樹脂用作柱填料，以連續(xù)式高靈敏度的示差折光儀，并以體積計量方式作圖，制成了快速且自動化的高聚物分子量及分子量分布的測定儀，從而創(chuàng)立了液相色譜中的凝膠滲透色譜。近年來，光散射技術（如圖9-1所示，一束光通過一間充滿煙霧的房間，會產(chǎn)生光散射現(xiàn)象。）廣泛應用于高分子特征分析領域3。將光散射技術和凝膠滲透色譜（GPC）分離技術相結合，可以測定大分子絕對分子量、分子旋轉半徑、第二維里系數(shù)，也可測定分子量分布、分子形

3、狀、分枝率和聚集態(tài)等。目前，該技術在高分子分析領域已成為一種非常有效的工具，在美國，日本及歐洲廣為使用，國內近年來亦引進了此項技術。入射光散射光圖9-1光散射現(xiàn)象9.1 基本原理9.1.1 凝膠滲透色譜分離原理讓被測量的高聚物溶液通過一根內裝不同孔徑的色譜柱，柱中可供分子通行的路徑包括粒子間的間隙（較大）和粒子內的通孔（較?。Ｈ鐖D9-2、圖9-3所示，當待測聚合物溶液流經(jīng)色譜柱時，較大的分子只能從粒子間的間隙通過，被排除在粒子的小孔之外，速率較快；較小的分子能夠進入粒子中的小孔，通過的速率慢得多。這樣經(jīng)過一定長度的色譜柱分離后，不同相對分子質量的物質就被區(qū)分開了，相對分子質量大的在前面流出（

4、其淋洗時間短），相對分子質量小的在后面流出（淋洗時間長）。從試樣進柱到被淋洗出來，所接受到的淋出液總體積稱為該試樣的淋出體積。當儀器和實驗條件確定后，溶質的淋出體積與其分子量有關，分子量愈大，其淋出體積愈小7。 圖9-2 不同尺寸分子通過凝膠原理圖顯然，凝膠色譜法的分離是嚴格地建立在分子尺寸基礎之上的，通常不應該在固定相上發(fā)生對試樣的吸著和吸附。同時，也不應該在固定相和試樣之間發(fā)生化學反應（當然，也有一些凝膠色譜填料，例如，表面磺化交聯(lián)聚苯乙烯顆粒，主要是基于分子尺寸大小而進行分離的。但其表面磺化層又與被測離子之間有輕微的離子交換作用）。 圖9-3 凝膠滲透色譜分離不同分子尺寸試樣示意圖凝膠滲

5、透色譜法的特點是樣品的保留體積不會超過色譜柱中溶劑的總量，因而保留值的范圍是可以推測的，這樣可以每隔一定時間連續(xù)進樣而不會造成色譜峰的重疊，提高了儀器的使用效率。其缺點則是柱容量較小。通常洗脫劑分子是非常小的，它們的譜峰一般是在色譜圖中最后出現(xiàn)（此時為）。顯然，各被測物質均在之前被洗脫，即它們的均小于，這與液-液、液-固和離子交換色譜的情況正好相反。9.1.2 色譜柱參數(shù)及其測定方法6（1） 柱參數(shù)。將凝膠色譜柱填充劑的凝膠顆粒用洗脫劑溶脹，然后與洗脫劑一起填入柱中，此時，凝膠床層的總體積為 （9-1）式（9.1）中，為柱中凝膠顆粒外部溶劑體積；為柱中凝膠顆粒內部吸入溶劑的體積；為凝膠顆粒骨架

6、的體積。、和均稱柱參數(shù)。在實驗中，其數(shù)值均可以測定。被測物質的洗脫體積 （9-2）式（9.2）中，K為固定相和流動相之間的被測溶質的分配系數(shù) （9-3）式（9.3）中，為凝膠顆粒內部溶質能進入部分的體積。由上可見，凝膠色譜分離的過程中，沒有受到任何其它吸附現(xiàn)象或化學反應的影響，它完全基于分子篩效應。 若K=0，待測分子不能進入凝膠顆粒內部； 若0<K<1，待測分子可以部分地進入凝膠顆粒內部； 若K=1，待測分子完全浸透凝膠顆粒內部； 若K>1，表面存在吸附作用等其它影響存在。若將用凝膠相的總體積代替，且 （9-4）則有 （9-5） （9-6）式（9.6）中，、和都容易測定，所

7、以在實際工作中，人們喜歡用。與之間的關系為 （9-7）（2） 柱參數(shù)的測定。為色譜柱的內體積。為完全不能浸入凝膠顆粒內部的溶質分子的洗脫體積。例如，可以通過聚苯乙烯等高分子化合物來測定和。例如，測定用氘標記丙酮和己烷（GPC）的，由公式 （9-8）此時，K=1，所以 （9-9）即可求得。此外 （9-10）式中，為干燥凝膠的質量，g；為凝膠內部單位質量保留溶劑的體積，mL/g。9.1.3 凝膠滲透色譜法校正原理用相對分子質量已知的單分散標準聚合物預先做一條淋洗體積（或淋洗時間）與相對分子質量對應關系的曲線，該線稱為“校正曲線”。然而聚合物中幾乎找不到單分散的標準樣，所以一使用窄分布的試樣代替。在

8、相同的測試條件下，做一系列的GPC標準譜圖，分別對應不同相對分子質量樣品的保留時間，以lgM對t作圖，所得曲線即為“校正曲線”。通過校正曲線，就可以從GPC譜圖上計算出各種所需相對分子質量與相對分子質量分布的信息。聚合物中能夠制得標準樣的聚合物種類并不多，沒有標準樣的聚合物就得不到校正曲線，單獨使用GPC方法也得不到聚合物的相對分子質量和相對分子質量分布信息。對于這種情況可以利用普適原理加以校正7。9.1.4 普適校正原理由于GPC對聚合物的分離是基于分子流體力學體積而實現(xiàn)的，即對于具有相同分子流體力學體積的聚合物，能在同一個保留時間流出，即它們的流體力學體積相同。8依照聚合物鏈的等效流體力學

9、球模型，Einstein的黏度關系式為 （9-11）式中，為特性黏數(shù)；M為相對分子質量；V為聚合物鏈等效球的流體力學體積；N為阿伏伽德羅常數(shù)。可以用來表征聚合物的流體力學體積。兩種柔性鏈的流體力學體積相同：1M1=2M2 （9-12）式中，腳標1和2分別代表兩種聚合物，把Mark-Houwink方程=KM （9-13） （9-14）兩邊取對數(shù)：lgk1+(1+1)lgM1=lgk2+(2+1)lgM2 （9-15）即如果已知標準樣和被測高聚物的k、值，就可以由已知相對分子質量的標準樣品M1標定待測樣品的相對分子質量M2。實驗證明，該法對線性和無規(guī)則團形狀的高分子的普適性較好，而對長支鏈的高分子

10、或棒狀剛性高分子的普適性還有待研究。9.1.5 光散射理論4,9激光照射到樣品時，會在各個方向產(chǎn)生散射光，于是我們可以在一個角度或多個角度收集散射光的強度。1.光散射所透露的信息光散射強度與分子量和溶液的濃度成正比；散射光角度的變化與分子的尺寸大小相關。1）當分子尺寸小于10nm時，各角度散射強度相同；2）當分子尺寸在10與30nm之間時，散射強度隨角度增大呈現(xiàn)直線下降的趨勢；3）當分子尺寸大于30nm 時，散射強度隨角度增大呈曲線下降的趨勢。2.基本理論通常，溶劑中分子光散射現(xiàn)象可用公式9-16表達： （9-16）式中：常數(shù) （9-17）n0是溶劑的折光指數(shù)；c是溶液濃度；NA是阿伏伽德羅常

11、數(shù)；0為入射光波長；dn/dc表示溶液折射率與濃度變化的比值，它表明了聚合物在溶液中的比折光指數(shù)增量；R是超瑞利系數(shù)；Mw是重均分子量；A2是第二維里系數(shù)，是溶質與溶劑相互作用的量度；P()是光散射強度的函數(shù)。 （9-18）將P代入式（1）展開得： （9-19）在上式中，R為測量值，K*c、0、為已知值；Mw、A2、rg為未知值。3.Zimm Plot如圖9-4所示，為著名的Zimm曲線。當 0，c 0，簡化為 （9-20） 圖9-4 Zimm Plot可通過實驗測定Mw值。配制不同濃度梯度的溶液，在不同的角度測量其散射光強度，繪制Zimm Plot，求得Mw，<rg2>及A2值。

12、但由于結果僅為單一平均值，因此較適用于成分單一，分布較窄的分子，對于分布較寬或有不同族群分布的樣品，則較難看出全貌。9.2 基本構成及其工作原理9.2.1 GPC系統(tǒng)組成GPC儀的組成：泵系統(tǒng)、（自動）進樣系統(tǒng)、凝膠色譜柱、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)。1.泵系統(tǒng)包括一個溶劑儲存器、一套脫氣裝置和一個高壓泵。它的工作是使流動相（溶劑）以恒定的流速流入色譜柱。泵的工作狀況好壞直接影響著最終數(shù)據(jù)的準確性。越是精密的儀器，要求泵的工作狀態(tài)越穩(wěn)定。要求流量的誤差應該低于0.01 mL/min。2.色譜柱色譜柱是GPC儀分離的核心部件，在一根不銹鋼空心細管中加入孔徑不同的微粒作為填料。每根色譜柱都存在一

13、定的相對分子質量分離范圍和滲透極限，因此色譜柱存在使用上限和下限。色譜柱的使用上限是當聚合物最小的分子的尺寸比色譜柱中最大的凝膠的尺寸還大，這時高聚物無法進入凝膠顆?？讖?，全部從凝膠顆粒外部流過，達不到分離不同相對分子質量的高聚物的目的。并且還會有堵塞凝膠孔的可能，影響色譜柱的分離效果，會降低其使用壽命。色譜柱的使用下限是當聚合物中最大尺寸的分子鏈比凝膠孔的最小孔徑還要小，這時也達不到分離不同相對分子質量的目的。因此，在使用凝膠色譜儀測定相對分子質量時，必須首先選擇一條與聚合物相對分子質量范圍相配好的色譜柱。常用色譜柱如表9-1所示。表9-1 國內外常用凝膠滲透色譜柱及其型號生產(chǎn)廠家凝膠類別柱

14、子尺寸（內徑×長度）分子量分離范圍（聚苯乙烯）滲透極限（分子量或nm）美國Waters、ASS Inc.，ALC/GPC200系列交聯(lián)聚苯乙烯凝膠鍵合硅凝膠7.8mm×30cm3.9mm×300mm0-700，500-104103-2×104105-2×1060.2-5×104700,10000,2×104, 2×105, 2×106,5×104,5×105,10000英國，Applied Res. Lab. LTD950型交聯(lián)聚苯乙烯凝膠8mm×500mm8mm×

15、600mm8mm×900mm8mm×1000mm8mm×1200mm105，3×104,108,30nm日本，東洋曹達公司，G1000H-G7000HGM1×H交聯(lián)聚苯乙烯凝膠8mm×600mm8mm×1200mm103-4×108103, 104, 6×104,4×105,4×106，4×107,4×1083.填料對填料最基本的要求是填料不能被溶劑溶解。主要有有機凝膠和無機凝膠。有機凝膠主要有：交聯(lián)聚乙酸乙烯酯凝膠和交聯(lián)聚苯乙烯凝膠。交聯(lián)聚苯乙烯凝膠的特點是孔徑分

16、布寬，分離范圍大，適用于非極性有機溶劑。三個系列柱的凝膠顆粒分別為5 um、10 um和20 um，分別用于測定低、中和超高分子量的高分子。無機凝膠主要有多孔玻璃、多孔氧化鋁和改性多孔硅膠。其中改性多孔硅膠較常用，其特點是適用范圍廣（包括極性和非極性溶劑）、尺寸穩(wěn)定性好、耐壓、易更換溶劑、流動阻力小，缺點是吸附現(xiàn)象比聚苯乙烯凝膠嚴重。4.檢測系統(tǒng)檢測器裝在凝膠滲透色譜柱的出口，樣品在色譜柱中分離以后，隨流動相連續(xù)地流經(jīng)檢測器，根據(jù)流動相中的樣品濃度及樣品性質可以輸出一個可供觀測的信號，來定量地表示被測組分含量的變化，最終得到樣品組分分離的色譜圖和各組分含量的信息。通用型檢測器：適用于所有高聚物

17、和有機化合物的檢測。主要有示差折光儀檢測器、紫外吸收檢測器、粘度檢測器。5.示差折光儀檢測器溶劑的折光指數(shù)與被測樣品的折光指數(shù)有盡可能大的區(qū)別。6.紫外吸收檢測器在溶質的特征吸波長附近溶劑沒有強烈的吸收。7.選擇型檢測器適用于對該檢測器有特殊響應的高聚物和有機化合物。有紫外、紅外、熒光、電導檢測器等。表9-2 常用GPC及其配置方法配置方法分子量支化回轉半徑傳統(tǒng)GPC相對于標樣的色譜柱校正，得到相對分子量不能不能使用普適校正的傳統(tǒng)GPC需從文獻上得到準確的K/a值，對相對分子量進行的色譜柱普適校正得到絕對分子量不能不能配了黏度檢測器的GPC測出特性黏度，得到K/a值的普適校正能，直接從特性黏數(shù)

18、測出能，但是間接得到配了多角激光檢測器的GPC絕對測出，無需色譜柱校正能，但要符合一些假設能，當有兩個測量角以上三檢測器聯(lián)用的GPC準確結果能能9.2.2 光散射與GPC聯(lián)用圖9-5為光散射儀與GPC聯(lián)用示意圖。由于光散射信號直接與分子量大小有關，從而可以直接測出重均絕對分子量，并且還能夠獲得其它許多有關的信息10。圖9-5 光散射與GPC聯(lián)用9.3 試驗技術9.3.1 溶劑的選擇1.GPC所適宜的溶劑在GPC中，常用溶劑及其主要物理性質列于表9-3中，由表9-3可見，經(jīng)常用于GPC的溶劑有20多種可供選擇。但有機凝膠體系，真正適用的溶劑也只有10多種。選擇對試樣有良好的溶解能力的溶劑，才能使

19、試樣充分溶解，變成具有一定濃度的真溶液，這種均勻透明的分散體系，才有可能實現(xiàn)GPC柱的良好分離。特別對高聚物，由于溶解過程比小分子物質要緩慢，一般需要十幾小時、幾天甚至幾個星期。表9-3 凝膠滲透色譜常用溶劑的物理性質溶 劑密度g/ml沸點運動粘度20，mm2/s折光指數(shù)無紫外吸收下限nm四氫呋喃0.8892660.51(25)1.40702201,2,4-三氯苯1.46342131.89(25)1.5717-鄰二氯苯1.306180.51.261.5516-苯0.87980.10.6521.5005280甲苯0.866110.60.591.4969285N,N-二甲基甲酰胺0.9445153

20、0.901.4280295環(huán)己烷0.77980.70.981.4262220三氯乙烷-73.91.21.4797225二氧六環(huán)1.036101.31.4381.4221220二氯乙烷1.257840.841.4443225間二甲苯0.8676139.10.861.4972290氯仿1.48961.70.581.4476245間甲酚1.034202.820.81.544-二甲基亞砜-189-1.4770-甲醇0.786864.50.55061.3286-水1.00001001.001.3333-過氯乙烯1.6231210.901.505-四氯化碳1.59576.80.9691.4607265鄰氯

21、代苯酚1.265175.64.111.5473(40)-三氟乙醇1.382373.61.20(38)1.291-二氯甲烷1.33540.00.4401.4237220己烷0.659468.70.3261.3749210對二氯苯1.3061801.261.5515-甲基吡咯烷0.8192021.651.47-1-甲基萘-235.0-1.618-三氯乙烯1.46087.190.5661.476-2.溶劑的選擇規(guī)律由于高聚物結構十分復雜，具體表現(xiàn)在： 分子量大并多有分散性； 高分子的形狀有線形的、支化的和交聯(lián)的； 高分子的聚集態(tài)有非晶態(tài)和晶態(tài)結構。特別是晶態(tài)高聚物，溶劑分子較難滲入，溶解困難，可采用

22、升高溫度的方法使其溶解。例如，高密度聚乙烯的熔點是135，它在十氫奈中要在135才能很好溶解；全同立構聚丙烯在四氫萘中，也要135才能很好溶解。極性晶態(tài)高聚物，一般在室溫就能溶解在極性溶劑中。例如聚酰胺可溶于甲苯酚、40硫酸、苯酚-冰醋酸的混合溶劑中；聚對苯二甲酸乙二酯可溶于鄰氯苯酚和重量比為1：1的苯酚-四氯乙烷的混合溶劑中；聚乙烯醇可溶于水、乙醇等。鑒于上述原因，在選擇對高聚物溶解的良溶劑時，應遵循以下幾個原則進行：1) “極性相近”原則極性相近原則是人們長期研究小分子物質溶解時總結出來的，即：溶質和溶劑的極性越相近，二者越易互溶。這種“極性相近”的溶解規(guī)律，在一定程度上也適用于高聚物-溶

23、劑體系。例如未硫化的天然橡膠是非極性的，可很好地溶解于汽油、苯、甲苯等非極性溶劑中；聚苯乙烯可溶于非極性的苯或乙苯中，也可溶于弱極性的丁酮等溶劑；聚丙烯腈是極性的，可溶于二甲基甲酰胺、四氫呋喃、鹵代烷等極性溶劑中。2) “內聚能密度或溶度參數(shù)()相近”原則由聚合物溶解過程的熱力學分析知道，只有當高聚物與溶劑的內聚能密度或溶度參數(shù)接近或相等時，溶解過程才能進行。一般說來，當>1.7-2.0時，高聚物就不溶。因此，從溶劑和高聚物的內聚能密度或密度參數(shù)，可以判定溶劑的溶解能力。高聚物的溶度參數(shù)，除了用實驗方法直接測定外，也可從高聚物的結構式利用下式作近似估算： （9.21）式（9.21）中E為

24、高聚物分子的結構單元中不同基團或原子的摩爾(mol)吸引常數(shù)，為高聚物的密度，M0為結構單元的分子量。3) 高分子-溶劑相互作用參數(shù)X1小于1/2的原則從高分子溶液熱力學理論的推導，高分子-溶劑相互作用參數(shù)X1的數(shù)值可作為溶劑良劣的一個半定量的判據(jù)。如果X1小于1/2，則說明高聚物能溶解在所給定的溶劑中，數(shù)值越小，則溶劑的溶解能力越好；如果X1大于1/2，則高聚物一般不能溶解。因此，X1值偏差1/2的大小可作為判定溶劑溶解能力的依據(jù)。總而言之，高聚物溶劑的選擇，目前還沒有一個統(tǒng)一的規(guī)律可循，所以在實際工作中碰到這類問題時，要具體分析高聚物是結晶的還是非結晶的；是極性的還是非極性的；分子量大還是

25、分子量小等，然后試用上述幾個經(jīng)驗規(guī)律來選擇適宜的溶劑。3.溶劑的選擇GPC所使用的溶劑要求對試樣溶解性能好，并能溶解多種高聚物、低粘度、高沸點、無毒性、且能很好地潤濕凝膠但又不溶解色譜柱中的凝膠、與凝膠不起化學反應，經(jīng)濟易得等。此外，GPC要求溶劑的純度較高，溶劑純度還與檢測器的靈敏度有關，檢測器越靈敏，則要求溶劑純度越高。下面就GPC對所需溶劑選擇的詳細內容和要求加以討論。1) GPC溶劑選擇的標準GPC法與其它色譜方法不同之處是，不是用改變流動相溶劑組成的方法來控制分離度。因此，GPC溶劑的選擇比其它液相色譜方法較為簡單，又因為大多數(shù)凝膠均沒有表面活性所具有的吸附作用，所以流動相溶劑的吸附

26、作用可不予考慮。GPC常用的某些溶劑的性質及其對某些高聚物的溶解性能列于表9-4。從表9-4可以看出四氫呋喃能溶解的高聚物很多，并且它的折光指數(shù)很小，粘度也小，波長在220nm以上紫外吸收不很顯著，故可同時適用于示差折光檢測器與紫外吸收檢測器。表9-4 GPC常用溶劑的某些性質及其對高聚物的溶解性能溶劑沸點折光指數(shù)操作溫度能溶解的高聚物四氫呋喃661.404025-50聚l-丁烯，丁基橡膠，醋酸纖維素，順式聚丁二烯，聚二甲基硅氧烷，未固化環(huán)氧樹脂，聚丙烯酸乙酯，異腈酸酯，三聚氰胺塑料，甲基丙烯酸甲酯-苯乙烯共聚物，苯酚甲醛樹脂，聚丁二烯，聚碳酸酯，聚電解質，聚酯(非線性和不飽和)，多核芳香烴，

27、聚苯乙烯，聚砜，聚醋酸，乙烯酯，聚醋酸乙烯酯共聚物，聚乙烯醇縮丁醛，聚氯乙烯，聚乙烯基甲基醚，丁腈橡膠，丁苯橡膠，硅橡膠，苯乙烯-異戊二烯共聚物，聚乙二醇，聚溴乙烯，聚異戊二烯，天然橡膠，聚甲基丙烯酸甲酯，苯乙烯-丙烯腈共聚物，聚氨酯預聚體苯80.11.5011聚l-丁烯，丁基橡膠，順式聚丁二烯，聚二甲基硅氧烷，未固化環(huán)氧樹脂，聚丙烯酸乙酯，甲基丙烯酸甲酯-苯乙烯共聚物，聚丁二烯，聚醚，聚異丁烯，聚異丁烯共聚物，聚異戊二烯，多核芳香烴，聚苯乙烯，丙烯-1-丁烯共聚物，丁基橡膠，丁腈橡膠，天然橡膠，丁苯橡膠，硅橡膠，氯丁橡膠，聚乙烯醇縮甲醛甲苯1101.494180聚l-丁烯，丁基橡膠，順式聚丁

28、二烯，聚二甲基硅氧烷，未固化環(huán)氧樹脂，聚丙烯酸乙酯，甲基丙烯酸甲酯-苯乙烯共聚物，聚丁二烯，聚醚，聚異丁烯，聚異丁烯共聚物，聚異戊二烯，多核芳香烴，聚苯乙烯，丙烯-1-丁烯共聚物，丁基橡膠，丁腈橡膠，天然橡膠，丁苯橡膠，硅橡膠，氯丁橡膠，聚乙烯醇縮甲醛二甲基甲酰胺1531.426960-80醋酸纖維素，硝酸纖維素，異氰酸酯，聚醚，聚氧乙烯，多核芳香烴，聚苯乙烯，聚氨酯，聚醋酸乙烯酯，聚乙烯醇縮丁醛，聚氟乙烯，聚碳酸酯，聚乙烯基甲基醚，苯乙烯-丙烯腈共聚物，聚氨酯預聚體，氯乙烯-醋酸乙烯酯共聚物鄰二氯苯1801.5515聚l-丁烯，丁基橡膠，順式聚丁二烯，聚二甲基硅氧烷，聚丙烯酸乙酯，聚乙烯-醋

29、酸乙烯酯共聚物，乙烯-丙烯共聚物，三聚氰胺塑料，甲基丙烯酸甲酯-苯乙烯共聚物，聚丁二烯，聚碳酸酯，多核芳香烴，聚苯乙烯，聚醋酸乙烯酯，聚醋酸乙烯酯共聚物，丙烯-1-丁烯共聚物，丁基橡膠，丁腈橡膠，天然橡膠，丁苯橡膠，硅橡膠，聚乙烯，聚丙烯二氯甲烷401.4443主要適用于聚碳酸酯及聚二甲基硅氧烷，多核芳香烴，聚苯乙烯，聚氨酯三氯甲烷61.71.446主要適用于氯丁橡膠及硅橡膠1,2,4-三氯苯2131.517135聚l-丁烯，丁基橡膠，順式聚丁二烯，聚二甲基硅氧烷，聚丙烯酸乙酯，聚乙烯-醋酸乙烯酯共聚物，三聚氰胺塑料，聚丁二烯，聚碳酸酯，不飽和聚酯，聚乙烯（支化），聚乙烯，多核芳香烴，聚苯醚，

30、聚丙烯，聚苯乙烯，聚醋酸乙烯，酯共聚物，聚氯乙烯，丙烯-1-丁烯共聚物，丁基橡膠，丁腈橡膠，天然橡膠，丁苯橡膠，硅橡膠水1001.333葡萄糖，聚電解質，聚乙烯醇四氫萘135聚烯烴流動相溶劑的選擇除了考慮對試樣有良好的溶解性外，還應考慮到對色譜儀材料有無腐蝕性和對凝膠填料有無損害的問題。在凝膠滲透色譜儀中凡接觸溶劑的零部件均是用不銹鋼制成的。因此，能腐蝕不銹鋼的溶劑均不能使用，溶劑中不能含游離的氯離子，在溶劑貯存過程中也不允許逐漸分解出氯離子。水相GPC控制pH值用的鹵素鹽類化合物也會腐蝕不銹鋼部件，應盡可能地采用硫酸鹽和磷酸鹽緩沖液來代替鹵素鹽。但是，應注意當溶劑成分或電解質的濃度發(fā)生改變時

31、，作為電解質的鹽的某些分子大小也會發(fā)生變化。溶劑與檢測器的匹配也是十分重要的問題，如果使用示差折光檢測器近行檢測時，所選溶劑的折光指數(shù)應與被測試樣的折光指數(shù)有盡可能大的差別，這樣可以給出較大的檢測信號，則可在較低的靈敏度擋下，得到基線平穩(wěn)的響應值；反之，若所選溶劑的折光指數(shù)接近被測試樣的折光指數(shù)時，則需要提高檢測器靈敏度方能得到較大的檢測響應值。而提高檢測器靈敏度的結果往往導致噪聲增加，基線不穩(wěn)，給實驗測定結果帶來大的偏差。表9-5給出了一些常見聚合物的折光指數(shù)，由于一般高聚物的折光指數(shù)多在1.41.6之間。所以，最經(jīng)常用的溶劑應該是具有較小折光指數(shù)，其中四氫呋喃由于滿足上述要求，是GPC有機

32、凝膠體系應用最為廣泛的溶劑之一。表9-5 某些常見高聚物的折光指數(shù)高聚物折光指數(shù)高聚物折光指數(shù)聚四氟乙烯1.35丙烯酸酯1.49聚三氟氯乙烯1.42聚乙烯（中密度）1.52丙酸纖維素1.461.49尼龍1.52醋酸纖維素1.461.49聚氯乙烯1.521.55聚乙烯（低密度）1.51尼龍661.53聚丙烯1.49硝化纖維素1.491.51聚異丁烯1.451.46聚砜1.633乙丙共聚物1.4811.483聚碳酸酯1.586聚甲基戊烯1.465聚乙烯（高密度）1.54乙基纖維素1.47脲醛樹脂1.541.56縮醛均聚物1.48丁苯熱塑彈性體1.521.55如果用紫外分光光度計作檢測器時，所選擇的

33、溶劑應在測定波長上沒有吸收或吸收極少，即在所選波長是“透明”的。同時要求溶劑在貯存時也不能分解出具有紫外吸收的化合物。表9-6列舉了部分常用溶劑紫外吸收特征波長。由表9-6可見，對于在紫外區(qū)有強烈吸收的苯系芳香烴溶劑，應考慮用通用檢測器檢測的可能性。在GPC實驗中，配樣所用的溶劑應與流動相溶劑盡可能地保持一致。也就是說，用于溶解試樣的溶劑應取自GPC儀的流動相溶劑，否則譜圖可能會因雜質的折光指數(shù)比溶劑的折光指數(shù)大或小而出現(xiàn)正負雜質峰，造成檢測或定量測定方面的困難。實驗所選用溶劑的粘度應盡可能地低，因為粘度的高低直接影響和限制擴散作用，在一定線速度下，色譜柱的壓降正比于溶劑的粘度。當溶劑的粘度增

34、加兩倍時，分離所需要的時間也相應增加兩倍。同時高粘度溶劑需要較高的色譜傳質能力，造成柱壓相應增高，試樣的傳質擴散速度小，不利于傳質平衡，將會降低色譜的分離度。如果由于被測試樣只能在一些高粘度的溶劑中溶解時，可以適當提高測試溫度，以達到降低溶劑粘度的目的。但是溶劑的粘度也不宜過低，過低粘度的溶劑往往沸點較低。易造成色譜系統(tǒng)接口的泄露，有時甚至在色譜柱或泵中產(chǎn)生氣泡，干擾實驗結果。表9-6 各種常用溶劑的紫外吸收波長溶 劑紫外吸收波長 nm溶 劑紫外吸收波長 nm溶 劑紫外吸收波長 nm正戊烷210二硫化碳380甲醇210石油醚210二氯甲烷230氯代甲烷244間二甲苯290甲基乙基酮330異辛烷

35、210環(huán)己烷210二甲基甲酰胺220乙基乙醚220四氯化碳265鄰二氯苯280正丙醇210四氫呋喃220丙酮330二惡烷220苯280氯化乙烯230乙二醇210甲苯285吡啶315正十二烷210二氯乙烷230乙醇210對二氯苯2802) GPC更換溶劑須知 為了避免更換不同批號和性質的溶劑而引起的示差折光檢測器的基線漂移，一般都采用大容量的溶劑貯瓶，這樣有利于溶劑的均一性。此外為了整個色譜系統(tǒng)能被所換溶劑置換填充完全，需要一定量的溶劑沖洗色譜系統(tǒng)及柱子，沖洗時應采用較大流量為宜，例如對參比池可先用5 mL/min流速沖洗5 min-8 min后，再以2 mL/min的流速沖洗10 min即可。

36、色譜柱的沖洗平衡費時較長，一般若以2 mL/min或1 mL/min的流量沖洗，達平衡尚需2h-3h的時間。 更換不同溶劑有可能引起標定曲線的變化是個值得注意的問題，對于填裝剛性凝膠的柱子影響不大，但對半剛性凝膠柱就有所不問。因此色譜柱的溶劑一旦被更換后應該重新用標定標樣或其它校正方法來標定色譜柱，并用新的標定曲線來計算聚合物的分子量分布。 3) 常用溶劑的毒性及與凝膠填料的適應性GPC常用的溶劑大都具有一定的毒性，并且都是易燃易爆的有機化合物。長期接觸這些溶劑會對人體各器官的健康帶來危害，特別象苯、四氫呋喃、氯苯等有機溶劑，對人的皮膚、肝、肺及視覺器官均產(chǎn)生有害的影響。這就要求從事GPC工作

37、的人員應特別注意，加強安全防護措施。表9-7匯總了常用的GPC溶劑的性質，具體使用時應十分謹慎小心，以防不安全事故的發(fā)生。表9-7 常用溶劑的毒性溶劑種類引火點發(fā)火點爆炸極限，%下限 上限允許濃度ppm注意事項四氫呋喃-14.43212-11.8200在空氣中可生成爆炸性過氧化物，蒸餾前應以氧化亞鐵還原，注意引火性、爆炸性1,2,4-三氯苯110-75不可接觸皮膚鄰二氯苯66-50注意火及皮膚甲苯4.45361.4-6.7100注意引火性及爆炸性二甲基甲酰胺57.84452.210注意引火性及爆炸性氯仿-50防止吸入蒸氣間甲酚945591.15防止碰到皮膚及眼睛而引起燒傷甲醇11.14647.

38、3-36200注意火種及引火性及爆炸性9.3.2 激光光散射與凝膠色譜儀聯(lián)用傳統(tǒng)的光散射法只能確定平均分子量，旋轉半徑及第二維里系數(shù)，而GPC又受泵流速的限制，再加上尋找與待測物結構相似的標準品不易，對低濃度高分子量的部分不敏感。而多角度激光光散射儀(MALLS)與GPC結合，通過相互補充，不僅能直接測得絕對分子量，而且還可以對樣品的組成，從低濃度高分子量到高濃度低分子量，都能解析的很清楚，更可以得到許多有用的信息，如分子量分布曲線和整個試樣的各種平均分子量，分子的形狀，分枝狀況，聚集態(tài)及動力學參數(shù)，反應速率等，其功能與應用普及性正與日俱增。圖9-6 18角度激光光散射儀-DAWN HELEO

39、實驗室使用的是多角度激光光散射儀（MALLS）與凝膠色譜（GPC）聯(lián)用系統(tǒng)，如圖9-6所示，型號規(guī)格：18角度激光光散射儀-DAWN HELEO，由美國Wyatt公司和美國Waters公司生產(chǎn)。主要性能參數(shù)：OPTILAB rEX 示差檢測器（dn/dc儀）和Waters 515單元泵各一套，分子量范圍：103-107（與GPC聯(lián)機實驗），均方根旋轉半徑：10-500nm（典型范圍） ，可測量分子量和分子量分布、均方根旋轉半徑分布、構象及枝化等。主要技術特點：無需標樣和做校正曲線，直接獲得絕對分子量（重均分子量）及其分布，構象和枝化等數(shù)據(jù)，操作簡便，信息量大，是對高分子表征的最先進方法和手段之

40、一。實驗操作步驟如下：(1)、樣品的制備和處理稱取適量樣品，溶解在合適的溶劑中，以容量瓶定容，配成一定濃度的稀溶液，高速離心后取上清液，經(jīng)0.20.45m的尼龍微孔膜過濾，備用。(2)、色譜分析條件18角度激光光散射儀-DAWN HELEO，OPTILAB rEX 示差檢測器（dn/dc儀），凝膠柱Shodex804，光源氣體氦氣和氖氣。選定合適的流動相（如四氫呋喃，色譜純），流速（如1mL/min），色譜柱溫（如30），定量環(huán)(如50200L)，試樣溶液濃度（如2060mg·mL-1），選定合適的波長。(3)、具體步驟 根據(jù)所作實驗需要認真配制樣品； 開機后，不論單機還是聯(lián)機測試，

41、都要對儀器進行充分清洗平衡，打開泵的電源，自檢通過后，以0.1mL/min的起始流速，每12分鐘提高0.1mL的速度，將流速調整至實驗流速； 打開HELEOS的電源，34分鐘后通過自檢，自動進入實驗界面，用泵或注射器將溶劑注入儀器，基線沖洗成一條直線（噪音在最佳狀態(tài)下一般小于十萬分之5V），即可開始實驗； 示差OPTILAB rEX，在清洗平衡過程中，要打開PURGE，充分清洗參比和樣品池；清洗過程中不時打開、關上PURGE，趕出氣泡，然后關上PURGE，回零（ZERO）即可開始實驗； 如做GPC聯(lián)機實驗，在軟件設置好前，將進樣閥扳至LOAD狀態(tài)； 在軟件中選擇正確的試驗模版，設置參數(shù)，點擊R

42、UN，開始實驗； 采集、處理數(shù)據(jù)； 充分清洗儀器； 將流速以0.1mL/12min的速率下調至0； 關機。9.3.3 實驗要求及注意事項1.實驗要求 對于樣品處理、溶解要嚴格按照要求完成。 樣品和溶劑都要嚴格過濾。激光光散射實驗中必須對樣品嚴格除塵，溶液中的灰塵會產(chǎn)生強烈的光散射，嚴重干擾聚合物溶液光散射的測量。溶液除塵是光散射成敗的關鍵。首先是溶劑除塵，配置測試樣品的溶劑應進行精餾，并經(jīng)過0.20 m0.45 m超濾膜過濾后方可使用。配好的溶液也要用0.20 m0.45 m的超濾膜過濾。另外，測試中所用的器械，如：注射器等，使用前要用洗液浸泡，清水強力沖洗。 示差結構特殊，不要忘記打開PUR

43、GE沖洗。 替換溶劑要注意溶劑之間的互溶性。 泵流速升降一定要慢，否則會造成柱子的損壞。柱子為耗材，不在保修范圍之內。 做單機實驗最好選擇進口濾頭，國產(chǎn)濾頭易破，會造成管路堵塞。2.測量角度 在低角度的時候，有雜質所產(chǎn)生的噪音信號干擾會很大，如圖9-7所示，所以只取低角度，加上九十度兩個角度，其誤差就會相對很大；若只取九十度則只能求得分子量，無法測得旋轉半徑，所以最起碼要加上一組高角度來修正，則誤差會小很多。圖9.7 雜質較多的GPC層析圖實驗室儀器mini DAWN TREOS如圖9-8所示，在與入射光成45度、90度、135度角配置三組光電二極管檢測器，同時檢測不同角度的光散射強度，而激光

44、經(jīng)由樣品槽的毛細管通道，樣品槽為石英材質。圖9-8 三個檢測角度如果要增加測量角度，可以如DAWN HELEOS在樣品槽的兩側以不對稱的方式增加檢測器的數(shù)目，如圖9-9所示可高達18個角度之多。圖9.9 十八角度檢測器9.4 應用9.4.1 高分子聚合物特性圖9-10和圖9-11顯示高分子混合物經(jīng)分離后MALLS及RI的洗脫體積對照圖。由圖中可以看出RI 對大分子量濃度低的物質較不敏感，而對低分子量高濃度者較敏感。圖9-10 由ASTRA軟件得到的miniDAWN（上）和Optilab示差檢測器（下）信號1、BSA：67000，64300±700，1%；2、溶解酵素：14300，14

45、,600±300，1%；3、緩激肽：1060，1090±10，2%；4、亮氨酸腦啡肽：556，592±6，3%圖9-11 分子量對洗脫體積圖9.4.2 蛋白質及其聚合體在各種工業(yè)應用中，測定蛋白質的絕對特性不僅嚴格而且必要，例如在生化工程應用上，以蛋白質為基質的產(chǎn)品必須很純而且無任何聚集存在。而測定蛋白質的分子量和是否有聚集態(tài)存在，光散射法是最理想的工具之一。以往，在水相中用低角度光散射測量法（LALLS）受到溶劑中不純的物質干擾相當大。而MALLS的多角度測量大大降低了背景噪音的干擾，并能提供完整的信息和良好的重現(xiàn)性結果。圖9-13顯示蛋白質混合物的MALLS

46、和RI的信號。樣品在0.1M NaCl 中含0.05M的磷酸鹽緩沖液中進行RI為Wyatt Optilab 903，流速為0.1mL/min ,色譜柱為Shodex KW-803 和KW-804。雖然此樣品為標準樣品，但MALLS仍很清楚地檢測到聚集現(xiàn)象，此現(xiàn)象在RI幾乎無法辨認。圖9-13 蛋白質洗脫體積及聚集體信號圖9.4.3 分枝高分子聚合物的分枝程度和分布是影響其物理和化學性質的一個重要因素。采用多角度激光光散射系統(tǒng)（MALLS）與GPC系統(tǒng)聯(lián)用是唯一決定分枝系數(shù)gM的方法。雖然也有一些其他確定分枝的方法，但是都不夠直接且需要眾多假設及“虛擬因子”。由傳統(tǒng)的RI或Viscometer

47、（粘度檢測器）測定的高枝化分子的分子量與絕對值有很大的差別，若欲做有效的色譜柱校正，則需以一系列與待測物成分相同的標準品作校正。若標準樣品與待測物的成分或組分不同，則會產(chǎn)生很大的誤差。例如分子量相同的球形高分子的洗脫時間比無規(guī)則線團狀分子要長。圖9-14為由MALLS測得的分枝狀和長鏈形的高分子（PS）的旋轉半徑和分子量對照圖?？煽闯?，雖然其分子量相同，但分布明顯不同。圖9-15為rg對 Mw做圖，可以看出樣品（藻酸鈉）在輻射后分子構型的變化。圖9-14 PS線形與枝化分子的對照圖圖9-15 旋轉半徑對分子量圖（分子構型圖）9.4.4 動力學/反應速率使用MALLS，可研究抗原-抗體反應，反應

48、發(fā)生時就可決定聚集粒子的大小。當改變溫度，濃度或催化劑時，MALLS可記錄下反應發(fā)生時，分子的特殊變化。圖9-16 濃度變化對蛋白聚集的影響使用DAWN 檢測器研究了濃度對分子量為75 KD單分子蛋白質聚集作用的影響。圖9-16描述了這種特殊蛋白質從30 ug/mL到1 mg/mL范圍內得到的濃度相關性。如圖所示，該蛋白質在低濃度作為單一分子而在濃度大于700 ug/mL時聚集為六聚體。該結果與由gluteraldehyde高度交聯(lián)技術所得結果完全相符。9.4.5 低分子量的測定DAWN HELEOS或mini DAWN TREOS的固定光電二極管檢測器可以捕捉到很微弱的光散射信號，使得分子量

49、的測定成為可能。使用DAWN 系列標準配制的任何一款激光器，都可以輕易地測量分子量低于2000D的聚合物，并具有相當?shù)臏蚀_性。 由于DAWN HELEOS 或mini DAWN TREOS具有三個以上的多角度同時捕捉散射信號的能力，即使極微弱的信號，如只比背景值略高的低分子量樣品所散射出的信號也可以從不同的角度去捕捉，累計在一起就可以計算出相當準確的結果。這是單角度或者兩角度檢測器所無法做到的。圖9.17 低分子量樣品與洗脫體積圖圖9.18 低分子量樣品分子量圖圖9-17為分子量分別為580、1400及2000 D 的聚苯乙烯樣品分子量對洗脫體積的對應圖。樣品量濃度分別為7.1 mg/mL，2

50、.9 mg/mL及2.2 mg/mL。經(jīng)ASTRA GPC 軟件分析得出如表9-8的平均分子量。圖9.18為分子量分布圖。表9-.8 樣品平均分子量樣品Sample Stated MwLow Scattering MwA580512±17B14001371±29C20002012±40一般傳統(tǒng)光散射儀給人們的印象是不易測得分子量較低的樣品，甚至低于10 KD就比較困難。而采用最新的多角度激光光散射儀可輕易且準確的測量幾百D的樣品。9.5 實 驗9.5.1 實驗一 玉米淀粉分子質量及其構象的測定1、實驗目的 （1）了解凝膠滲透色譜-多角度激光光散射系統(tǒng)的基本原理；

51、（2）了解凝膠滲透色譜-多角度激光光散射系統(tǒng)的基本構造； （3）通過對不同直鏈/支鏈比的玉米淀粉樣品分子質量及其構象的測試，了解實驗基本操作步驟，熟悉Astra分析軟件，熟悉儀器特點，掌握GPC-多角度激光光散射系統(tǒng)測定高分子的分子量、構象及均方根旋轉半徑的方法。2、實驗儀器與試劑（1）實驗儀器GPC-MALLS（配置Wyatt-DAWN HELEOS十八角度激光光散射儀），（生產(chǎn)廠家分別為：美國 Waters 公司和美國懷雅特公司。（2）實驗試劑蠟質、普通玉米淀粉，生產(chǎn)廠家分別為上海大浩淀粉有限公司、山東華義玉米科技有限公司；高直鏈玉米淀粉(直鏈/支鏈比為1:1、4:1)，山東華農(nóng)特種玉米有限公司。DMSO（色譜純），國藥集團化學試劑有限公司；溴化鋰（分析純），國藥集團化學試劑有限公司。3、實驗方法與條件11（1） 樣品預處理稱取一定量的蠟質、普通玉米淀粉和高直鏈玉米淀粉（直鏈/支鏈比為1:1、4:1）等4種淀粉，用添加LiBr（50 mmol/L）的DMSO溶液分散，水浴5 h后使樣品充分溶解。樣品的質量濃度為0.5 mg/mL。將充分溶解的樣品過5 m膜（Millipore Co.，USA）后轉移至樣品瓶中。（2） GPC實驗條件色譜柱：Styragel HMW 7 DMF，7.8mm× 300