甲殼動物酚氧化酶原激活系統(tǒng)

1、甲殼動物酚氧化酶原激活系統(tǒng)1 概述甲殼動物缺乏后天獲得的特異性免疫功能，但是它們有比較完善的非特異性免疫系統(tǒng)，能夠迅速識別和有效清除入侵的微生物。非特異性免疫系統(tǒng)是一種比較原始的免疫系統(tǒng)，它存在于所有多細胞生物體，是免疫防御的第一線，分為細胞免疫和體液免疫。甲殼動物的細胞免疫包括吞噬作用、包圍化及結(jié)節(jié)的形成；體液免疫包括酚氧化酶原激活系統(tǒng)(prophenoloxidase activating system, proPO系統(tǒng))、各種凝集素及抗菌肽等。proPO系統(tǒng)是一種類似于脊椎動物補體系統(tǒng)的酶級聯(lián)系統(tǒng)，在甲殼動物的非特異性免疫系統(tǒng)中起著非常重要的作用。它由酚氧化酶(phenoloxidase

2、, PO)、酚氧化酶原(Prophenoloxidase, proPO)、絲氨酸蛋白酶(serine proteinases, SPs)、模式識別蛋白(patten recognition proteins，PRPs)和蛋白酶抑制劑(proteinase inhibitor)等構(gòu)成。該系統(tǒng)中的因子以非活化狀態(tài)存在于血顆粒細胞中，極微量的微生物多糖如 -1,3-葡聚糖(-1,3-glucans, G)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、肽聚糖(peptidoglycan , PGN)等和鈣離子、胰蛋白、SDS可激活該系統(tǒng)，使proPO 變成PO，并產(chǎn)生一系列有生理活性的物

3、質(zhì)，通過包囊與黑化作用抑制和殺死病原體，達到免疫效果。另外其在表皮硬化和傷口愈合中也發(fā)揮著重要的作用。2 proPO激活系統(tǒng)相關(guān)因子2.1 模式識別蛋白(patten recognition proteins，PRPs)無脊椎動物行使非特異性免疫反應(yīng)首先是通過體內(nèi)特定蛋白對病原微生物表面的病原相關(guān)分子模式(pathogen- associated molecular patterns , RAMPs)，包括革蘭氏陰性菌的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、革蘭氏陽性菌的肽聚糖(peptidoglycan , PGN)及真菌的-1,3-葡聚糖(-1,3-glucans, G

4、)進行識別，這種特定蛋白就稱為模式識別蛋白(patten recognition proteins，PRPs)。PRPs包括肽聚糖識別蛋白(the peptidoglycan-recognition proteins, PGRPs)、革蘭氏陽性菌結(jié)合蛋白(Gram-negative-binding proteins, GNBPs)、-葡聚糖結(jié)合蛋白(-glucan-binding proteins, GBPs)、脂多糖和-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白(LPS and -1,3-glucan-binding proteins, LGBPs)、C型凝集素(C-type lectins)、Toll樣受體(

5、Toll-like receptors)。Toll樣受體雖然在脊椎動物中作為一種模式識別受體發(fā)揮作用,但是在無脊椎動物中這類受體并不與病原體直接接觸,而是作為一種跨膜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子行使功能。通常情況下PRPs在異物入侵前位于血漿或血細胞表面，具有對多糖的親和性。當微生物感染生物體時，PRPs 首先與微生物細胞壁上的多糖結(jié)合，然后通過與血細胞表面特異受體聯(lián)結(jié)促進顆粒細胞擴張，引發(fā)包裹、吞噬、proPO 系統(tǒng)級聯(lián)發(fā)應(yīng)等，實施機體的非特異性免疫反應(yīng)。2.1.1 -葡聚糖結(jié)合蛋白(-glucan-binding proteins, GBPs)1992 年，Duvic B等從淡水螯蝦(Pacifasta

6、cus leniusculus)血細胞中純化到GBP 結(jié)合蛋白，并對其部分特性進行研究。GBP在肝胰腺轉(zhuǎn)錄，其編碼的蛋白被釋放到血淋巴中，并與-1,3-葡聚糖結(jié)合，促進proPO系統(tǒng)的激活。從凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)和中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)分離獲得與淡水螯蝦(P.leniusculus)GBP相似的蛋白，其氨基酸序列與GBP相似性約為70%，被命名為GBP-HDL。GBP/GBP-HDL家族包含兩個與微生物葡聚糖酶催化域序列相似性很高的基序，但是它們不具有葡聚糖酶活性，而具有整合蛋白基序作為假定的細胞粘附位點。已從加州對蝦(

7、Penaeus californiensis)、細角濱對蝦(Litopenaeus stylirostris)、凡納濱對蝦(L.vannamei)和中國明對蝦(F.chinensis)分離并克隆了GBP/GBP-HDL家族基因。凡納濱對蝦(L.vannamei) GBP-HDL在肝胰腺、肌肉、游泳足和鰓中表達，在血細胞中不表達；中國明對蝦(F.chinensis) GBP-HDL在腸、肝胰腺、肌肉和鰓和血細胞中均有表達，且在感染白斑綜合癥病毒后其表達情況發(fā)生改變。盡管對蝦GBP-HDL mRNA在多種組織中均有轉(zhuǎn)錄，但GBP-HDL蛋白僅存在于血淋巴中。在-1,3-葡聚糖存在的下，分離純化的G

8、BP能夠激活加州對蝦(P.californiensis)酚氧化酶活性，因此GBP-HDL可能是對蝦proPO激活路徑中識別-1,3-葡聚糖的一種模式識別蛋白。2.1.2 脂多糖和-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白(LPS and -1,3-glucan-binding proteins, LGBPs)LGBPs最初從淡水螯蝦(P.leniusculus)分離獲得，與昆蟲GNBPs具有較高的同源性，LGBPs與LPS或-1,3-葡聚糖的結(jié)合能夠激活proPO系統(tǒng)。目前已克隆獲得淡水螯蝦(P.leniusculus)、凡納濱對蝦(L.vannamei)、中國明對蝦(F.chinensis)、日本囊對蝦(Ma

9、rsupenaeus japonicus)和斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon) LGBPs基因。大多數(shù)LGBP成熟蛋白的平均分子量為39.840.2kDa，含有一個由多聚糖結(jié)合基序、葡聚糖酶基序、-葡聚糖識別基序以及兩個精氨酸-天冬氨酸-甘氨酸基序。LGBP mRNA主要在血細胞中表達，在感染白斑綜合癥病毒或革蘭氏陰性菌及其脂多糖早期中期，LGBP mRNA表達水平上調(diào)，表明LGBP是一種與免疫應(yīng)答有關(guān)的基因。2.1.3 C型凝集素(C-type lectins)C型凝集素是糖類結(jié)合蛋白，在脊椎動物和無脊椎動物的生物過程中具有重要作用。Changlin Chen首次在蟑螂報道了凝集素與

10、proPO系統(tǒng)的聯(lián)系，分離純化的血清凝集素能夠激活蟑螂血淋巴的proPO系統(tǒng)，并能增強海帶多糖對proPO系統(tǒng)的激活。在煙草天蛾發(fā)現(xiàn)了兩種C型凝集素，分別命名為IML-1和IML-2，被認為是昆蟲血淋巴proPO系統(tǒng)激活所需要的模式識別蛋白。近期，在淡水螯蝦(P.leniusculus)證明了C型凝集素與proPO系統(tǒng)激活之間的聯(lián)系?？耸显r(Procambarus clarkii)C型凝集素PcLec2是參與proPO系統(tǒng)激活的一種模式識別蛋白，同時，淡水螯蝦(P.leniusculus)C型凝集素甘露糖結(jié)合凝集素(mannose-binding lectin, Pl- MBL)在顆粒細胞

11、中合成，在受到感染后通過胞吐作用排出，具有調(diào)節(jié)proPO系統(tǒng)的作用。已從對蝦中鑒定了一些C型凝集素并對其生化特征予以描述，但有關(guān)其在對蝦proPO系統(tǒng)激活中的潛在作用卻知之甚少。近期有研究表明，凡納濱對蝦(L.vannamei)C型凝集素能增強血淋巴中酚氧化酶的活性。然而，對蝦proPO系統(tǒng)激活的分子機制還有待進一步闡明。2.2絲氨酸蛋白酶(serine proteinases, SPs)絲氨酸蛋白酶(serine proteinases, SPs)是一類以絲氨酸為活性中心的蛋白水解酶，不僅參與機體消化、胚胎發(fā)育、組織重建、細胞分化及血管形成等過程，而且在抵御病原體入侵的過程中起著非常重要的作

12、用。參與免疫反應(yīng)的SPs 通常以酶原的形式合成，儲存在膜泡內(nèi)或顆粒中，然后被轉(zhuǎn)運或釋放到細胞外，通過與特異的蛋白酶結(jié)合，在其活性位點水解斷裂，使之活化，形成級聯(lián)反應(yīng)，并快速啟動相應(yīng)的免疫防御系統(tǒng)，抵御病原體的感染。絲氨酸蛋白酶的活性部位都含有組氨酸、天冬氨酸和絲氨酸，形成催化三聯(lián)體。目前，已在昆蟲和甲殼動物中發(fā)現(xiàn)了幾種參與proPO系統(tǒng)激活的SPs，它們都屬于含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)域的絲氨酸蛋白酶 (Clip-domain serine proteinase , Clip-SPs)。 Clip-SPs通常以酶原的形式合成，其N端具有12個Clip結(jié)構(gòu)域，C端起催化作用的SP結(jié)構(gòu)域。Clip結(jié)構(gòu)域通常由3

13、755個氨基酸殘基組成，并通過3 個嚴格保守的二硫鍵相互連接，形成緊湊結(jié)構(gòu)，進而通過2392 個氨基酸殘基與SP 結(jié)構(gòu)域連接。Clip-SPs分為具催化活性的SPs和無催化活性的SPs絲氨酸蛋白酶同源物(Clip-SP homologs, Clip-SPHs)，二者的氨基酸序列相似，但Clip-SPHs由于一個或多個催化殘基的缺失或突變導(dǎo)致其明顯缺乏酰胺酶活力(如：Clip-SPHs催化三聯(lián)體中的絲氨酸被甘氨酸取代)，目前已有文獻證實，SPHs在節(jié)肢動物中參與酚氧化酶原系統(tǒng)的激活和抗微生物應(yīng)答。Rattanachai 等(2005)從日本囊對蝦中克隆到了一個SPHs 基因, 發(fā)現(xiàn)基因的表達量在

14、投喂含有肽聚糖的餌料后有顯著增加；Jitvaropas等(2009)從斑節(jié)對蝦的血淋巴細胞中克隆得到了一個SPHs 基因, 經(jīng)過分子克隆和體外表達獲得的蛋白具有細胞粘附、抑菌等生物學(xué)活性；楊燚等(2012)從中國明對蝦血細胞中克隆獲得了一個SPHs基因, 細菌和對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)刺激后該基因在血細胞中的表達會顯著上調(diào)。已證明，當沒有SPHs時，proPO能夠被PAP在正確的位置裂解，但是卻不能顯現(xiàn)PO的活性。因此有人推斷，SPs和SPHs的發(fā)夾結(jié)構(gòu)域似乎對proPO的活化作用很關(guān)鍵，SPHs很可能改變了PO的構(gòu)象而導(dǎo)致其活化，但目前SPHs與PO之間的直接反應(yīng)關(guān)系還沒有被確認。2.

15、3酚氧化酶(phenoloxidase, PO)和酚氧化酶原(Prophenoloxidase, proPO)酚氧化酶(phenoloxidase, PO)又稱為酪氨酸酶(tyrosinase)，在無脊椎動物和脊椎動物中都有發(fā)現(xiàn)，其活性部位是由2個銅原子(CuA和CuB)，能夠催化酚類物質(zhì)形成最終的反應(yīng)產(chǎn)物黑色素。無脊椎動物 PO 一般以無活性狀態(tài)的proPO存在，ProPO產(chǎn)生于血淋巴中成熟的血細胞，如顆粒細胞和半顆粒細胞，經(jīng)絲氨酸蛋白酶裂解變成有活性的 PO。1996 年，Sugumaran建議：酪氨酸酶這個名字應(yīng)專門用于哺乳類，而 PO 專門用于無脊椎動物。FujimotoK對它們進行序

16、列分析，結(jié)果顯示它們來源于兩個相對獨立的分支，從序列相似性考慮，酪氨酸酶可能起源于軟體動物的血藍蛋白，PO 可能起源于節(jié)肢動物的血藍蛋白。PO能夠催化單酚羥化成二酚，并把二酚氧化成醌，醌在非酶促條件下形成最終的反應(yīng)產(chǎn)物黑色素。這些黑色素協(xié)同具有細胞毒性的醌類中間產(chǎn)物沉積到入侵的病原體周圍，起到隔離殺死病原體的作用，即所謂的黑化包被反應(yīng)。在較高等的無脊椎動物如節(jié)肢動物中，PO 具有多種功能，它不僅參與黑色素形成、角質(zhì)的硬化和傷口愈合，而且在宿主的防御反應(yīng)中還作為非自身識別系統(tǒng)發(fā)揮功能，在識別異物、釋放調(diào)理素(opsonin)、促進血細胞的吞噬和包囊反應(yīng)以及促進顆粒細胞和半顆粒細胞釋放顆粒、產(chǎn)生多

17、種介導(dǎo)凝集因子及抗菌肽等免疫功能方面發(fā)揮著重要的作用。PO活力的強弱與機體的免疫力直接相關(guān)，可作為衡量甲殼動物免疫功能大小的指標之一。目前，許多甲殼類proPO 的cDNA 序列已被克隆并測序，如羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)、鋸緣青蟹(Scylla serrata)、短溝對蝦(Penaeus semisulcatus)、斑節(jié)對蝦(P.monodon)、凡納濱對蝦(L.vannamei)、日本囊對蝦(M.japonicus)及中國明對蝦(F.chinensis)等。甲殼動物proPO 的cDNA序列長約2500bp，如鋸緣青蟹(S.serrata)proPO 的

18、cDNA 序列為2663 bp，南美白對蝦的為2471 bp，序列中含有高度保守的兩個銅結(jié)合位點，即5 個糖基化位點和6 個組氨酸殘基，整個序列沒有信號肽。ProPO 經(jīng)絲氨酸蛋白酶裂解轉(zhuǎn)變?yōu)榫呋钚缘腜O，一般會有一段約50 個氨基酸的肽鏈從proPO 上切除。而這個酶切位點及其周圍的氨基酸序列在同一物種中也是非常保守的，如淡水螯蝦(P. Leniusculus)的酶切位點在Arg176-Thr177，斑節(jié)對蝦(P.monodon)的酶切位點在Arg44- Val45。2.4血藍蛋白(hemocyanin)甲殼動物血藍蛋白是一類含有銅離子的寡聚蛋白，起著運送氧的重要功能。但是，最近的研究發(fā)現(xiàn)，

19、在一定條件下血藍蛋白具有PO的活性。雖然體內(nèi)血藍蛋白是否具有PO活性尚無證據(jù)，但血藍蛋白體在外添加SDS、胰蛋白酶、-1,3-葡聚糖和血細胞粗提物的混合物時能顯示PO活性。血藍蛋白和PO 雖然在結(jié)構(gòu)上有相似點，如兩者都是含雙銅的蛋白，這兩個銅位點就是它們的活性部位，且都分別與三個組氨酸殘基連在一起。但是，兩者卻有著許多不同點，如它們的生成器官是不同的，血藍蛋白在肝胰腺中生成，而proPO 在成熟血細胞中生成。另外，將螯蝦的PO 與血藍蛋白進行理化特性比較發(fā)現(xiàn)，血藍蛋白的表面帶有較多的負電并較PO 的疏水性弱，血藍蛋白有信號肽，而PO 沒有信號肽。對血藍蛋白結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，當血藍蛋白執(zhí)行攜氧功能

20、時，由于一些重要的氨基酸殘基的阻擋，其活性部位只允許氧分子進入，酚類底物不能進入。對螯蝦、黃道蟹(Cancer magister)等的研究表明，在血藍蛋白的N末端發(fā)生蛋白質(zhì)水解或?qū)被釟埢龌钚圆课皇蛊浣Y(jié)構(gòu)改變或部分展開后，血藍蛋白的銅位點能與更大的底物，如酚類物質(zhì)結(jié)合，從而使之具有PO功能，完成黑化。2.5 其他proPO系統(tǒng)相關(guān)因子ProPO 通過粒細胞內(nèi)小泡胞吐的形式排到血漿中，同時被胞吐外排的還有過氧素(peroxinectin)，Masquerade-like 蛋白，抗菌肽，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(transglutaminase, TGase)等，因而ProPO 系統(tǒng)的激活也影響了其它的

21、免疫反應(yīng)，而且這些免疫反應(yīng)之間又是彼此協(xié)調(diào)作用的。2.51 過氧素研究發(fā)現(xiàn)，過氧素是一分子量為76KDa 的蛋白，它以非活化狀態(tài)存在于成熟顆粒細胞與半顆粒細胞中，伴隨著酚氧化酶原激活系統(tǒng)的激活而活化。過氧素是甲殼動物中發(fā)現(xiàn)的第一個黏附分子，它調(diào)節(jié)細胞間的連接，通過將外源物連到粒細胞表面特殊接收器上，使外源物成為更大的異物，包囊由此產(chǎn)生并被黑化。過氧素還具有過氧化物酶的功能和調(diào)理素的功能，同時它也是脫顆粒因子，能引起細胞的胞吐，經(jīng)過這樣的循環(huán)，proPO 被越來越多地從血細胞中排出。2.52 Masquerade-like 蛋白Masquerade-like 蛋白是一種與絲氨酸蛋白酶相似的異二聚

22、體蛋白，由分子量134KDa和129KDa兩個單位組成，它不僅具有和酵母/細菌結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，還具有和血細胞結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，它隨著proPO系統(tǒng)的激活自身發(fā)生水解。雖然尚不清楚其是否直接參與了proPO系統(tǒng)的激活，但它卻具有調(diào)理素（opsonin）、細胞粘連蛋白（cell adhesion protein）和模式識別蛋白的作用。2.5.3 抗菌肽抗菌肽是一種具有抗菌活性的生物短肽，廣泛存在于生物界中，在機體抵抗病原的入侵方面起著重要的作用，是缺乏特異性免疫功能生物的重要防御成分?？咕慕?jīng)血細胞產(chǎn)生,并儲存在血細胞中，在病原刺激下釋放到血淋巴。酚氧化酶原激活系統(tǒng)中的SPs即能產(chǎn)生抗菌肽。在螯蝦中，從

23、SPs前體的發(fā)夾區(qū)提取的重組肽(recombinant peptide)對革蘭氏陽性菌有活性，它在SPs前體水解時被切下，其抗菌活性可能是伴隨proPO活化而產(chǎn)生的。血藍蛋白也能產(chǎn)生抗菌肽。血藍蛋白經(jīng)限制性蛋白水解產(chǎn)生蝦紅素1(astacidin1)，這個過程在proPO與-1,3-葡聚糖、LPS等接觸時被觸發(fā)，并由一種目前尚不清楚的半胱氨酸蛋白酶完成此酶切過程。3 酚氧化酶原激活系統(tǒng)的調(diào)節(jié)因為proPO系統(tǒng)所產(chǎn)生的醌和黑色素本身具有毒性，如果不加以限制，對甲殼動物自身來說也是非常不利的，因而對酚氧化酶原激活系統(tǒng)的活性調(diào)節(jié)機制也是人們研究的重要內(nèi)容。其中主要的調(diào)節(jié)方式為對proPO 激活過程的調(diào)節(jié)和SPs 活性的調(diào)節(jié)。proPO 激活過程的調(diào)節(jié)方式在于SPs 是以非活性酶原的形式存在，只有在出現(xiàn)引發(fā)物的情況下，它才