4TA連接,感受態(tài)細(xì)胞制備,轉(zhuǎn)化及篩選

1、 1. pcr產(chǎn)物與產(chǎn)物與t載體的連接載體的連接 2.感受態(tài)細(xì)胞的制備，感受態(tài)細(xì)胞的制備， 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)一、pcr產(chǎn)物與產(chǎn)物與t載體的連接載體的連接t vector 1 l10ligation buffer 1 lpcr回收產(chǎn)物回收產(chǎn)物 7 lt4 dna ligase 1 l輕彈管底混合，離心機(jī)甩一下，置輕彈管底混合，離心機(jī)甩一下，置2525o oc c水浴水浴1212h h。連接產(chǎn)物可以直接用于轉(zhuǎn)化，也可以置連接產(chǎn)物可以直接用于轉(zhuǎn)化，也可以置-20-20o oc c保存?zhèn)溆?。保存?zhèn)溆?。（低溫連接效果比室溫好）（低溫連接效果比室溫好）。1. 連接反應(yīng)連接反應(yīng)2.

2、ta克隆原理克隆原理 tagdna 聚合酶的一個(gè)功能：聚合酶的一個(gè)功能： 使使pcr產(chǎn)物的產(chǎn)物的3端突出一個(gè)端突出一個(gè)a。3 aa 3553 tt 355 商業(yè)設(shè)計(jì)的商業(yè)設(shè)計(jì)的t載體：在載體：在3端多出一個(gè)端多出一個(gè)t。 兩者的粘性末端可以互補(bǔ)配對(duì)。兩者的粘性末端可以互補(bǔ)配對(duì)。應(yīng)用時(shí)避免反復(fù)凍融，防止應(yīng)用時(shí)避免反復(fù)凍融，防止t的斷裂丟失。如果與的斷裂丟失。如果與t載體連接載體連接后主要以自身環(huán)化為主，要考慮后主要以自身環(huán)化為主，要考慮t可能已經(jīng)丟失。可能已經(jīng)丟失。其他說(shuō)明：其他說(shuō)明：1 1） 連接反應(yīng)的連接反應(yīng)的關(guān)鍵關(guān)鍵是目的基因片段與載體的比例，一般是目的基因片段與載體的比例，一般片段與載體

3、比例為片段與載體比例為2:1 2:1 或或3:13:1（摩爾比），根據(jù)片段大小決（摩爾比），根據(jù)片段大小決定比例。定比例。2 2）平端連接）平端連接 平端連接通常需要先將載體的平端連接通常需要先將載體的5 5 端磷酸去掉，然后再進(jìn)端磷酸去掉，然后再進(jìn)行連接，這樣可以防止載體的自身環(huán)化。行連接，這樣可以防止載體的自身環(huán)化。 當(dāng)載體的當(dāng)載體的5 5 端磷酸去掉后，片段與載體的連接就會(huì)留下端磷酸去掉后，片段與載體的連接就會(huì)留下一個(gè)缺口，連接酶由于載體一個(gè)缺口，連接酶由于載體5 5 端缺乏磷酸而無(wú)法形成磷酸二端缺乏磷酸而無(wú)法形成磷酸二酯鍵，酯鍵， 轉(zhuǎn)化入細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的酶會(huì)將缺乏的磷酸基團(tuán)加上，轉(zhuǎn)化入

4、細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的酶會(huì)將缺乏的磷酸基團(tuán)加上，再形成磷酸二酯鍵。再形成磷酸二酯鍵。 實(shí)驗(yàn)二、感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)二、感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌在低滲培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌在低滲 caclcacl2 2 存存在的情況下，細(xì)菌變得膨脹而易于外源基因的導(dǎo)入。在的情況下，細(xì)菌變得膨脹而易于外源基因的導(dǎo)入。 另外，鈣離子溶液處理的細(xì)胞對(duì)外源另外，鈣離子溶液處理的細(xì)胞對(duì)外源dnadna的攝的攝取能力增強(qiáng)。取能力增強(qiáng)。1. 感受態(tài)細(xì)胞制備原理感受態(tài)細(xì)胞制備原理2.2.注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：1 1）感受態(tài)細(xì)胞的膜已經(jīng)很脆，應(yīng)該超低溫保存。）感受態(tài)細(xì)胞的膜已經(jīng)很脆，應(yīng)該超低溫保存。

5、如果反復(fù)凍融會(huì)使細(xì)胞活力受影響，而且細(xì)胞膜如果反復(fù)凍融會(huì)使細(xì)胞活力受影響，而且細(xì)胞膜的變化可能復(fù)原，由感受態(tài)細(xì)胞狀態(tài)回轉(zhuǎn)到普通細(xì)的變化可能復(fù)原，由感受態(tài)細(xì)胞狀態(tài)回轉(zhuǎn)到普通細(xì)胞狀態(tài)，失去接受外源胞狀態(tài)，失去接受外源dnadna的能力。的能力。2 2）無(wú)菌操作。）無(wú)菌操作。 在火焰附近操作，火焰附近是無(wú)菌區(qū)。在火焰附近操作，火焰附近是無(wú)菌區(qū)。 各種器具均需消毒各種器具均需消毒。無(wú)菌操作的注意事項(xiàng)無(wú)菌操作的注意事項(xiàng) 槍頭、槍頭、ep管、試管、平皿等，各種試劑都是經(jīng)過(guò)管、試管、平皿等，各種試劑都是經(jīng)過(guò)高壓滅高壓滅菌菌后在超凈臺(tái)中專用的，但加樣器需要自帶。后在超凈臺(tái)中專用的，但加樣器需要自帶。取飯盒中的

6、槍頭、取飯盒中的槍頭、ep管時(shí)，都要用在酒精燈上燒灼后的管時(shí)，都要用在酒精燈上燒灼后的鑷子夾取鑷子夾取。燒瓶、試管、玻璃棒等玻璃器具，使用前和蓋蓋兒前要燒瓶、試管、玻璃棒等玻璃器具，使用前和蓋蓋兒前要在在酒精燈上燒灼一下瓶口酒精燈上燒灼一下瓶口。塑料制品，如槍頭和塑料制品，如槍頭和ep管不能用酒精燈燒灼。管不能用酒精燈燒灼。手臂盡量手臂盡量不要在敞開(kāi)的容器上方移動(dòng)不要在敞開(kāi)的容器上方移動(dòng)，以免落入雜菌。，以免落入雜菌。超凈臺(tái)事先要打開(kāi)超凈臺(tái)事先要打開(kāi)紫外燈照射至少紫外燈照射至少20 min進(jìn)行消毒，使進(jìn)行消毒，使用時(shí)要打開(kāi)風(fēng)機(jī)，。用時(shí)要打開(kāi)風(fēng)機(jī)，。操作前要用操作前要用酒精擦拭手臂或帶手套酒精擦

7、拭手臂或帶手套。無(wú)菌超凈工作臺(tái)無(wú)菌超凈工作臺(tái)1 1） 將大腸桿菌在將大腸桿菌在lblb瓊脂培養(yǎng)基上劃線，瓊脂培養(yǎng)基上劃線，3737o oc c12-12-1616小時(shí)。小時(shí)。2 2） 次日從瓊脂平板上取一單菌落于次日從瓊脂平板上取一單菌落于2 2ml lbml lb培養(yǎng)培養(yǎng)基中，基中，3737o oc c，225rpm225rpm速度震蕩培養(yǎng)速度震蕩培養(yǎng)12-1612-16小時(shí)。小時(shí)。3 3） 取取1 1mlml上述培養(yǎng)物接種于上述培養(yǎng)物接種于100100ml lbml lb培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中，3737o oc c， 225rpm 225rpm的速度震蕩培養(yǎng)直至的速度震蕩培養(yǎng)直至odod值為值

8、為0.50.5左右左右( (約約3 3小時(shí)小時(shí)) )。 （上述（上述1 13 3步驟已經(jīng)由實(shí)驗(yàn)室完成）步驟已經(jīng)由實(shí)驗(yàn)室完成）水浴搖床水浴搖床 3. 感受態(tài)細(xì)胞的制備過(guò)程感受態(tài)細(xì)胞的制備過(guò)程5）棄上清，除凈剩余液體，然后加入）棄上清，除凈剩余液體，然后加入100ul 冰冷的冰冷的 100mmol/l cacl2 致敏液懸浮細(xì)胞，冰浴致敏液懸浮細(xì)胞，冰浴5分鐘。分鐘。6）6000rpm，離心離心5分鐘，回收細(xì)胞，棄上清，加分鐘，回收細(xì)胞，棄上清，加 入入100ul冰冷冰冷100 mmol/l cacl2溶液，懸浮細(xì)胞。溶液，懸浮細(xì)胞。7）4oc可保存可保存1-2周；長(zhǎng)期保存，周；長(zhǎng)期保存， 可加甘

9、油至終濃可加甘油至終濃 度為度為15%，置，置-70oc備用。備用。注意：（無(wú)菌操作）注意：（無(wú)菌操作）4） 取取1ml 菌液冰浴菌液冰浴5min，然后然后6000rpm，離心離心5 min ，收集菌體。，收集菌體。1 1）將）將200200 l l感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞置冰上融化置冰上融化，然后加入，然后加入3 3 l l dmsodmso, , 混合后，加入混合后，加入1010 l l連接反應(yīng)液連接反應(yīng)液( (含重組質(zhì)粒含重組質(zhì)粒), ), 溫和混勻，置冰上溫和混勻，置冰上1010分鐘分鐘。 ( (目的：防止細(xì)胞被脹破。目的：防止細(xì)胞被脹破。) ) 2）42oc，45秒，秒，然后然后迅速放回冰中迅速放回冰中1-2分鐘。分鐘。1. 轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)步驟轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)步驟3）加入）加入1 ml lb培養(yǎng)液，培養(yǎng)液， 37oc，225rpm搖蕩培搖蕩培養(yǎng)養(yǎng)30min。連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 4） 6,000rpm，離心離心10秒鐘，倒掉上清，用剩余的約秒鐘，倒掉上清，用剩余的約 200 l lb培養(yǎng)液重懸菌體。培養(yǎng)液重懸菌體。5）將殘存菌液輕輕混勻，）將殘存菌液輕輕混勻， 鋪于含有氨基芐青霉素的鋪于含有氨基芐青霉素的 lb瓊脂培養(yǎng)板上涂勻，室溫放置瓊脂培養(yǎng)板上涂勻，室溫