DNA重組技術(shù)基本工具

1、第1節(jié) DNA重組技術(shù)的基本工具【本節(jié)重難點】重點：DNA重組技術(shù)所需的三種基本工具的作用難點：基因工程載體所需要具備的條件【知識精講】教材梳理知識點一 基因工程的概念：基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴格的設計，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫做DNA重組技術(shù)。注意：對本概念應從以下幾個方面理解：操作環(huán)境生物體外操作對象基因操作水平DNA分子水平基本過程剪切拼接導入表達結(jié)果人類需要的基因產(chǎn)物知識點二 基因工程的基本工具1.限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術(shù)刀”（1）

2、限制性內(nèi)切酶的來源：主要是從原核生物中分離純化來的。（2）限制性內(nèi)切酶的功能：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并能將每一條鏈上特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵切開。（3）限制性內(nèi)切酶的切割方式：在中心軸線兩側(cè)將DNA切開，切口是黏性末端。沿著中心軸線切開DNA，切口是平末端。注意：比較有關(guān)的DNA酶（1）DNA水解酶：能夠?qū)NA水解成四種脫氧核苷酸，徹底水解成膦酸、脫氧核糖和含氮堿基 （2）DNA解旋酶：能夠?qū)NA或DNA的某一段解成兩條長鏈，作用的部位是堿基和堿基之間的氫鍵。注意：使DNA解成兩條長鏈的方法除用解旋酶以外，在適當?shù)母邷兀ㄈ?4）、重金屬鹽的作用下，也可使

3、DNA解旋。 （3）DNA聚合酶：能將單個的核苷酸通過磷酸二酯鍵連接成DNA長鏈。 （4）DNA連接酶：是通過磷酸二酯鍵連接雙鏈DNA的缺口。注意比較DNA聚合酶和DNA連接酶的異同點。2.DNA連接酶“分子縫合針”（1）DNA連接酶的分類：E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。（2）作用及作用部位：E.coliDNA連接酶作用于黏性末端被切開的磷酸二酯鍵，T4DNA連接酶作用于黏性末端和平末端被切開的磷酸二酯鍵。3.基因進入受體細胞的載體“分子運輸車”（1）分子運載車的分類：質(zhì)粒：常存在于原核細胞和酵母菌中，是一種分子質(zhì)量較小的環(huán)狀的裸露的DNA分子，獨立于擬核之外。病毒：常用的病毒有

4、噬菌體、動植物病毒等。（2）運載體使用的目的：是用它做運載工具，將目的基因轉(zhuǎn)運到宿主細胞中去。是利用它在受體細胞內(nèi)對目的基因進行大量復制。（3）作為運載體必須具備的條件：在宿主細胞中保存下來并大量復制 有多個限制性內(nèi)切酶切點 有一定的標志基因，便于篩選。思維探究：知識點3、4、5主要是介紹DNA重組技術(shù)的三種基本工具及其作用。限制酶“分子手術(shù)刀”，主要是介紹限制酶的作用，切割后產(chǎn)生的結(jié)果。在這部分內(nèi)容學習時，應關(guān)心的問題之一是：限制酶從哪里尋找？我們可以聯(lián)想從前學過的內(nèi)容噬菌體侵染細菌的實驗，進而認識細菌等單細胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么這類原核生物之所以長期進化而不絕滅，有何保

5、護機制？進而聯(lián)想到可能是有什么酶來切割外源DNA，而使之失效，達到保護自身的目的”。這樣就對“限制酶主要是從原核生物中分離純化出來”的認識提高了一個層次。DNA連接酶DNA片段的“分子縫合針”，在這里同學們很容易想到堿基互補配對或DNA聚合酶，這是很自然的。但只考慮到堿基互補配對原則還是不夠的，我們可以從原有的知識出發(fā)，要想到限制酶切開的DNA中膦酸與脫氧核糖之間的磷酸二酯鍵，這個地方還沒有連接起來，又是怎樣連接的呢？這樣自然而然地想到DNA連接酶?；蜻M入受體細胞的載體“分子運輸車”的學習內(nèi)容，不能僅僅著眼于記住這幾個條件，而應該深入思考每一個條件的內(nèi)涵，通過深思熟慮，才能真正明確為什么要有

6、這些條件才能充當載體。教材拓展拓展點一 限制酶所識別序列的特點限制酶所識別的序列的特點是：呈現(xiàn)堿基互補對稱，無論是奇數(shù)個堿基還是偶數(shù)個堿基，都可以找到一條中心軸線，如圖，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復排列的。如： 以中心線為軸，兩側(cè)堿基互補對稱； 以 為軸，兩側(cè)堿基互補對稱。拓展點二 DNA連接酶連接的是什么部位？DNA連接酶是將一段DNA片段3端的羥基與另一DNA片段5端磷酸基團上的羥基連接起來形成酯鍵，而不是連接互補堿基之間的氫鍵。【典題分類精析】考點一、基因工程的概念例1（2005高考廣東）以下有關(guān)基因工程的敘述，正確的是 （ ）A、基因工程是細胞水平上的生物工程 B、基因

7、工程的產(chǎn)物對人類都是有益的C、基因工程產(chǎn)生的變異屬于人工誘變 D、基因工程育種的優(yōu)點之一是目的性強分析：本題考查的知識點是基因工程的概念。解答本題的關(guān)鍵是理解基因工程的概念?；蚬こ淌窃谏矬w外，通過對DNA分子進行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進行改造(目的性強)和重新組合(基因重組)，然后導入受體細胞內(nèi)進行無性繁殖，使重組基因在受體細胞內(nèi)表達，產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物.但并不是所有的基因產(chǎn)物對人類都有益的。所以選D。 答案：D 點評：正確理解基因工程的概念是解題的關(guān)鍵。 考點二、基因工程的基本工具例2.下列關(guān)于限制酶的說法不正確的是A限制酶廣泛存在于各種生物中，微生物中很少分布B一

8、種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列C不同的限制酶切割DNA的切點不同D限制酶的作用是用來提取目的基因分析：此題主要考察限制酶的有關(guān)知識。解答本題的關(guān)鍵是理解限制酶的來源和限制酶的特點。限制酶主要是從原核生物中分離出來的，并不是廣泛存在于各種生物中；一種限制酶能識別雙鏈DNA的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開；DNA分子經(jīng)限制酶切割形成黏性末端和平末端兩種。答案：B點評：考察有關(guān)限制酶的題目，主要是考察限制酶的特點，這一點一定要牢記。例3在基因工程中用來完成基因的剪接的工具是 A限制酶和連接酶 B限制酶和水解酶C限制酶和運載體 D連接酶和運載體分析：

9、本題考查限制酶和連接酶的有關(guān)知識。解答本題的關(guān)鍵是“剪接”二字，是既剪又接。限制性內(nèi)切酶(即限制酶)是剪切基因的“剪刀”，DNA連接酶是將DNA末端之間的縫隙“縫合”起來的“基因的針線”。所以，剪接工具是限制酶和連接酶。答案：A點評：本題注意審題，剪接是既剪又接，需要限制酶和連接酶。例4有關(guān)基因工程的敘述正確的是A限制酶只在獲取目的基因時才用 B重組質(zhì)粒的形成是在細胞內(nèi)完成的C質(zhì)粒都可以作為運載體D蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序可以為合成目的基因提供線索分析：本題綜合考察了基因工程中所用到的工具。在基因工程中，不僅要用限制酶切割目的基因，還要用同一種限制酶在質(zhì)粒上切割出一個切口，使目的基因與質(zhì)粒切口的

10、黏性末端能進行堿基互補配對，所以A錯；重組質(zhì)粒是在細胞外進行的，所以B錯；并不是所有的質(zhì)粒都可作運載體，在科學研究中，人們通常只是用大腸桿菌的質(zhì)粒(其上有抗藥基因)作運載體，所以C錯；在人工合成目的基因的方法中，有一種方法是根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出相應的mRNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，最后通過化學方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。所以D項正確。答案：D點評：解答本題時要綜合考慮基因工程的基本工具的特點、條件、適用范圍。例5下列哪項通常不被用作基因工程的運載體A細菌質(zhì)粒 B噬菌體C動植物病毒 D細菌核區(qū)的DNA分析：本題考察基因工程中的工具運載

11、體。解答本題的關(guān)鍵是記住、理解運載體必須具備的條件和課本上講的常用運載體。作為運載體必須具備的條件：在宿主細胞中保存下來并大量復制 有多個限制性內(nèi)切酶切點 有一定的標志基因，便于篩選。記住常用的運載體有：質(zhì)粒、噬菌體、動植物病毒等。細菌的核區(qū)由一個大型的環(huán)狀DNA分子反復折疊纏繞而成，控制著細菌的主要性狀，所以一般不被用作基因工程的運載體。答案：D點評：牢記作為運載體必須具備的3個條件是解答本題的關(guān)鍵。 考點三、限制酶所識別序列的特點例62005天津（1）限制性內(nèi)切酶的識別序列和切點是GGATCC，限制性內(nèi)切酶的識別序列和切點是GATC。在質(zhì)粒上有酶的一個切點，在目的基因的兩側(cè)各有1個酶的切點

12、。請畫出質(zhì)粒被限制酶切割后形成的黏性未端。_請畫出目的基因兩側(cè)被限制酶切割后形成的黏性未端。_在DNA連接酶的作用下，上述兩種不同限制酶切割后形成的黏性未端能否連接起來？為什么？_分析：本題主要考察黏性末端的知識。解答本題的關(guān)鍵是理解限制酶的特點。在切割目的基因和運載體時，一定要使用同一種限制性內(nèi)切酶，這樣，切出的切口才一樣，才能進行堿基互補配對連接起來。兩個黏性末端只要一樣就可以進行堿基互補配對，再通過DNA連接酶連接起來。答案：（1） 可以連接。因為由兩種限制性內(nèi)切酶切割后所形成的黏性末端是相同的（或“是可以互補的”）。點評：限制酶所識別的是特定的堿基序列，并在特定部位進行切割，

13、限制酶不同，所識別的堿基序列不同，黏性末端不同。但不同的粘性末端有時是可以進行拼接的，如：黏性末端。兩者不要混淆。 【針對性練習】1實施基因工程第一步的一種方法是把所需的基因從供體細胞內(nèi)分離出來，這要利用限制性內(nèi)切酶。一種限制性內(nèi)切酶能識別DNA子中的GAATTC順序，切點在G和A之間，這是應用了酶的A酶的高效性 B酶的專一性 C酶的多樣性 D酶的催化活性受外界條件影響2以下說法正確的是 A所有的限制酶只能識別同一種特定的核苷酸序列B質(zhì)粒是基因工程中惟一的運載體C運載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接D基因治療主要是對有缺陷的細胞進行修復3.下列黏性末端屬于同一種限

14、制性內(nèi)切酶切割的是（ ）ABCD4.下列四條DNA分子，彼此間具有粘性末端的一組是 A B C D5依右圖有關(guān)基因工程的工具酶功能的敘述，不正確的是 A切斷a處的酶為限制核酸性內(nèi)切酶 B連接a處的酶為DNA連接酶C切斷b處的酶為解旋酶 D切斷b處的為限制性內(nèi)切酶6不屬于質(zhì)粒被選為基因運載體的理由是 A能復制 B有多個限制酶切點C具有標記基因 D它是環(huán)狀DNA7.基因工程技術(shù)也稱為DNA重組技術(shù)，其實施必須具備的四個必要條件是A.目的基因 限制性內(nèi)切酶 運載體 體細胞 B.重組DNA RNA聚合酶 限制性內(nèi)切酶 連接酶C.工具酶 目的基因 運載體 受體細胞D.模板DNA 信使RNA 質(zhì)粒 受體細

15、胞8下列關(guān)于各種酶作用的敘述，不正確的是ADNA連接酶能使不同脫氧核苷酸的磷酸與脫氧核糖連接BRNA聚合酶能與基因的特定位點結(jié)合，催化遺傳信息的轉(zhuǎn)錄C一種DNA限制酶能識別多種核苷酸序列，切割出多種目的基因D胰蛋白酶能作用于離體的動物組織，使其分散成單個細胞9.下列關(guān)于限制酶的說法不正確的是A.限制酶廣泛存在于各種生物中，尤其在微生物細胞中分布最多B.不同的限制酶識別不同的核苷酸序列C.限制酶能識別不同的核苷酸序列，體現(xiàn)了酶的專一性D.限制酶的作用只是用來提取目的基因10有關(guān)基因工程的敘述中，不正確的是 A.DNA連接酶將黏性未端的堿基對連接起來 B.限制性內(nèi)切酶可用于目的基因的獲得 C.目的

16、基因須由運載體導入受體細胞 D.人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶11下圖所示限制酶切割基因分子的過程，從圖中可知，該限制酶能識別的堿基序列和切點是ACTTAAG，切點在C和T之間 BCTTAAG，切點在G和A之間CGAATTC，切點在G和A之間 DGAATTC，切點在C和T之間 12.下列關(guān)于質(zhì)粒的敘述，正確的是（）A、質(zhì)粒是廣泛存在于細菌細胞中的一種顆粒狀細胞器B、質(zhì)粒是細菌細胞質(zhì)中能夠自主復制的小型環(huán)狀DNA分子C、質(zhì)粒只有在導入宿主細胞后才能在宿主細胞內(nèi)復制D、細菌質(zhì)粒的復制過程一定是在宿主細胞外獨立進行的13科學家常選用的細菌質(zhì)粒往往帶有一個抗菌素抗性基因，該抗性基因的主要作用是A提高

17、受體細胞在自然環(huán)境中的耐熱性 B有利于檢測目的基因否導入受體細胞C增加質(zhì)粒分子的相對分子質(zhì)量 D便于與外源基因連接14下圖是基因工程主要技術(shù)環(huán)節(jié)的一個基本步驟，這一步需用到的工具是ADNA連接酶和解旋酶 BDNA聚合酶和限制性核酸內(nèi)切酶C限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶 DDNA聚合酶和RNA聚合酶15限制酶是一種核酸切割酶，可辨識并切割DNA分子上特定的核苷酸堿基序列。下圖為四種限制酶BamHI，EcoRI，Hind以及Bgl的辨識序列。箭頭表示每一種限制酶的特定切割部位，其中哪兩種限制酶所切割出來的DNA片段末端可以互補黏合？其正確的末端互補序列為何？ A. BamHI和EcoRI；末端互補

18、序列AATTB. BamHI和Hind；末端互補序列GATCC. EcoRI和Hind；末端互補序列AATTD. BamHI和BglII；末端互補序列GATC16在DNA 測序工作中，需要將某些限制性內(nèi)切核酸酶的限制位點在 DNA上定位，使其成為 DNA 分子中的物理參照點。這項工作叫做“限制酶圖譜的構(gòu)建”。假設有以下一項實驗：用限制酶 Hind，BamH和二者的混合物分別降解一個 4kb（1kb即1千個堿基對）大小的線性DNA 分子，降解產(chǎn)物分別進行凝膠電泳，在電場的作用下，降解產(chǎn)物分開，如下圖所示。據(jù)此分析，這兩種限制性內(nèi)切核酸酶在該DNA 分子上的限制位點數(shù)目是以下哪一組？AHind1個

19、，BamH2 個 BHind2個，BamH3個CHind2個，BamH1 個 DHind和BamH各有2 個17.兩個核酸片段在適宜的條件下，經(jīng)X酶的作用，發(fā)生下述變化，則X酶是A.連接酶 B.RNA聚合酶 C.DNA聚合酶 D.限制酶18基因工程中涉及多種工具酶：（1）限制性內(nèi)切酶是一類能識別特定核苷酸序列并在特定位點切割雙鏈DNA的“基因剪刀”。被限制酶識別的序列往往正反讀順序相同，斷裂的位置交錯，但又是圍繞著一個軸線（對稱軸）對稱排列，如下左圖。PstI和EcoRI都是限制酶。請補全下右圖中的互補鏈，畫出對稱軸以及切割后的產(chǎn)物。 （2）DNA連接酶是基因操作的“針線”，其作用是把基于 能

20、力而粘貼在一起但存在的切口封閉，進而才可能形成有意義的 。（3）逆轉(zhuǎn)錄酶也常被用于基因工程，其存在于 （生物）中，催化以 為模板合成DNA的過程。 19.利用基因工程生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物，經(jīng)歷了三個發(fā)展階段。第一階段，將人的基因轉(zhuǎn)入細菌細胞；第二階段，將人的基因轉(zhuǎn)入小鼠等動物的細胞。前兩個階段都是進行細胞培養(yǎng)，提取藥物。第三階段，將人的基因轉(zhuǎn)入活的動物體，飼養(yǎng)這些動物，從乳汁或尿液中提取藥物。（1）將人的基因轉(zhuǎn)入異種生物的細胞或個體內(nèi)，能夠產(chǎn)生藥物蛋白的原理是基因能控制。（2）人的基因能和異種生物的基因拼接在一起，是因為它們的分子都具有雙螺旋結(jié)構(gòu)，都是由四種_構(gòu)成，基因中堿基配對的規(guī)律都是_。（3）

21、人的基因在異種生物細胞中表達成蛋白質(zhì)時，需要經(jīng)過和翻譯兩個步驟。在翻譯中需要的模板是，原料是氨基酸，直接能源是ATP，搬運工兼裝配工是，將氨基酸的肽鍵連接成蛋白質(zhì)的場所是_，“翻譯”可理解為將由_個“字母”組成的核酸“語言”翻譯成由個“字母”組成的蛋白質(zhì)“語言”，從整體來看在翻譯中充任著“譯員”。（4）利用轉(zhuǎn)基因牛、羊乳汁提取藥物工藝簡單，甚至可直接飲用治病。如果將藥物蛋白基因移到動物如牛、羊的膀胱上皮細胞中，利用轉(zhuǎn)基因牛羊尿液生產(chǎn)提取藥物比乳汁提取藥物的更大優(yōu)越性在于：處于不同發(fā)育時期的動物都可生產(chǎn)藥物。20.在某一特定的植物基因工程中，用土壤農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒作為運載體。把目的基因重組入T

22、i質(zhì)粒上的T-DNA片段中，再將重組的T-DNA插入植物細胞的染色體DNA中。(1)科學家在進行上述基因操作時，要用同一種 分別切割質(zhì)粒和目的基因，質(zhì)粒的黏性末端與目的基因DNA片段的黏性末端就可通過 而黏合。(2)將攜帶抗除草劑基因的重組Ti質(zhì)粒導入二倍體油菜細胞，經(jīng)培養(yǎng)、篩選獲得一株有抗除草劑特性的轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)分析，該植株含有一個攜帶目的基因的T-DNA片段，因此可以把它看作是雜合子。理論上，在該轉(zhuǎn)基因植株自交F1代中，仍具有抗除草劑特性的植株占總數(shù)的 ， (3)種植上述轉(zhuǎn)基因油菜，它所攜帶的目的基因可以通過花粉傳遞給近緣物種，造成“基因污染”。如果把目的基因?qū)肴~綠體DNA中，就可以避

23、免“基因污染”，原因是 ?！菊n后答案點撥】思考與探究（P7）1. 不能。連接如下： 2和7能連接形成：ACGT TGCA；4和8能連接形成：GAATTC CTTAAG；3和6能連接形成：GCGC CGCG；1和5能連接形成：CTGCAG GACGTC。解析：限制酶具有特異性，一種限制酶只能識別特定的堿基序列，并在特定的部位切開。2.聯(lián)系你已有的知識，想一想，為什么細菌中限制酶不剪切細菌本身的DNA？解析：迄今為止，基因工程中使用的限制酶絕大部分都是從細菌或霉菌中提取出來的，它們各自可以識別和切斷DNA上特定的堿基序列。細菌中限制酶之所以不切斷自身DNA，是因為微生物在長期的進化過程中形成了一套

24、完善的防御機制，對于外源入侵的DNA可以降解掉。生物在長期演化過程中，含有某種限制酶的細胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵（本題不要求學生回答的完全，教師可參考教師用書中的提示，根據(jù)學生的具體情況，給予指導。上述原則也應適用于其他章節(jié)中有關(guān)問題的回答。）。3.天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？解析：基因工程中作為載體使用的DNA分子很多都是質(zhì)粒（plasmid），即獨立于細菌擬核處染色體DNA之外的一種

25、可以自我復制、雙鏈閉環(huán)的裸露的DNA分子。是否任何質(zhì)粒都可以作為基因工程載體使用呢？其實不然，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件。（1）載體DNA必需有一個或多個限制酶的切割位點，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。（2）載體DNA必需具備自我復制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復制而同步復制。（3）載體DNA必需帶有標記基因，以便重組后進行重組子的篩選。（4）載體DNA必需是安全的，不會對受體細胞有害，或不能進入到除受體細胞外的其他生物細胞中去。（5）載體D

26、NA分子大小應適合，以便提取和在體外進行操作，太大就不便操作。實際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進行人工改造后才能用于基因工程操作。4.網(wǎng)上查詢：DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領(lǐng)嗎？解析：迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶都不具有連接單鏈DNA的能力，至于原因，現(xiàn)在還不清楚，也許將來會發(fā)現(xiàn)可以連接單鏈DNA的酶。P4尋根問底：根據(jù)你所掌握的知識，你能分析出限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？解析：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細菌的一種防御性工具，當外源DNA侵入時，會利用限

27、制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達到保護自身的目的。尋根問底（P6）：DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？答：不是一回事?；蚬こ讨兴玫倪B接酶有兩種：一種是從大腸桿菌中分離得到的，稱之為E.coli連接酶。另一種是從T4噬菌體中分離得到，稱為T4連接酶。這兩種連接酶催化反應基本相同，都是連接雙鏈DNA的缺口（nick），而不能連接單鏈DNA。DNA連接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯鍵（在相鄰核苷酸的3位碳原子上的羥基與5位碳原子上所連磷酸基團的羥基之間形成），那么，二者的差別主要表現(xiàn)在什么地方呢？（1）DNA

28、聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核酸片段的3末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是在單個核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。（2）DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補的DNA鏈；而DNA連接酶是將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來。因此DNA連接酶不需要模板。此外，二者雖然都是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的酶，但組成和性質(zhì)各不相同。模擬制作討論題（P6）：1. 你模擬插入的DNA片段能稱得上一個基因嗎？提示：不能。因為一般基因有上千個堿基對。2. 如果你操作失誤，堿基不能配對?？赡苁鞘裁丛蛟斐傻?？解析：可能是剪切

29、位點或連接位點選得不對（也可能是其他原因）。P6旁欄思考題：想一想，具備什么條件才能充當“分子運輸車”？解析：能自我復制、有一個或多個切割位點、有標記基因位點及對受體細胞無害等?！就卣归喿x】1.磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵全稱為3,5磷酸二酯鍵，是核酸中核苷酸的連接方式，組成了核酸的一級結(jié)構(gòu)。在核酸中一個核苷酸核糖上第3位的羥基與下一個核苷酸核糖上第5位的磷酸羥基脫水縮合成酯鍵，該酯鍵稱3,5磷酸二酯鍵。若干個核苷酸間以3,5磷酸二酯鍵連接成的多核苷酸鏈為核酸。在鏈的一端的一個核苷酸核糖上第5位連接的磷酸只有一個酯鍵，稱此核苷酸為DNA鏈的5磷酸末端或5端。另一端核苷酸上第3位的羥基是自由的，所以此核

30、苷酸稱為3羥基末端或3端。鏈內(nèi)的核苷酸第5位上的磷酸已形成二酯鍵，第3位上的羥基也已參與二酯鍵的形成，故稱核苷酸殘基。2. 影響限制性內(nèi)切酶活性的因素（1）DNA純度在DNA樣品中若含有蛋白質(zhì)，或沒有去除干凈制備過程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高濃度金屬離子，均會降低限制酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用。（2）核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液核酸內(nèi)切限制酶的標準緩沖液包括氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀、Tris-HCL、巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白(BSA)等。使用所有限制酶均可發(fā)揮活性的一種緩沖液。不同限制性內(nèi)切酶對NaCl濃度的要求不同，這是不同限制酶緩沖液組成上的一個

31、主要的不同。據(jù)此可分為高鹽、中鹽和低鹽緩沖液，在進行雙酶解或多酶解時，若這些酶切割可在同種緩沖液中作用良好，則幾種酶可同時酶切；若這些酶所要求的緩沖液有所不同，可采用以下三種方法進行消化反應：先用要求低鹽緩沖液的限制性內(nèi)切酶消化DNA，然后補足適量的NaCl，再用要求高鹽緩沖液的限制酶消化；先用一種酶進行酶解，然后用乙醇沉淀酶解產(chǎn)物，再重懸于另一緩沖液中進行第二次酶解。（3）酶切消化反應的溫度DNA消化反應的溫度，是影響限制內(nèi)切酶活性的一個重要因素。不同的核酸內(nèi)切限制酶，具有各自的最適反應溫度。多數(shù)限制內(nèi)切酶的最適反應溫度是37，少數(shù)限制性內(nèi)切酶的最適反應溫度高于或低于37。（4）DNA的分子

32、結(jié)構(gòu)DNA分子構(gòu)型對核酸內(nèi)切限制酶的活性有很大影響，如消化超螺旋的DNA比消化線性DNA用酶量要高出許多倍。有些限制酶在消化它們自己的處于不同部位的限制位點，其效率也有明顯差異。限制性內(nèi)切酶反應的終止 通常是采用65條件下溫浴5min；加終止反應液（如0.5mol/L的EDTA使之在溶液中的終濃度達到10 mol/L）螯合Mg2 ，以終止反應?！疚迥旮呖蓟胤拧?2006四川高考用基因工程技術(shù)可使大腸桿菌合成人的蛋白質(zhì)。下列敘述不正確的是( )A常用相同的限制性內(nèi)切酶處理目的基因和質(zhì)粒BDNA連接酶和DNA聚合酶是構(gòu)建重組質(zhì)粒必需的工具酶C可用含抗生素的培養(yǎng)基檢測大腸桿菌中是否導入了重組質(zhì)粒D導

33、入大腸桿菌的目的基因不一定能成功表達答案：B 解析：構(gòu)建重組質(zhì)粒必需的工具酶是限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶，其作用部位是磷酸與脫氧核糖之間的磷酸二酯鍵，而DNA聚合酶的作用是在DNA復制過程中用于連接堿基間的氫鍵，故B選項錯誤。22006江蘇高考我國科學家運用基因工程技術(shù)，將蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因?qū)朊藁毎⒊晒Ρ磉_，培育出了抗蟲棉。下列敘述不正確的是 ( )A基因非編碼區(qū)對于抗蟲基因在棉花細胞中的表達不可缺少B重組DNA分子中增加一個堿基對，不一定導致毒蛋白的毒性喪失C抗蟲棉的抗蟲基因可通過花粉傳遞至近緣作物，從而造成基因污染D轉(zhuǎn)基因棉花是否具有抗蟲特性是通過檢測棉花對抗生素抗性來確定的答

34、案：D 解析：基因具有特異性，一種基因只能控制一種性狀的表達?？瓜x基因能表達出致毒蛋白，導致害蟲因食用抗蟲棉后死亡 ，而不能產(chǎn)生對抗生素的抗性。因此，轉(zhuǎn)基因棉花是否具有抗蟲特性是不能通過檢測棉花抗生素的抗性對來確定的。32005江蘇高考在植物基因工程中，用土壤農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒作為運載體把目的基因重組入Ti質(zhì)粒上的T-DNA片段中，再將重組的T-DNA插入植物細胞的染色體DNA中。(1)科學家在進行上述基因操作時，要用同一種 分別切割質(zhì)粒和目的基因，質(zhì)粒的黏性末端與目的基因DNA片段的黏性末端就可通過 而黏合。(2)將攜帶抗除草劑基因的重組Ti質(zhì)粒導入二倍體油菜細胞，經(jīng)培養(yǎng)、篩選獲得一株有抗除草劑特性的轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)分析，該植株含有一個攜帶目的基因的T-DNA片段，因