實驗四離心技術(shù)及物謝實驗

1、實驗四實驗四 離心技術(shù)及物質(zhì)代謝實驗離心技術(shù)及物質(zhì)代謝實驗離心技術(shù)離心技術(shù)概念概念： 根據(jù)物質(zhì)沉降系數(shù)、質(zhì)量、浮力因素等的不同，應(yīng)用離心力使物質(zhì)分離、濃縮、提純的方法。應(yīng)用應(yīng)用： 分離、提純、鑒別生物高分子；分離線粒體、染色體、微粒體、溶酶體等亞細(xì)胞物質(zhì)?；驹砘驹?f f：粒子在離心場中所受的離心力：粒子在離心場中所受的離心力 a a：粒子旋轉(zhuǎn)的加速度：粒子旋轉(zhuǎn)的加速度 m m：沉降粒子的有效質(zhì)量：沉降粒子的有效質(zhì)量 ：粒子旋轉(zhuǎn)的角速度：粒子旋轉(zhuǎn)的角速度 r r：粒子的旋轉(zhuǎn)半徑：粒子的旋轉(zhuǎn)半徑(cm)(cm)rmamf2602rpm，3600422rm轉(zhuǎn)速f= rcf(relative

2、 centrifugal force) ：相對離心力 rpm( revolutions per minute ) ：每分鐘轉(zhuǎn)速 低速離心時常以轉(zhuǎn)速低速離心時常以轉(zhuǎn)速“rpm”rpm”來表示來表示 高速離心時則以高速離心時則以“g”g”表示表示 9802rmgmagfrcfl相對離心力相對離心力 離心力相對于重力的倍數(shù)，單位是離心力相對于重力的倍數(shù)，單位是g gl沉降系數(shù)（沉降系數(shù)（s s）: : 超速離心時，顆粒在離心場超速離心時，顆粒在離心場中的沉降速度用沉降系數(shù)來表示，即物質(zhì)在單中的沉降速度用沉降系數(shù)來表示，即物質(zhì)在單位離心力場下的沉降速度位離心力場下的沉降速度。 單位：svedberg，

3、1s=10-13s 是是物質(zhì)特有的物理常數(shù)，可間接反應(yīng)分子量是是物質(zhì)特有的物理常數(shù)，可間接反應(yīng)分子量的大小。的大小。離心分離技術(shù)的基本理論數(shù)據(jù)，與物質(zhì)的大小、離心分離技術(shù)的基本理論數(shù)據(jù)，與物質(zhì)的大小、形狀、密度及介質(zhì)的密度、粘度都有關(guān)，通過形狀、密度及介質(zhì)的密度、粘度都有關(guān)，通過對離心力和離心介質(zhì)的選擇，即可分離純化出對離心力和離心介質(zhì)的選擇，即可分離純化出不同質(zhì)量大小和物理形狀的物質(zhì)。不同質(zhì)量大小和物理形狀的物質(zhì)。 另外，對某些生物高分子或亞細(xì)胞器組分的化學(xué)結(jié)另外，對某些生物高分子或亞細(xì)胞器組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子量尚不了解時，可用沉降系數(shù)對其物理特構(gòu)、分子量尚不了解時，可用沉降系數(shù)對其物理特性

4、進行初步描述，將其區(qū)別開來，如原核生物的核性進行初步描述，將其區(qū)別開來，如原核生物的核蛋白體蛋白體rnarna（rrnarrna）分為）分為5s5s、16s16s、23s23s，即是根據(jù)，即是根據(jù)其在離心場中的行為來進行分類。其在離心場中的行為來進行分類。 離心機的類型和主要構(gòu)造離心機的類型和主要構(gòu)造l 類型類型 工業(yè)用離心機工業(yè)用離心機離心機離心機 制備性離心機制備性離心機 實驗用離心機實驗用離心機 分析性離心機分析性離心機 普通離心機普通離心機： 6000rpm 6000rpm 高速離心機：高速離心機： 6000600020000rpm20000rpm 超速離心機：超速離心機：20000r

5、pm20000rpm制備性離心機制備性離心機l主要構(gòu)造主要構(gòu)造 轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)頭，離心管和管帽離心管和管帽，制冷系統(tǒng)，真空系，制冷系統(tǒng)，真空系 統(tǒng)，制動裝置，指示表盤統(tǒng)，制動裝置，指示表盤轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)頭 1 1角式轉(zhuǎn)頭角式轉(zhuǎn)頭 2 2蕩平式轉(zhuǎn)頭：蕩平式轉(zhuǎn)頭： 這種轉(zhuǎn)頭是由吊著的這種轉(zhuǎn)頭是由吊著的4 4或或6 6個自由活動的吊桶個自由活動的吊桶( (離心套管離心套管) )構(gòu)成。構(gòu)成。 3 3區(qū)帶轉(zhuǎn)頭：區(qū)帶轉(zhuǎn)頭： 區(qū)帶轉(zhuǎn)頭無離心管，主要由一個轉(zhuǎn)子桶和可旋開的頂蓋組成。區(qū)帶轉(zhuǎn)頭無離心管，主要由一個轉(zhuǎn)子桶和可旋開的頂蓋組成。 4 4垂直轉(zhuǎn)頭：垂直轉(zhuǎn)頭： 其離心管是垂直放置的。其離心管是垂直放置的。 5 5連續(xù)流動轉(zhuǎn)

6、頭：連續(xù)流動轉(zhuǎn)頭： 轉(zhuǎn)頭與區(qū)帶轉(zhuǎn)頭類似，由轉(zhuǎn)子桶和有入口和出口的轉(zhuǎn)頭蓋及附屬轉(zhuǎn)頭與區(qū)帶轉(zhuǎn)頭類似，由轉(zhuǎn)子桶和有入口和出口的轉(zhuǎn)頭蓋及附屬裝置組成。裝置組成。 最大額定轉(zhuǎn)速最大額定轉(zhuǎn)速 一定的使用限度，使用一定次數(shù)或一一定的使用限度，使用一定次數(shù)或一 定時間后遞減定時間后遞減10%10%。 離心管離心管 不銹鋼和不銹鋼和塑料塑料離心管，管帽防止樣品溢出。離心管，管帽防止樣品溢出。 l離心操作的注意事項離心操作的注意事項使用各種離心機時，必須事先在天平上精密地使用各種離心機時，必須事先在天平上精密地平衡平衡離心管和其內(nèi)容物，轉(zhuǎn)頭中絕對不能裝載單數(shù)的管離心管和其內(nèi)容物，轉(zhuǎn)頭中絕對不能裝載單數(shù)的管子，當(dāng)轉(zhuǎn)

7、頭只是部分裝載時，管子必須互相對稱地子，當(dāng)轉(zhuǎn)頭只是部分裝載時，管子必須互相對稱地放在轉(zhuǎn)頭中，以便使負(fù)載均勻地分布在轉(zhuǎn)頭的周圍。放在轉(zhuǎn)頭中，以便使負(fù)載均勻地分布在轉(zhuǎn)頭的周圍。 每個轉(zhuǎn)頭各有其最高允許轉(zhuǎn)速和使用累計期限，使每個轉(zhuǎn)頭各有其最高允許轉(zhuǎn)速和使用累計期限，使用轉(zhuǎn)頭時要查閱說明書，不得過速使用。用轉(zhuǎn)頭時要查閱說明書，不得過速使用。裝載溶液時，要根據(jù)各種離心機的具體操作說明進行，裝載溶液時，要根據(jù)各種離心機的具體操作說明進行，根據(jù)待離心液體的性質(zhì)及體積選用適合的離心管，有根據(jù)待離心液體的性質(zhì)及體積選用適合的離心管，有的離心管無蓋，的離心管無蓋，液體不得裝得過多液體不得裝得過多，以防離心時甩出，

8、以防離心時甩出，造成轉(zhuǎn)頭不平衡、生銹或被腐蝕造成轉(zhuǎn)頭不平衡、生銹或被腐蝕; ;而制備性超速離心機而制備性超速離心機的離心管，則常常要求必須將液體裝滿，以免離心時的離心管，則常常要求必須將液體裝滿，以免離心時塑料離心管的上部凹陷變形。塑料離心管的上部凹陷變形。若要在低于室溫的溫度下離心時。轉(zhuǎn)頭在使用前應(yīng)放若要在低于室溫的溫度下離心時。轉(zhuǎn)頭在使用前應(yīng)放置在冰箱或置于離心機的轉(zhuǎn)頭室內(nèi)置在冰箱或置于離心機的轉(zhuǎn)頭室內(nèi)預(yù)冷預(yù)冷。 離心過程中不得隨意離開離心過程中不得隨意離開物質(zhì)代謝實驗物質(zhì)代謝實驗v實驗二十一、糖酵解中間產(chǎn)物的鑒定實驗二十一、糖酵解中間產(chǎn)物的鑒定v血清膽固醇測定血清膽固醇測定v血清甘油三酯

9、測定血清甘油三酯測定v實驗二十、鄰甲苯胺法測血糖含量實驗二十、鄰甲苯胺法測血糖含量實驗二十一實驗二十一、糖酵解中間產(chǎn)物的鑒定、糖酵解中間產(chǎn)物的鑒定 【實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康摹?檢測糖酵解中間產(chǎn)物磷酸丙糖的生成。檢測糖酵解中間產(chǎn)物磷酸丙糖的生成。 【實驗原理實驗原理】gg-6-pf-6-pf-1,6-bp磷酸二羥丙酮1,3-二磷酸甘油酸3-磷酸甘油酸2-磷酸甘油酸pep丙酮酸乳酸atp adpatp adpnadh+h+ nad+h2o醛縮酶pi異構(gòu)酶pfk-13-磷酸甘油 醛脫氫酶atp adp磷酸甘油 酸激酶變位酶烯醇化酶adp atp丙酮酸激酶ldh己糖激酶異構(gòu)酶3-磷酸甘油醛糖酵解的反應(yīng)過程見

10、下圖：糖酵解的反應(yīng)過程見下圖：將酵母液（含有葡萄糖及糖酵解的全部酶）在一定的將酵母液（含有葡萄糖及糖酵解的全部酶）在一定的介質(zhì)中（適宜的介質(zhì)中（適宜的phph，必要的金屬離子等）進行保溫，必要的金屬離子等）進行保溫，在酵母液中酶體系的作用下，酵母液中原來含有的糖在酵母液中酶體系的作用下，酵母液中原來含有的糖就進行酵解反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)進行到生成二分子磷酸丙糖，就進行酵解反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)進行到生成二分子磷酸丙糖，進一步變化是在進一步變化是在3 3磷酸甘油醛脫氫酶磷酸甘油醛脫氫酶催化下進行的催化下進行的，shsh為為3 3磷酸甘油醛脫氫酶的必需基團，加入磷酸甘油醛脫氫酶的必需基團，加入一碘一碘醋酸可與此酶的

11、醋酸可與此酶的shsh起反應(yīng)起反應(yīng)，從而使酶失去活性，從而使酶失去活性，酵解反應(yīng)就停留在磷酸丙糖階段。酵解反應(yīng)就停留在磷酸丙糖階段。酶酶-sh+ich2cooh-sh+ich2cooh酶酶s-ch2cooh+his-ch2cooh+hi然后以然后以硫酸肼硫酸肼為穩(wěn)定劑，保護磷酸丙糖不致自為穩(wěn)定劑，保護磷酸丙糖不致自發(fā)分解，使其不能向其他方向變化，結(jié)果磷酸發(fā)分解，使其不能向其他方向變化，結(jié)果磷酸丙糖在反應(yīng)體系中堆積，從而與丙糖在反應(yīng)體系中堆積，從而與2 2，4 4二硝基二硝基苯肼苯肼反應(yīng)生成相應(yīng)的反應(yīng)生成相應(yīng)的苯腙苯腙，后者在堿性溶液中，后者在堿性溶液中溶解呈溶解呈紫紅色紫紅色，可借此鑒定丙糖之

12、生成。，可借此鑒定丙糖之生成。v【實驗方法實驗方法】取試管取試管3 3支，編號，按下表進行操作支，編號，按下表進行操作記錄三管所發(fā)生的情況，并加以簡要的分析記錄三管所發(fā)生的情況，并加以簡要的分析ccl3coohccl3cooh的作用：強酸，使糖酵解的全部酶失活。的作用：強酸，使糖酵解的全部酶失活。一碘醋酸的作用：使一碘醋酸的作用：使3 3磷酸甘油醛脫氫酶失活。磷酸甘油醛脫氫酶失活。硫酸肼的作用：穩(wěn)定磷酸丙糖，使其不向其它方向轉(zhuǎn)變。硫酸肼的作用：穩(wěn)定磷酸丙糖，使其不向其它方向轉(zhuǎn)變。試試 劑（劑（mlml） 1 12 23 3ph7.4ph7.4磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液一碘醋酸一碘醋酸硫酸肼硫酸肼

13、1010ccl3cooh ccl3cooh 酵母液酵母液水水 2.02.00.5 0.5 0.5 0.5 1.0 1.0 4.0 4.0 2.02.00.5 0.5 0.50.54.04.01.01.02.0 2.0 4.0 4.0 2.02.0混勻，在混勻，在37373838恒溫水浴中保溫恒溫水浴中保溫3030分鐘分鐘一碘醋酸一碘醋酸 硫酸肼硫酸肼1010ccl3cooh ccl3cooh 水水 2.02.0 1.0 1.0 1.01.00.50.50.50.51.01.0 混勻，靜置混勻，靜置1010分鐘，分鐘，離心離心,3000,3000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/min,10/min,10分鐘，再取三支試管

14、，分鐘，再取三支試管，對號按下表操作對號按下表操作上清液上清液 1mol/lnaoh1mol/lnaoh0.5 0.5 0.50.50.50.5 0.50.50.5 0.5 0.50.5混勻，在室溫放置混勻，在室溫放置1010分鐘分鐘2 2，4 4二硝基苯肼二硝基苯肼 1mol/l naoh1mol/l naoh0.5 0.5 3.53.50.5 0.5 3.53.50.50.53.53.5v實驗注意事項：成腙反應(yīng)前，溶液必須先堿化并在室溫放置成腙反應(yīng)前，溶液必須先堿化并在室溫放置10min10min，目的是使磷酸丙糖中的磷酸基水解脫，目的是使磷酸丙糖中的磷酸基水解脫去，生成的顏色比較穩(wěn)定；去

15、，生成的顏色比較穩(wěn)定；一碘醋酸和三氯乙酸是酶的抑制劑一碘醋酸和三氯乙酸是酶的抑制劑 ，使用移液，使用移液管后必須管后必須徹底清洗徹底清洗移液管，否則易導(dǎo)致實驗失移液管，否則易導(dǎo)致實驗失敗。敗。血清膽固醇測定（酶法）血清膽固醇測定（酶法）v【實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康摹?1. 1. 了解膽固醇氧化酶法測定血清膽固醇的原理。了解膽固醇氧化酶法測定血清膽固醇的原理。 2. 2. 掌握血清膽固醇測定的臨床意義。掌握血清膽固醇測定的臨床意義。 血清中總膽固醇包括膽固醇酯血清中總膽固醇包括膽固醇酯(ce, 70%)(ce, 70%)和游離型膽固醇和游離型膽固醇(fc, (fc, 30%)30%)。膽固醇酯酶（。膽固

16、醇酯酶（cehceh）先將膽固醇酯水解為膽固醇和游）先將膽固醇酯水解為膽固醇和游離脂肪酸（離脂肪酸（ffaffa），膽固醇在膽固醇氧化酶（），膽固醇在膽固醇氧化酶（codcod）的作用）的作用下氧化生成下氧化生成4-4-膽甾烯酮和過氧化氫。后者經(jīng)過氧化物酶膽甾烯酮和過氧化氫。后者經(jīng)過氧化物酶（podpod）催化與）催化與4- 4-氨基安替比林（氨基安替比林（4-aap4-aap）和酚反應(yīng)，生成）和酚反應(yīng)，生成紅色的醌亞胺，其顏色深淺與膽固醇的含量呈正比，在紅色的醌亞胺，其顏色深淺與膽固醇的含量呈正比，在500nm500nm波長處測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)管比較可計算出血清膽固波長處測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)管

17、比較可計算出血清膽固醇的含量。反應(yīng)式如下：醇的含量。反應(yīng)式如下：【實驗原理實驗原理】1. . 標(biāo)本：不溶血的血清或血漿標(biāo)本。血漿用標(biāo)本：不溶血的血清或血漿標(biāo)本。血漿用肝素鈉、肝素鈉、edtaedta抗凝，不可用草酸鹽、氟抗凝，不可用草酸鹽、氟化物?；?。2. 2.取試管取試管3 3支，編號，按下表操作。支，編號，按下表操作?！緦嶒灧椒▽嶒灧椒ā考尤胛铮╱l）測定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管血清10-膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液-10-蒸餾水-10酶應(yīng)用液100010001000【計算【計算】 aa標(biāo)本標(biāo)本 chocho（mmolmmol/l/l）= = 標(biāo)準(zhǔn)液濃度標(biāo)準(zhǔn)液濃度 aa標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn) 【標(biāo)準(zhǔn)液【標(biāo)準(zhǔn)液】 膽固醇膽固醇

18、5.17mmol/l5.17mmol/l（200mg/dl200mg/dl） 【正常參考范圍【正常參考范圍】 3.103.105.70mmol/l 5.70mmol/l 混勻后，混勻后，3737水浴保溫水浴保溫1515分鐘，在分鐘，在500nm500nm波長處波長處比色，以空白管調(diào)零，讀取各管吸光度。比色，以空白管調(diào)零，讀取各管吸光度。 血清甘油三酯的測定（血清甘油三酯的測定（ 酶法）酶法）【實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康摹?1 1、了解酶法定量測定血清甘油三酯的基本原理。、了解酶法定量測定血清甘油三酯的基本原理。 2 2、掌握酶法定量測定血清甘油三酯的實驗方法。、掌握酶法定量測定血清甘油三酯的實驗方法。

19、血清中甘油三酯經(jīng)脂肪酶水解為甘油和脂肪酸，甘油在甘血清中甘油三酯經(jīng)脂肪酶水解為甘油和脂肪酸，甘油在甘油激酶（油激酶（gkgk）及）及atpatp存在下，生成存在下，生成3- 3-磷酸甘油，爾后，在磷磷酸甘油，爾后，在磷酸甘油氧化酶（酸甘油氧化酶（gpogpo）作用氧化成磷酸二羥丙酮并生成過氧）作用氧化成磷酸二羥丙酮并生成過氧化氫，過氧化氫與底物化氫，過氧化氫與底物4- 4-氨基安替比林和氨基安替比林和espasespas在過氧化物在過氧化物酶（酶（podpod）作用下，生成紅色亞醌化合物，其顏色深淺與甘）作用下，生成紅色亞醌化合物，其顏色深淺與甘油三酯含量成正比。在油三酯含量成正比。在500n

20、m500nm波長處測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)管波長處測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)管比較可計算出血清甘油三酯的含量。反應(yīng)式如下：比較可計算出血清甘油三酯的含量。反應(yīng)式如下： 甘油三酯甘油三酯 + 4h2o + 4h2o 脂蛋白脂酶脂蛋白脂酶 甘油甘油 + + 脂肪酸脂肪酸 甘油甘油 + atp + atp 甘油激酶甘油激酶/mg2+ /mg2+ 甘油甘油-3-3-磷酸磷酸 + adp+ adp 甘油甘油-3-3-磷酸磷酸 + o2 + o2 甘油甘油-3-3-磷酸氧化酶磷酸氧化酶 磷酸二羥丙酮磷酸二羥丙酮 + h2o2+ h2o2 2h2o2 + espas + 4- 2h2o2 + espas + 4-氨基安替

21、比林氨基安替比林 過氧化物酶過氧化物酶 紅色醌亞胺色紅色醌亞胺色素素+ 4h2o+ 4h2o【實驗原理實驗原理】1. . 標(biāo)本：不溶血的血清或血漿標(biāo)本。血漿用標(biāo)本：不溶血的血清或血漿標(biāo)本。血漿用肝素鈉、肝素鈉、edtaedta抗凝，不可用草酸鹽、氟抗凝，不可用草酸鹽、氟化物?；?。2. 2.取試管取試管3 3支，編號，按下表操作。支，編號，按下表操作?！緦嶒灧椒▽嶒灧椒ā考尤胛铮╱l）測定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管血清10-甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)液-10-蒸餾水-10酶應(yīng)用液100010001000【計算【計算】 aa標(biāo)本標(biāo)本甘油三酯（甘油三酯（mmolmmol/l/l）= = 標(biāo)準(zhǔn)液濃度標(biāo)準(zhǔn)液濃度 aa標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)【標(biāo)準(zhǔn)液【標(biāo)準(zhǔn)液】 甘油三酯甘油三酯 2.26 mmol2.26 mmol/l/l 【正常參考范圍【正常參考范圍】 0.560.561.71mmol/l 1.71mmol/l 混勻后，混勻后，3