人NK細(xì)胞體外高效擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)探究

1、人nk細(xì)胞體外高效擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)探究作者：黃慶生，李琦，黃勇，商澎，張明杰【摘要】 目的：建立人nk細(xì)胞體外大量擴(kuò)增的方法。 方法：采用基因工程方法，在k562細(xì)胞上同時(shí)表達(dá)il 15、 il 18、4 1bbl 3種基因，構(gòu)建特定的k562工程細(xì)胞作 為刺激細(xì)胞。il 15、 il 18基因分別與一段特殊的跨膜 蛋白基因融合，4 1bbl直接跨膜表達(dá)，使這3種蛋白在 k562細(xì)胞中表達(dá)后錨定于細(xì)胞膜表面。其次，以照射致死的 該k562工程細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，以人外周血單個(gè)核細(xì)胞 (pbmc)為擴(kuò)增培養(yǎng)對(duì)象，通過(guò)與il 2的共刺激作用，使 nk細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下得到大量的擴(kuò)增。結(jié)果：經(jīng)過(guò)21 d 的

2、刺激培養(yǎng)后，cd56+cd3-細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增了 (520±75)倍。 cd56+cd3-細(xì)胞的純度從培養(yǎng)前占pbmc的7%±4%到擴(kuò)增后占 總細(xì)胞比例的93%±3%o pbmc中的t細(xì)胞基本上沒(méi)有得到擴(kuò) 增，擴(kuò)增后的細(xì)胞中cd3+細(xì)胞只占2%±1.2%。擴(kuò)增的細(xì)胞 具備了 nk細(xì)胞的基本特征和生物學(xué)特性，除了 cd56+cd3- 外，還對(duì)擴(kuò)增的nk細(xì)胞上nkg2d、nkp46、nkp44、nkp30、 cd94、cd158b、cd158a. nkb1、nkat2 等標(biāo)記進(jìn)行了驗(yàn) 證。細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)表明，在效應(yīng)細(xì)胞：靶細(xì)胞為5 ： 1時(shí)，擴(kuò) 增的nk細(xì)胞的殺傷率

3、達(dá)到了 95%±4%o結(jié)論：建立的nk細(xì) 胞體外擴(kuò)增方法，達(dá)到了較高的擴(kuò)增水平，且擴(kuò)增的細(xì)胞 活性較好。本方法以pbmc為原始材料，能夠?qū)崿F(xiàn)nk細(xì)胞體 外的大規(guī)模制備，這將為抗病毒與抗腫瘤的nk細(xì)胞免疫治 療奠定基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】擴(kuò)增；自然殺傷細(xì)胞；白細(xì)胞介素15；白細(xì) 胞介素18； 4 1bb配體nk細(xì)胞(natural ldller cell)的過(guò)繼治療在抗病 毒、抗腫瘤的治療中有著廣泛的應(yīng)用前景，在造血干細(xì)胞 移植后減少移植物抗宿主反應(yīng)中的作用也倍受關(guān)注1, 2o 由于nk細(xì)胞在外周血中所占的比例很少，建立一種有效的 nk細(xì)胞體外擴(kuò)增系統(tǒng)是深入研究nk細(xì)胞功能與探討nk細(xì)胞 免疫

4、治療的基礎(chǔ)。體外獲取人nk細(xì)胞主要有兩種途徑：一 是采用抗nk細(xì)胞特異性抗體與磁珠交聯(lián)的方法，從pbmc中 分離人nk細(xì)胞；二是采用刺激擴(kuò)增培養(yǎng)的方法，從pbmc中 擴(kuò)增培養(yǎng)人nk細(xì)胞。前者可以快速獲得nk細(xì)胞，但只適用 于小規(guī)模的nk制備用于研究分析。后者則是以pbmc (或以 磁珠分離的nk細(xì)胞)為原始材料，通過(guò)特定細(xì)胞因子的刺 激，使nk細(xì)胞在體外得到特異的擴(kuò)增3, 4,這種方法 是目前被認(rèn)為比較有應(yīng)用前景的方法，通過(guò)體外的刺激培 養(yǎng)可進(jìn)行相對(duì)大規(guī)模的nk細(xì)胞制備，使臨床應(yīng)用成為可能。 但是迄今為止多數(shù)的體外刺激擴(kuò)增培養(yǎng)也只能使nk細(xì)胞在 體外擴(kuò)增數(shù)十到百倍，且純度也不理想。在刺激nk細(xì)

5、胞生 長(zhǎng)上，已知il 2、 il 15、 il 18和il 12等細(xì)胞因 子在對(duì)nk細(xì)胞的生長(zhǎng)與擴(kuò)增是非常重要的，其中il 15的 作用尤為重要。除了細(xì)胞因子對(duì)nk細(xì)胞的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作 用外，研究人員還注意到k562、hfwt等腫瘤細(xì)胞也能夠刺 激nk細(xì)胞的擴(kuò)增。研究表明，il 15處于細(xì)胞膜上比其可 溶狀態(tài)能更有力刺激nk細(xì)胞的生長(zhǎng)5, 6o imai等7 研究證明，如果單純將k562細(xì)胞與可溶形式的il 15混合 后刺激nk細(xì)胞，結(jié)果與以往的單純細(xì)胞因子刺激或者腫瘤 細(xì)胞刺激相比沒(méi)有太大的差別，只能使nk細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)十倍。 但是，如果將il 15表達(dá)在k562細(xì)胞的表面（非可溶形式 的il

6、15）,使il 15基因及4 1bbl基因與跨膜蛋白基 因融合，共同表達(dá)在k562細(xì)胞的膜表面。這樣，通過(guò)v射 線照射致死的該刺激細(xì)胞與pbmc的共同孵育（刺激細(xì)胞與 nk細(xì)胞間的接觸刺激），經(jīng)過(guò)3周時(shí)間的培養(yǎng)，nk細(xì)胞得 到大量的擴(kuò)增，明顯高于目前報(bào)道的各種擴(kuò)增方法。我們?cè)?上述方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，在k562細(xì)胞膜表面表達(dá) il 15與4 1bbl的同時(shí)，將il 18也同時(shí)表達(dá)在k562細(xì) 胞的表面，以該細(xì)胞為刺激細(xì)胞，對(duì)其在nk細(xì)胞擴(kuò)增中的 作用進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。1材料和方法1. 1材料pbmc分別來(lái)自8個(gè)健康獻(xiàn)血者（男女各4 人），其中年齡最大45歲，最小22歲，平均38歲。k562 細(xì)

7、胞、含cd8a信號(hào)肽和穿膜區(qū)基因的真核表達(dá)載體本室 已構(gòu)建；il 15、il 18、4 1bbl cdna分別從正常人淋 巴細(xì)胞中擴(kuò)增；抗人 cd56、cd3、cd94、nkg2d、nkp46、 nkp30、nkp44、cd158b、cd158a. nkb1. nkat2 特異性 抗體購(gòu)自美國(guó)bd biosciences公司及coulter公司；nk殺 傷活性檢測(cè)采用日本同仁化學(xué)研究所（dojindo）的cell counting kit 8 試劑盒。rpmi1640 為 gibco brl 公司產(chǎn)品。1.2方法1.2. 1 表達(dá) il 15、il 18、4 1bbl k562 細(xì)胞 的構(gòu)建采

8、用rt pcr方法分別從人pbmc中擴(kuò)增il 15、 4 1bbl. il 18 cdna,測(cè)序正確后，il 15、il 18 基 因分別克隆至cd8a信號(hào)肽的下游、cd8a跨膜區(qū)基因的上 游。重組的il 15、il 18、4 1bbl再分別亞克隆至含 有不同篩選標(biāo)記的3種真核表達(dá)載體，先后轉(zhuǎn)染k562細(xì)胞 后，篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆，構(gòu)建了 k562工程細(xì)胞株（以 下簡(jiǎn)稱k562d3細(xì)胞）。k562d3細(xì)胞應(yīng)用前（與pbmc共培養(yǎng) 前），用y射線滅活。1.2.2 nk細(xì)胞的刺激培養(yǎng) 新鮮分離的人pbmc, pbs 洗3次后，用含100 ml/l胎牛血清、1x106u/l可溶性 il 2的rp

9、mi1640培養(yǎng)液懸浮，加入24孔板中，每孔106 個(gè)細(xì)胞；隨后每孔再另加v射線滅活的k562d3細(xì)胞106個(gè),37°c、50 ml/l c02孵箱培養(yǎng)，第6天起每隔3d對(duì)孔中的 液體半換液，培養(yǎng)21 d后收獲細(xì)胞并用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì) 胞分類分析，確定cd56+cd3-細(xì)胞的比例。同時(shí)設(shè)以下平行 對(duì)照組：?jiǎn)渭僰562細(xì)胞刺激組、單純加入k562細(xì)胞以及 可溶性 il 15/il18 刺激組、表達(dá) il 15/41bbl/k562細(xì)胞刺激組、單獨(dú)表達(dá)4 1bbl的k562細(xì)胞組、單獨(dú)表 達(dá)il 15的k562細(xì)胞組和單獨(dú)表達(dá)il 18的k562細(xì)胞組。 所有組的培養(yǎng)液均為rpmi164

10、0含100 ml/l胎牛血清、 1x106 u/l 可溶性 il 2o1. 2. 3nk細(xì)胞標(biāo)志物的測(cè)定 擴(kuò)增前的pbmc以及擴(kuò)增 培養(yǎng)21 d的細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析，分別用cd56、cd3 抗體對(duì)擴(kuò)增（培養(yǎng)）前后的細(xì)胞進(jìn)行分類鑒定，確認(rèn)nk細(xì) 胞的比例。同時(shí)還對(duì)擴(kuò)增nk細(xì)胞的激活性受體和抑制性受 體水平分別用 cd94、nkg2d、nkp46、nkp30、nkp44、 cd158b、cd158a、nkb1. nkat2抗體，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn) 行評(píng)估。1. 2. 4 nk細(xì)胞殺傷活性測(cè)定96孔培養(yǎng)板，每孔含一 定數(shù)量的nk細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，另加入一定數(shù)量的k562細(xì) 胞作為靶細(xì)胞，兩種細(xì)胞的

11、數(shù)量比例根據(jù)效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì) 胞的比值要求而定，總體積200 ul （液體為100 ml/l胎牛 血清的rpmi1640培養(yǎng)液），37°c、c02培養(yǎng)箱4 h,每孔 加入 20 p l cell counting 試劑，37°c c02 培養(yǎng)箱 2 h,450 run波長(zhǎng)測(cè)定吸光值（a）,計(jì)算殺傷率。同時(shí)設(shè)只有nk細(xì)胞以及只有k562細(xì)胞的對(duì)照孔。殺傷率二1 （ae+t-ae）/at x100%； ae：?jiǎn)渭冃?yīng)細(xì)胞孔即nk細(xì)胞孔 的a值；at：?jiǎn)渭儼屑?xì)胞孔即k562細(xì)胞孔的a值；ae+t：效 應(yīng)細(xì)胞加靶細(xì)胞孔的a值。2結(jié)果2. 1 k562d3細(xì)胞 構(gòu)建的k562d3細(xì)胞通

12、過(guò)抗 4 1bbl、 il 15和il 18抗體染色，證明k562d3細(xì)胞 同時(shí)表達(dá)了這3種蛋白。y射線照射后的k562d3細(xì)胞經(jīng)過(guò) 2周的連續(xù)培養(yǎng)，未見(jiàn)有存活細(xì)胞。照射后的細(xì)胞在36 d 內(nèi)仍然保持完整的細(xì)胞形狀，與pbmc混合后的該照射細(xì)胞 在第56天后破碎并被逐漸吞噬干凈。2.2 k562d3細(xì)胞與pbmc共培養(yǎng)后nk細(xì)胞的擴(kuò)增8 份健康供血者pbmc細(xì)胞，擴(kuò)增前經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析，確認(rèn) cd56+cd3-細(xì)胞占總細(xì)胞的7%±4%, cd3+細(xì)胞（主要為t細(xì) 胞）占總數(shù)的56%±8%（圖1a）ok562d3工程細(xì)胞刺激組（pbmc 與表達(dá)il 18/il15/4 1bb

13、l的k562細(xì)胞共培養(yǎng)），經(jīng)過(guò)21 d刺激培養(yǎng)后，cd56+cd3-細(xì)胞占總細(xì)胞的93%±3%, cd3+細(xì)胞只占總數(shù)的2%±1.2%（圖ib）, nk細(xì)胞（cd56+cd3-） 數(shù)量擴(kuò)增了（520±75）倍。平行對(duì)照培養(yǎng)中，表達(dá) il 15/4 1bbl 的 k562 細(xì)胞刺激組，21 d 后 cd56+cd3-細(xì)胞大約擴(kuò)增了 (500±50)倍，cd56+cd3-細(xì)胞占擴(kuò)增后總細(xì)胞 數(shù)的91%±4%。k562細(xì)胞加可溶性il 15/il18組，21 d后nk細(xì)胞大約擴(kuò)增了 (50±10)倍；單純與k562細(xì)胞共培養(yǎng) 組，21 d后

14、nk細(xì)胞大約擴(kuò)增了(20±8)倍；單獨(dú)表達(dá) 4 1bbl或單獨(dú)表達(dá)il 15或單獨(dú)表達(dá)il 18的k562細(xì)胞 刺激組21 d后分別擴(kuò)增了(80±26)倍、(110±32)倍和 (25±9)倍(圖2)；各組之間，k562d3工程細(xì)胞刺激組與 k562表達(dá)il 15/4 1bbl細(xì)胞刺激組，這兩組的擴(kuò)增倍數(shù) 接近(p&gt；0.05,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，但明顯高于其余組 (p&lt；0. 05)o2. 3擴(kuò)增的nk細(xì)胞表面標(biāo)記分析對(duì)k562d3工程細(xì) 胞刺激擴(kuò)增的nk細(xì)胞，除了用cd56、cd3抗體予以確認(rèn)外, 還采用流式細(xì)胞術(shù)分析，對(duì)其他幾種

15、代表nk細(xì)胞特征性的 受體 cd94、nkg2d、nkp46、nkp30. nkp44、cd 158b、 cd158&、nkb1和nkat2分別進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果證實(shí)這些標(biāo) 志性的受體在擴(kuò)增的nk細(xì)胞中分別為cd94陽(yáng)性95%、nkg2d 陽(yáng)性 95%、nkp46 陽(yáng)性 84%、nkp30 陽(yáng)性 62%、nkp44 陽(yáng)性 65%、cd 158b 陽(yáng)性 20%、cd158a 陽(yáng)性 18%、nkb1 陽(yáng)性 30%、 nkat2 陽(yáng)性 20% o2.4擴(kuò)增的nk細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)對(duì)k562d3工程細(xì)胞刺 激組和il 15/4 1bbl k562細(xì)胞刺激組所擴(kuò)增的nk細(xì)胞 的殺傷能力進(jìn)行了比較，結(jié)果表

16、明在效應(yīng)細(xì)胞：靶細(xì)胞為 5 ： 1時(shí)，兩組的殺傷率分別為95%±4%和85%±7%；在效應(yīng) 細(xì)胞：靶細(xì)胞為2 ： 1時(shí)，兩組的殺傷率分別為75%±6%和 60%±9% (圖3)；兩組nk細(xì)胞的殺傷率差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p&lt；0. 05)o圖1擴(kuò)增前后的樣品流式細(xì)胞術(shù)分析(略)fig 1 flow cytometry analysis before and after expasiona： pbmc analyzed by flow cytometry before expansion； b： expanded cells analyzed by

17、 flow cytometry on days 21 of expansion.圖2 7組刺激成分對(duì)pbmc中nk細(xì)胞擴(kuò)增效果比較 (略)fig 2 expansion efficiency of 7 stimulators1： k562d3 (520±75) ； 2： il 15/4 1bbl membrane bound k562 (500±50) ； 3： k562 cell with soluble il 15 and il 18 (50±10) ； 4： k562 cell only (20±8) ； 5： 4 1bbl membrane bo

18、und k562(800±26) ； 6： il 15membrane bound k562( 110 + 32) ； 7: il 18 membranebound k562(25±9)圖3 k562d3刺激擴(kuò)增的nk細(xì)胞與k562表達(dá)il 15/4 1bbl刺激擴(kuò)增的nk細(xì)胞殺傷率比較（略）fig 3 cytotoxicity between nk cells expanded by stimulator of k562d3 and nk cells expanded by stimulator of il 15/4 1bbl membrane bound k562a：

19、the cytotoxicity were 95%±4% for nk cells expanded by k562d3 and 85%±7% for nk cells expanded by il 15/4 1bbl membrane bound k562 at 5 * 1 e ： t ratio. b： cytotoxicity were 75%±6% for nk cells expanded by k562d3 and 60%+9% for nk cells expanded by il 15/4 1bbl membrane bound k562 at 2

20、 * 1 e ： t ratio.3討論nk細(xì)胞在抗病毒、抗腫瘤上扮演著重要的角色，因 其作用不需初次免疫活化，因而在過(guò)繼免疫治療上有其獨(dú) 特的應(yīng)用前景。由于不能獲得數(shù)量大、純度高的人nk細(xì)胞, 使nk細(xì)胞在免疫治療中的應(yīng)用受到了限制。采用體外擴(kuò)增 的方法獲得足夠數(shù)量和較高純度的人nk細(xì)胞，是近年來(lái)研 究nk細(xì)胞功能特別是探討過(guò)繼免疫治療的一個(gè)重要基礎(chǔ)平 臺(tái)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在擴(kuò)增的方法上進(jìn)行了各種的探索，如采用 磁株分選的方法先從人pbmc中分離nk細(xì)胞，獲得的nk細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下，用可溶性il 2、 il 12、 il 15 等細(xì)胞因子共同刺激，能使nk細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)十倍3, 4。除 了細(xì)胞因子

21、外，k562、hfwt等腫瘤細(xì)胞也能夠刺激nk細(xì)胞 的擴(kuò)增，采用照射致死的k562細(xì)胞或hfwt細(xì)胞與pbmc共 培養(yǎng)，也能使pbmc中的nk細(xì)胞得到一定的擴(kuò)增80在數(shù) 量上，上述這些擴(kuò)增方法獲得的nk細(xì)胞似乎還不能滿足過(guò) 繼免疫治療的需要，僅僅靠可溶性細(xì)胞因子的刺激還很難 使nk細(xì)胞得到大量的擴(kuò)增。4 與其配體4 1bbl是一 對(duì)重要的共刺激分子，對(duì)于活化t細(xì)胞、nk細(xì)胞以及介導(dǎo) 免疫應(yīng)答具有重要的作用。4 1bbl與il 15結(jié)合是pbmc 中nk細(xì)胞得到特異擴(kuò)增的基礎(chǔ)，而以非可溶形式表達(dá)的這 兩種蛋白，通過(guò)細(xì)胞間的接觸刺激則是使nk細(xì)胞大量擴(kuò)增 的主要原因。imai等7建立的這種擴(kuò)增方法

22、是迄今為止 擴(kuò)增效率最高的一種方法。我們?cè)诰C合這些方法的基礎(chǔ)上對(duì) 體外大規(guī)模擴(kuò)增人nk細(xì)胞進(jìn)行了探索。由于il 18是一種 重要的nk細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，可以促進(jìn)nk細(xì)胞的增殖、活化、 殺傷及分泌等功能9,本研究在以膜蛋白形式表達(dá) 4 1bbl 與 il 15 的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了表達(dá) 4 1bbl/il 15/il18 3 種成分的 k562 刺激細(xì)胞 k562d3,結(jié)果表明用k562d3擴(kuò)增的nk細(xì)胞，其細(xì)胞毒活性比 il 15/41bbl/k562擴(kuò)增的nk細(xì)胞提高了約10%,擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)到了 520倍。本擴(kuò)增方法獲得的nk細(xì)胞活性好（95%殺 傷率)、純度高(93%),且方法簡(jiǎn)便實(shí)用，有望成為探索

23、 nk細(xì)胞過(guò)繼免疫治療的一重要平臺(tái)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 klingemann hg natural killer cell based immunotherapeutic strategies j . cytotherapy, 2005, 7(1)： 16-22.2 grzywacz b, miller js, verneris mr. use of natural killer cells as immunotherapy for leukaemiaj . best pract res clin haematol, 2008, 21 (3): 467-483.3 klingemann hg and martinson j. ex vivo expansion of natural killer cells for clinical applications j cytotherapy, 2004, 6(1): 15一22.4 李曉紅，馬健，汪菲菲，等.體外擴(kuò)增高純 度的人外周血來(lái)源的nk細(xì)胞的研究j.中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué) 雜志，2007, 15(2)： 373-3775 musso t, calosso l, zucca m, et al. human monocytes constitutively e