第五課蛋白質(zhì)和多肽的氨基酸序列測(cè)定

1、第五課蛋白質(zhì)和多肽的氨基第五課蛋白質(zhì)和多肽的氨基酸序列測(cè)定酸序列測(cè)定 蛋白質(zhì)和多肽是由蛋白質(zhì)和多肽是由20種氨基酸按照一定的順序通過肽鍵連接成一長(zhǎng)種氨基酸按照一定的順序通過肽鍵連接成一長(zhǎng)鏈，然后通過鏈內(nèi)、鏈間的離子鍵、疏水作用等多種作用力進(jìn)行折疊、鏈，然后通過鏈內(nèi)、鏈間的離子鍵、疏水作用等多種作用力進(jìn)行折疊、卷曲形成一定的構(gòu)象并發(fā)揮其獨(dú)特作用。氨基酸的排列順序即蛋白質(zhì)的卷曲形成一定的構(gòu)象并發(fā)揮其獨(dú)特作用。氨基酸的排列順序即蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)及功能。因此，測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)及功能。因此，測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸序列是進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究中不可缺少的部

2、分。另外，蛋白質(zhì)一級(jí)序列是進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究中不可缺少的部分。另外，蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的信息也有助于對(duì)其基因結(jié)構(gòu)的研究。結(jié)構(gòu)的信息也有助于對(duì)其基因結(jié)構(gòu)的研究。 目前，進(jìn)行蛋白質(zhì)序列測(cè)定有兩個(gè)關(guān)鍵步驟，即：目前，進(jìn)行蛋白質(zhì)序列測(cè)定有兩個(gè)關(guān)鍵步驟，即：氨基酸殘基一個(gè)一個(gè)依次從蛋白質(zhì)和多肽的末端切割下來；氨基酸殘基一個(gè)一個(gè)依次從蛋白質(zhì)和多肽的末端切割下來；正確鑒定每次切割下來的氨基酸殘基。正確鑒定每次切割下來的氨基酸殘基。 其中第一步可采用化學(xué)法或酶法進(jìn)行裂解。由于化學(xué)法較之酶法具有其中第一步可采用化學(xué)法或酶法進(jìn)行裂解。由于化學(xué)法較之酶法具有裂解率高、易于自動(dòng)化、耗費(fèi)少等諸多優(yōu)點(diǎn)，被蛋白質(zhì)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室

3、普遍裂解率高、易于自動(dòng)化、耗費(fèi)少等諸多優(yōu)點(diǎn)，被蛋白質(zhì)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室普遍采用，可以從蛋白質(zhì)和多肽的采用，可以從蛋白質(zhì)和多肽的N端進(jìn)行裂解，也可以從端進(jìn)行裂解，也可以從C端進(jìn)行分析。端進(jìn)行分析。 第二步通常是在氨基酸殘基上衍生了一個(gè)生色基團(tuán)，通過高效液相色第二步通常是在氨基酸殘基上衍生了一個(gè)生色基團(tuán)，通過高效液相色譜進(jìn)行分離分析。譜進(jìn)行分離分析。 本章將就蛋白質(zhì)和多肽的本章將就蛋白質(zhì)和多肽的N端、端、C端氨基酸序列分析端氨基酸序列分析的原理和方法、進(jìn)行序列分析前蛋白質(zhì)和多肽樣品的準(zhǔn)備作一介紹。的原理和方法、進(jìn)行序列分析前蛋白質(zhì)和多肽樣品的準(zhǔn)備作一介紹。第一節(jié)第一節(jié) N端分析原理端分析原理一、耦一、耦

4、聯(lián)聯(lián) 蛋白質(zhì)和多肽的自由蛋白質(zhì)和多肽的自由氨基經(jīng)與異硫氰酸苯酯氨基經(jīng)與異硫氰酸苯酯(PITC)試試劑耦聯(lián)后，與其緊鄰的第二個(gè)殘基的鍵合力大大減弱，很容劑耦聯(lián)后，與其緊鄰的第二個(gè)殘基的鍵合力大大減弱，很容易斷裂。易斷裂。二、裂二、裂 解解 在無水條件下酸裂解，僅僅切下反應(yīng)的那個(gè)殘基。緊挨的在無水條件下酸裂解，僅僅切下反應(yīng)的那個(gè)殘基。緊挨的第二個(gè)氨基酸殘基暴露出自由的第二個(gè)氨基酸殘基暴露出自由的氨基，又可與氨基，又可與PITC進(jìn)行進(jìn)行耦聯(lián)反應(yīng)。耦聯(lián)反應(yīng)。三、轉(zhuǎn)三、轉(zhuǎn) 化化 ATZ氨基酸不穩(wěn)定，在三氟乙酸水溶液氨基酸不穩(wěn)定，在三氟乙酸水溶液(25)中可轉(zhuǎn)化中可轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的成穩(wěn)定的PTH氨基酸。氨基酸

5、。第二節(jié)第二節(jié) N端蛋白質(zhì)序列儀端蛋白質(zhì)序列儀三、氣相序列儀三、氣相序列儀 自動(dòng)化蛋白質(zhì)序列儀剛問世時(shí)，需要樣品量為自動(dòng)化蛋白質(zhì)序列儀剛問世時(shí)，需要樣品量為12mg。1978年年Tarr等將一種四級(jí)銨鹽聚合物等將一種四級(jí)銨鹽聚合物“polybrene”引入了蛋白質(zhì)、多肽的序列測(cè)引入了蛋白質(zhì)、多肽的序列測(cè)定，它能和肽鏈中的極性基團(tuán)作用定，它能和肽鏈中的極性基團(tuán)作用(非共價(jià)鍵合非共價(jià)鍵合)而將蛋白質(zhì)和多肽有效而將蛋白質(zhì)和多肽有效地固定在玻璃纖維支持膜上，防止了萃取時(shí)樣品的損失。為了適應(yīng)分子地固定在玻璃纖維支持膜上，防止了萃取時(shí)樣品的損失。為了適應(yīng)分子生物學(xué)對(duì)蛋白質(zhì)微量分析的要求，生物學(xué)對(duì)蛋白質(zhì)微量

6、分析的要求，20世紀(jì)世紀(jì)80年代初，年代初，Hewick及及Hunkpillar等人改進(jìn)了自動(dòng)化蛋白質(zhì)序列儀中的儀器結(jié)構(gòu)，它用彈筒型等人改進(jìn)了自動(dòng)化蛋白質(zhì)序列儀中的儀器結(jié)構(gòu)，它用彈筒型玻璃反應(yīng)室玻璃反應(yīng)室(內(nèi)部體積約內(nèi)部體積約0.05m1)代替了液相序列儀中的旋轉(zhuǎn)玻璃杯，用代替了液相序列儀中的旋轉(zhuǎn)玻璃杯，用polybrene固定樣品，固定樣品，Edamn降解反應(yīng)中有的試劑如三甲胺以氣體方式降解反應(yīng)中有的試劑如三甲胺以氣體方式輸送，其他試劑以流動(dòng)或液相脈沖方式輸送。此儀器較之以前幾種序列輸送，其他試劑以流動(dòng)或液相脈沖方式輸送。此儀器較之以前幾種序列儀具有以下明顯優(yōu)點(diǎn)：儀具有以下明顯優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高

7、，耗費(fèi)樣品量少，通常僅需靈敏度高，耗費(fèi)樣品量少，通常僅需50100pmol；試劑和溶劑消耗少，大約是液相序列儀的試劑和溶劑消耗少，大約是液相序列儀的l10，降低了費(fèi)用；，降低了費(fèi)用；縮短了每步降解循環(huán)時(shí)間，提高了分析效率?？s短了每步降解循環(huán)時(shí)間，提高了分析效率。 20世紀(jì)世紀(jì)80年代末又對(duì)氣相序列儀進(jìn)行了部分改進(jìn)，即將原來三氟乙酸年代末又對(duì)氣相序列儀進(jìn)行了部分改進(jìn)，即將原來三氟乙酸以氣體方式輸送改為液相脈沖方式，稱為脈沖液相序列儀，以適應(yīng)不同以氣體方式輸送改為液相脈沖方式，稱為脈沖液相序列儀，以適應(yīng)不同樣品的分析需要。另外，由于載有活性基團(tuán)的功能性樣品的分析需要。另外，由于載有活性基團(tuán)的功能性

8、PVDF膜的問世，膜的問世，蛋白質(zhì)和多肽可以共價(jià)固定在此類膜上，直接在上述兩種序列儀上進(jìn)行蛋白質(zhì)和多肽可以共價(jià)固定在此類膜上，直接在上述兩種序列儀上進(jìn)行固相序列分析。固相序列分析。 在這兩種序列儀中，在這兩種序列儀中，Edman降解后的降解后的PTH氨基酸衍生物可及時(shí)直接氨基酸衍生物可及時(shí)直接從轉(zhuǎn)化腔中自動(dòng)輸入高效液相色譜儀中進(jìn)行從轉(zhuǎn)化腔中自動(dòng)輸入高效液相色譜儀中進(jìn)行PTH氨基酸衍生物的定性及氨基酸衍生物的定性及定量分析，這樣不僅快速可靠，而且防止了樣品的損失。這兩臺(tái)儀器統(tǒng)一定量分析，這樣不僅快速可靠，而且防止了樣品的損失。這兩臺(tái)儀器統(tǒng)一用電腦控制，包括化學(xué)反應(yīng)和分析鑒定以及數(shù)據(jù)的自動(dòng)記錄和處

9、理。圖用電腦控制，包括化學(xué)反應(yīng)和分析鑒定以及數(shù)據(jù)的自動(dòng)記錄和處理。圖4.2為標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)PTH氨基酸的色譜分離圖。由圖可見，欲在氨基酸的色譜分離圖。由圖可見，欲在20min內(nèi)將各組分內(nèi)將各組分較好分離，需選擇合適的色譜條件，表較好分離，需選擇合適的色譜條件，表4.1列出了各種條件的改變導(dǎo)致個(gè)列出了各種條件的改變導(dǎo)致個(gè)別組分位置的遷移及圖譜的改善。別組分位置的遷移及圖譜的改善。第三節(jié)第三節(jié) 影響影響N端端Edman反應(yīng)裂解率的因素反應(yīng)裂解率的因素 在測(cè)序中往往可以發(fā)現(xiàn)，即使在測(cè)序中往往可以發(fā)現(xiàn)，即使N端很均一的蛋白質(zhì)端很均一的蛋白質(zhì)(第一個(gè)循環(huán)出現(xiàn)單第一個(gè)循環(huán)出現(xiàn)單個(gè)氨基酸殘基個(gè)氨基酸殘基)，經(jīng)過

10、十幾個(gè)循環(huán)后背景明顯不及第一個(gè)殘基清晰。這是，經(jīng)過十幾個(gè)循環(huán)后背景明顯不及第一個(gè)殘基清晰。這是由于由于Edman反應(yīng)是一個(gè)化學(xué)過程，在其耦聯(lián)、裂解、轉(zhuǎn)化等步驟都有可反應(yīng)是一個(gè)化學(xué)過程，在其耦聯(lián)、裂解、轉(zhuǎn)化等步驟都有可能發(fā)生一些副反應(yīng)，從而影響最終裂解效率。目前最佳產(chǎn)率為能發(fā)生一些副反應(yīng)，從而影響最終裂解效率。目前最佳產(chǎn)率為9598。因此，經(jīng)過。因此，經(jīng)過50次循環(huán)后，次循環(huán)后，PTH氨基酸分析譜中將出現(xiàn)較多雜峰，氨基酸分析譜中將出現(xiàn)較多雜峰，影響正確辨認(rèn)，也就是說對(duì)于一般蛋白質(zhì)最多能分析至影響正確辨認(rèn)，也就是說對(duì)于一般蛋白質(zhì)最多能分析至N端第端第50個(gè)氨基個(gè)氨基酸左右，欲知全順序，則需將蛋白質(zhì)

11、降解成一系列肽段分析后再拼接。酸左右，欲知全順序，則需將蛋白質(zhì)降解成一系列肽段分析后再拼接。對(duì)于有些蛋白質(zhì)由于含有較多的對(duì)對(duì)于有些蛋白質(zhì)由于含有較多的對(duì)Edman反應(yīng)敏感的殘基或肽鍵，裂反應(yīng)敏感的殘基或肽鍵，裂解效率將更低。解效率將更低。循環(huán)至循環(huán)至Ser和和Thr時(shí)產(chǎn)率突然降低，這是因?yàn)樵谶M(jìn)行這兩個(gè)氨基酸殘基時(shí)產(chǎn)率突然降低，這是因?yàn)樵谶M(jìn)行這兩個(gè)氨基酸殘基分析前一個(gè)循環(huán)中，三氟乙酸除起裂解作用外，可能與分析前一個(gè)循環(huán)中，三氟乙酸除起裂解作用外，可能與Ser和和Thr上的羥上的羥基反應(yīng)，繼而部分封閉基反應(yīng)，繼而部分封閉Ser和和Thr的的N端端氨基。氨基。另外，絲氨酸和蘇氨酸的另外，絲氨酸和蘇氨

12、酸的PTI-汀生物也會(huì)部分轉(zhuǎn)化成其他產(chǎn)物，造汀生物也會(huì)部分轉(zhuǎn)化成其他產(chǎn)物，造成產(chǎn)率的降低。成產(chǎn)率的降低。 耦聯(lián)試劑耦聯(lián)試劑PITC本身也將發(fā)生下列副反應(yīng)，形成一些本身也將發(fā)生下列副反應(yīng)，形成一些“雜質(zhì)雜質(zhì)”。測(cè)序完。測(cè)序完成成后，電腦將每個(gè)循環(huán)的產(chǎn)率處理，得出起始產(chǎn)率后，電腦將每個(gè)循環(huán)的產(chǎn)率處理，得出起始產(chǎn)率(initial yield)和重復(fù)產(chǎn)和重復(fù)產(chǎn)率率 (repetitive yield)，其中通過起始產(chǎn)率可以估計(jì)蛋白質(zhì)的真實(shí)含量，其中通過起始產(chǎn)率可以估計(jì)蛋白質(zhì)的真實(shí)含量，有時(shí)可以推測(cè)有時(shí)可以推測(cè)N端是否封閉端是否封閉(和氨基酸組成分析測(cè)得的含量相差甚遠(yuǎn)和氨基酸組成分析測(cè)得的含量相差甚遠(yuǎn)

13、)，而，而重復(fù)產(chǎn)率則表明機(jī)器是否正常運(yùn)轉(zhuǎn)。另外，如果蛋白質(zhì)或多肽中含有重復(fù)產(chǎn)率則表明機(jī)器是否正常運(yùn)轉(zhuǎn)。另外，如果蛋白質(zhì)或多肽中含有過多的過多的Ser、Thr、Glu、Trp等氨基酸殘基，也將降低這兩個(gè)數(shù)值。等氨基酸殘基，也將降低這兩個(gè)數(shù)值。第六節(jié)第六節(jié) C端序列分析端序列分析 雖然建立在雖然建立在Edman化學(xué)法上的自動(dòng)化化學(xué)法上的自動(dòng)化N端測(cè)序技術(shù)日趨成熟，但仍端測(cè)序技術(shù)日趨成熟，但仍有不少問題需借助有不少問題需借助C端序列分析來解決。端序列分析來解決。C端測(cè)序尤其適合于基因重組蛋端測(cè)序尤其適合于基因重組蛋白是否正確表達(dá)的鑒定和大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)的質(zhì)量控制、白是否正確表達(dá)的鑒定和大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)的質(zhì)量

14、控制、N端封閉蛋白的分端封閉蛋白的分析以及析以及DNA探針的設(shè)計(jì)。探針的設(shè)計(jì)。 由于選擇性對(duì)由于選擇性對(duì)C端羧基進(jìn)行耦聯(lián)修飾并從端羧基進(jìn)行耦聯(lián)修飾并從C端逐一將氨基酸殘基切下端逐一將氨基酸殘基切下較較N端測(cè)序困難，在過去的近端測(cè)序困難，在過去的近20年里，雖然為數(shù)不少的蛋白質(zhì)化學(xué)家致年里，雖然為數(shù)不少的蛋白質(zhì)化學(xué)家致力于力于C端測(cè)序研究，但目前仍不能和端測(cè)序研究，但目前仍不能和N端測(cè)序技術(shù)程度媲美。蛋白質(zhì)化學(xué)端測(cè)序技術(shù)程度媲美。蛋白質(zhì)化學(xué)工作者曾利用羧肽酶分析工作者曾利用羧肽酶分析C端氨基酸殘基，但是由于不同的羧肽酶對(duì)個(gè)端氨基酸殘基，但是由于不同的羧肽酶對(duì)個(gè)別氨基酸殘基有選擇性，使用時(shí)仍有一定

15、困難。別氨基酸殘基有選擇性，使用時(shí)仍有一定困難。 最近，由于對(duì)化學(xué)法測(cè)定最近，由于對(duì)化學(xué)法測(cè)定C端技術(shù)進(jìn)行了一系列改進(jìn)，已有了自動(dòng)化端技術(shù)進(jìn)行了一系列改進(jìn)，已有了自動(dòng)化C端序列儀問世。所以介紹一種自動(dòng)化端序列儀問世。所以介紹一種自動(dòng)化C端測(cè)序方法的原理及應(yīng)用。端測(cè)序方法的原理及應(yīng)用。一、一、C端分析原理端分析原理 基于與基于與N端端Edman降解類似的原理，降解類似的原理，C端分析采用化學(xué)試端分析采用化學(xué)試劑與蛋白質(zhì)和多肽的劑與蛋白質(zhì)和多肽的羧基反應(yīng)，反應(yīng)后的羧基反應(yīng)，反應(yīng)后的C端衍生物被端衍生物被切割下來，通過切割下來，通過HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分離分析。系統(tǒng)進(jìn)行分離分析。一個(gè)完整的一個(gè)完整的C端

16、序列分析包括以下幾個(gè)步驟：端序列分析包括以下幾個(gè)步驟： (1)活化活化 蛋白質(zhì)和多肽蛋白質(zhì)和多肽C端的自由羧基與乙酸酐反應(yīng)生成混合酸酐，并進(jìn)一步端的自由羧基與乙酸酐反應(yīng)生成混合酸酐，并進(jìn)一步環(huán)化成嗯唑酮，而側(cè)鏈上的羧基形成的混合酸酐難以成環(huán)。環(huán)化成嗯唑酮，而側(cè)鏈上的羧基形成的混合酸酐難以成環(huán)。C端的嗯唑端的嗯唑酮在硫氰四丁銨的作用下，轉(zhuǎn)化為乙內(nèi)酰硫脲酮在硫氰四丁銨的作用下，轉(zhuǎn)化為乙內(nèi)酰硫脲(thiohydantoin，TH)。(2)酰胺化保護(hù)側(cè)鏈羧基酰胺化保護(hù)側(cè)鏈羧基 側(cè)鏈羧基形成混合酸酐后，與硫氰哌啶進(jìn)一步作用形成酰側(cè)鏈羧基形成混合酸酐后，與硫氰哌啶進(jìn)一步作用形成酰胺，以保護(hù)側(cè)鏈。胺，以保護(hù)

17、側(cè)鏈。(3)烷基化烷基化 由于由于C端環(huán)化形成的端環(huán)化形成的TH衍生物較為穩(wěn)定而不易被切割，因衍生物較為穩(wěn)定而不易被切割，因此產(chǎn)率不高。用溴甲基萘選擇性地烷基化修飾硫原子，形成此產(chǎn)率不高。用溴甲基萘選擇性地烷基化修飾硫原子，形成Alkylated-TH(ATH)衍生物，裂解產(chǎn)率將大大提高。衍生物，裂解產(chǎn)率將大大提高。(4)修飾修飾Thr和和Ser的羥基的羥基 蛋白質(zhì)和多肽中的羥基會(huì)干擾測(cè)序，因此需要修飾。在活蛋白質(zhì)和多肽中的羥基會(huì)干擾測(cè)序，因此需要修飾。在活化過程中，乙酸酐也會(huì)與羥基反應(yīng)將其乙?；?，但反應(yīng)不完化過程中，乙酸酐也會(huì)與羥基反應(yīng)將其乙?；?，但反應(yīng)不完全，在全，在N甲基咪唑甲基咪唑(N

18、Ml)和乙酸酐的共同作用下，和乙酸酐的共同作用下，Thr和和Ser上的羥基基本被乙?；Ｉ系牧u基基本被乙?；?5)裂解和衍生裂解和衍生 C端的端的ATH衍生物在酸性條件下與衍生物在酸性條件下與NCS反應(yīng)而被反應(yīng)而被裂解生成裂解生成ATH氨基酸，新的氨基酸，新的C端自動(dòng)形成端自動(dòng)形成TH，而不必重新，而不必重新活化?；罨?因此，整個(gè)測(cè)序過程只需在開始時(shí)對(duì)因此，整個(gè)測(cè)序過程只需在開始時(shí)對(duì)C端進(jìn)行一次性活端進(jìn)行一次性活化，并修飾化，并修飾Asp和和Glu側(cè)鏈羧基以及側(cè)鏈羧基以及The和和Ser的羥基。實(shí)的羥基。實(shí)際上，循環(huán)反應(yīng)的只有烷基化和裂解兩步，其全過程圖解如際上，循環(huán)反應(yīng)的只有烷基化和裂解

19、兩步，其全過程圖解如下圖。下圖。二、二、C端蛋白質(zhì)序列儀端蛋白質(zhì)序列儀 近年來，已有商品化的近年來，已有商品化的C端序列儀問世。端序列儀問世。C端序列儀一般端序列儀一般由由N端序列儀改裝而成，其基本結(jié)構(gòu)與后者相似，兩者的不端序列儀改裝而成，其基本結(jié)構(gòu)與后者相似，兩者的不同之處主要在于：同之處主要在于： 反應(yīng)所用的試劑不同，因此兩者不可兼容，否則極易堵反應(yīng)所用的試劑不同，因此兩者不可兼容，否則極易堵塞管道；塞管道； 在在C端序列儀中，所有的化學(xué)反應(yīng)均在彈筒型反應(yīng)室中端序列儀中，所有的化學(xué)反應(yīng)均在彈筒型反應(yīng)室中進(jìn)行，切割下來的進(jìn)行，切割下來的ATHAA僅在轉(zhuǎn)化腔內(nèi)干燥和溶解后即僅在轉(zhuǎn)化腔內(nèi)干燥和溶

20、解后即進(jìn)入進(jìn)入HPLC系統(tǒng)分離分析；而在系統(tǒng)分離分析；而在N端測(cè)序儀中，端測(cè)序儀中，ATZ AA需需在轉(zhuǎn)化腔中轉(zhuǎn)化為在轉(zhuǎn)化腔中轉(zhuǎn)化為PTH-AA。四、影響四、影響C端測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)率的因素端測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)率的因素 C端測(cè)序副反應(yīng)較多，最高初始產(chǎn)率僅為端測(cè)序副反應(yīng)較多，最高初始產(chǎn)率僅為20，而對(duì)于，而對(duì)于Glu，Asp，Ser，Thr等氨基酸，其產(chǎn)率將更低。如等氨基酸，其產(chǎn)率將更低。如C端富含上述幾種氨基酸，測(cè)序端富含上述幾種氨基酸，測(cè)序?qū)⑹掷щy。另外，一旦遇到將十分困難。另外，一旦遇到Pro，由于吡咯環(huán)的存在而不能與乙酸酐，由于吡咯環(huán)的存在而不能與乙酸酐反應(yīng)成環(huán)，整個(gè)測(cè)序過程將終止。反應(yīng)成環(huán)，整個(gè)測(cè)

21、序過程將終止。 到目前為止，到目前為止，C端測(cè)序可測(cè)端測(cè)序可測(cè)110個(gè)殘基，一次測(cè)序需要的量比個(gè)殘基，一次測(cè)序需要的量比N端測(cè)端測(cè)序要大得多，至少需序要大得多，至少需1nmol。 此外，因?yàn)椴煌陌被岱磻?yīng)產(chǎn)率不同，所以，對(duì)圖譜的分析也比此外，因?yàn)椴煌陌被岱磻?yīng)產(chǎn)率不同，所以，對(duì)圖譜的分析也比N端測(cè)序復(fù)雜，需要較多的經(jīng)驗(yàn)。目前端測(cè)序復(fù)雜，需要較多的經(jīng)驗(yàn)。目前C端測(cè)序結(jié)果最好的一個(gè)樣品是馬端測(cè)序結(jié)果最好的一個(gè)樣品是馬肌紅蛋白原，可測(cè)肌紅蛋白原，可測(cè)C端端10個(gè)以上殘基，通常將其作為標(biāo)準(zhǔn)樣品來判斷儀個(gè)以上殘基，通常將其作為標(biāo)準(zhǔn)樣品來判斷儀器的穩(wěn)定性。器的穩(wěn)定性。 另外，由于副反應(yīng)的存在，有的氨基酸將生成不止一種另外，由于副反應(yīng)的存在，有的氨基酸將生成不止一