微波輔助提取-高效液相色譜法測(cè)定蔬果中的Vc含量

1、微波輔助提取-高效液相色譜法測(cè)定蔬果中的Vc含量微波輔助提取-高效液相色譜法測(cè)定蔬果中的維生素C含量化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室 中山大學(xué)分析科學(xué)研究所，廣東510275* 通訊作者，Email:Bgalang摘要 本實(shí)驗(yàn)用微波輔助提取三種不同水果中的維生素C，采用高效液相色譜法通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量法，借助紫外可見(jiàn)光分析，在265nm的波長(zhǎng)下測(cè)定維生素C的吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較，以保留時(shí)間來(lái)定性、峰面積定量。實(shí)驗(yàn)測(cè)得：在5-100mg/L范圍內(nèi)，維生素C濃度與峰面積具有很好的線性關(guān)系（A=32074c/（mg/L）-34595，R2=0.9999）本實(shí)驗(yàn)測(cè)得每100g橘子、金桔、蘋(píng)果中的維生素C含

2、量分別為：29.73mg/100g、33.66mg/100g、2.24mg/100g。該操作方法簡(jiǎn)單方便，靈敏迅速，準(zhǔn)確度比較好。關(guān)鍵詞 維生素C 微波輔助提取 高效液相色譜 標(biāo)準(zhǔn)曲線1引言維生素C，又叫L-抗壞血酸，化學(xué)式C6H8O6，是一種水溶性維生素。食物中的維生素C被人體小腸上段吸收，一旦吸收，就分布到體內(nèi)所有的水溶性結(jié)構(gòu)中。正常成人體內(nèi)的維生素C代謝活性池中約有1500mg維生素C，最高儲(chǔ)存峰值為3000mg。正常情況下，維生素C絕大部分在體內(nèi)經(jīng)代謝分解成草酸或與硫酸結(jié)合生成抗壞血酸-2-硫酸由尿排出；另一部分可直接由尿排出體外。（摘自維生素C的主要作用是提高免疫力，預(yù)防癌癥、心臟病

3、、中風(fēng)，保護(hù)牙齒和牙齦等。另外，堅(jiān)持按時(shí)服用維生素C還可以使皮膚黑色素沉著減少，從而減少黑斑和雀斑，使皮膚白皙。富含維生素C的食物有花菜、青辣椒、橙子、葡萄汁、西紅柿等，可以說(shuō)，在所有的蔬菜、水果中，維生素C含量都不少。美國(guó)專(zhuān)家認(rèn)為，每人每天維生素C的最佳用量應(yīng)為200300毫克，最低不少于 60毫克，半杯（大約一百毫升）新鮮橙汁便可滿(mǎn)足這個(gè)最低量。而中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)建議的膳食參考攝入量（RNI），成年人為100mg/日，可耐受最高攝入量（UL）為1000mg/日。維生素C在體內(nèi)參與多種反應(yīng)，如氧化還原過(guò)程，在生物氧化和還原作用以及細(xì)胞呼吸中起重要作用。人體內(nèi)缺乏維生素C時(shí)容易導(dǎo)致壞血病。同時(shí)，由

4、于維生素C是一種水溶性的抗氧化劑，可參與膠原蛋白的合成，它同時(shí)還具有防癌、預(yù)防動(dòng)脈硬化、治療貧血、抗氧化和提高人體免疫力等功效。維生素C在蔬果中普遍存在，尤其是柑桔類(lèi)水果中含量較高。櫻桃、番石榴、辣椒、獼猴桃等水果中Vc含量在50-300 mg/100 g。詳細(xì)含量如下：（摘自排名食物質(zhì)量(g)數(shù)量維生素C含量(mg)1櫻桃5012粒4502番石榴801個(gè)2163紅椒801/3個(gè)1364黃椒801/3個(gè)1205柿子1501個(gè)1056青花菜61/4株967草莓1006粒808橘子1301個(gè)789芥藍(lán)菜花601/3株7210獼猴桃1001個(gè)68維生素C含量的經(jīng)典測(cè)定方法有碘量法武漢大學(xué).分析化學(xué)實(shí)

5、驗(yàn)室（第三版）北京:高等教育出版社，1997：167-175.、熒光法邵曉芬，張韻慧.譜學(xué)與光譜分析，1994.14(2)：125-130. ，隨著儀器分析方法的發(fā)展，有文獻(xiàn)采用鄰二氮菲分光光度法間接測(cè)定魏玲，呂曉琴，李學(xué)琴.鄰二氮菲分光光度法間接測(cè)定藥片中維生素C的含量. 昌吉學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，2：110-112. ，也有通過(guò)與高錳酸鉀反應(yīng)的分光光度法測(cè)定的閏家偉， 黃運(yùn)瑞.分光光度法測(cè)定藥片中維生素的含量. 南陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，4(12)：54-55. 。之前課程也采用過(guò)庫(kù)侖滴定法對(duì)維生素C藥片進(jìn)行維生素C含量，效果頗佳，快速簡(jiǎn)便。不過(guò)對(duì)于庫(kù)侖滴定法利用的是氧化還原原理，所測(cè)結(jié)果

6、實(shí)際上是體系中的還原性物質(zhì)的維生素C當(dāng)量，對(duì)于復(fù)雜體系中存在的其他還原劑，并沒(méi)有很好的區(qū)分作用，例如在測(cè)定蘋(píng)果汁維生素C含量的時(shí)候，蘋(píng)果汁中存在的亞鐵離子會(huì)使庫(kù)侖滴定法結(jié)果過(guò)高。因此，在含有其他還原性物質(zhì)的復(fù)雜體系中，需要采用更精密的方法，本實(shí)驗(yàn)采用的是微博提取高效液相色譜法。樣品的預(yù)處理是樣品分析最為關(guān)鍵的步驟之一，尤其是分析復(fù)雜的樣品時(shí)，樣品的預(yù)處理是必不可少的。所以，發(fā)展快速、高效的樣品前處理方法是分析家們一直追求的目標(biāo)。傳統(tǒng)的樣品前處理的方法如索氏抽提、超聲波萃取等不僅費(fèi)時(shí)，而且溶劑的消耗量大。微波輔助萃取(Microwave Assisted Extraction ，MAE) 具有快

7、速、高效、省溶劑、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。微波技術(shù)開(kāi)始主要是用于無(wú)機(jī)分析的樣品預(yù)處理即微波消化，從1986 年起微波能開(kāi)始應(yīng)用到有機(jī)分析中的樣品預(yù)處理李核，李攻科，張展霞.微波輔助萃取技術(shù)的進(jìn)展.1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co.，Ltd.即微波輔助萃取。十幾年來(lái)，MAE技術(shù)在有機(jī)分析中得到了廣泛的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)采用MAE技術(shù)來(lái)萃取水果中的維生素C。MAE是指利用微波能強(qiáng)化溶劑萃取效率，即利用微波加熱來(lái)加速溶劑對(duì)固體樣品中目標(biāo)萃取物(主要是有機(jī)化合物) 的萃取過(guò)程。微波具有波動(dòng)性、高頻特性以及熱特性或非熱特性(生物效應(yīng)) 等特點(diǎn) 5。MAE具有以下優(yōu)

8、點(diǎn)：1、快速高效：樣品及溶劑中的偶極分子在高頻微波能的作用下，以109/s 圈的速度變換其正、負(fù)極，產(chǎn)生偶極渦流、離子傳導(dǎo)和高頻率摩擦，從而在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的熱量。偶極分子旋轉(zhuǎn)導(dǎo)致的弱氫鍵破裂、離子遷移等加速了溶劑分子對(duì)樣品基體的滲透，待分析成分很快溶劑化，使微波萃取時(shí)間顯著縮短。2、加熱均勻：微波加熱是透入物料內(nèi)部的能量被物料吸收轉(zhuǎn)換成熱能對(duì)物料加熱，形成獨(dú)特的物料受熱方式，整個(gè)物料被加熱，無(wú)溫度梯度，即微波加熱具有均勻性的優(yōu)點(diǎn)。3、微波加熱具有選擇性：微波對(duì)介電性質(zhì)不同的物料呈現(xiàn)出選擇性的加熱特點(diǎn)，介電常數(shù)及介質(zhì)損耗小的物料，對(duì)微波的入射可以說(shuō)是“透明”的。溶質(zhì)和溶劑的極性越大，對(duì)微波能

9、的吸收越大，升溫越快，促進(jìn)了萃取速度。而對(duì)于不吸收微波的非極性溶劑，微波幾乎不起加熱作用。所以，在選擇萃取劑時(shí)一定要考慮到溶劑的極性，以達(dá)到最佳效果。4、生物效應(yīng)（非熱效應(yīng))：由于大多數(shù)生物體內(nèi)含有極性水分子，在微波場(chǎng)的作用下引起強(qiáng)烈的極性震蕩，從而導(dǎo)致細(xì)胞分子間氫鍵松弛，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)電擊穿破裂，加速了溶劑分子對(duì)基體的滲透和待提取成分的溶劑化。因此，利用MAE 從生物基體萃取待分析的成分時(shí)，能提高萃取效率。高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography HPLC）又稱(chēng)“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。高效液相

10、色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)。高效液相色譜法有“三高一廣一快”的特點(diǎn)胡琴，黃慶華主編.分析化學(xué).第354頁(yè).科學(xué)出版社，2009年.： 1、高壓：流動(dòng)相為液體，流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，為了能迅速通過(guò)色譜柱，必須對(duì)載液加高壓。 2、高效：分離效能高?？蛇x擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。 3

11、、高靈敏度：紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng，進(jìn)樣量在L數(shù)量級(jí)。 4、應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢(shì)。 5、分析速度快、載液流速快：較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個(gè)樣品在1530分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時(shí)。 此外高效液相色譜還有色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點(diǎn)，但也有缺點(diǎn)，與氣相色譜相比各有所長(zhǎng)，相互補(bǔ)充。高效液相色譜的缺點(diǎn)是有“柱外效應(yīng)”。在從進(jìn)樣到檢測(cè)器之間，除了柱子以外的任何死空間（進(jìn)樣器、柱接頭、連接管和檢測(cè)池等）中，如果流動(dòng)相的流型有變化，被分離物

12、質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留都會(huì)顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測(cè)器的靈敏度不及氣相色譜。定量測(cè)定時(shí)，可根據(jù)樣品的具體情況采用峰面積法或峰高法。但用歸一法或內(nèi)標(biāo)法測(cè)定雜質(zhì)總量時(shí)，須采用峰面積法。 測(cè)定供試品（或經(jīng)衍生化處理的供試品）中各雜質(zhì)及雜質(zhì)的總量限度采用不加校正因子的峰面積歸一法。計(jì)算各雜質(zhì)峰面積及其總和，并求出占總峰面積的百分率。但溶劑峰不計(jì)算在內(nèi)。色譜硅膠圖的記錄時(shí)間應(yīng)根據(jù)各品種所含雜質(zhì)的保留時(shí)間決定，除另有規(guī)定外可為該品種項(xiàng)下主成分保留時(shí)間的倍數(shù)。 當(dāng)雜質(zhì)峰面積與成分峰面積相差懸殊時(shí)，采用主成分自身對(duì)照法魏福祥主編.儀器分析及應(yīng)用.第194頁(yè).中國(guó)石化出版社，2007年。在

13、測(cè)定前，先按各品種項(xiàng)下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品稀釋成一定濃度的溶液作為對(duì)照溶液，進(jìn)樣，調(diào)節(jié)檢測(cè)器的靈敏度或進(jìn)樣量，使對(duì)照溶液中的主成分色譜峰面積滿(mǎn)足準(zhǔn)確測(cè)量要求。然后取供試品溶液，進(jìn)樣，記錄時(shí)間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分保留時(shí)間的倍數(shù)。根據(jù)測(cè)得的供試品溶液的各雜質(zhì)峰面積及其總和并和對(duì)照溶液主成分的峰面積比較，計(jì)算雜質(zhì)限度。 測(cè)定供試品中雜質(zhì)的總量限度采用不加校正因子的峰面積法，即內(nèi)標(biāo)法劉立行主編.儀器分析（第二版）.第71頁(yè). 中國(guó)石化出版社，2008年附錄：思考題（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法有何優(yōu)缺點(diǎn)？液相色譜法中常用的定性定量方法有哪些？ 答：標(biāo)準(zhǔn)曲線法的優(yōu)點(diǎn)是：繪制好標(biāo)準(zhǔn)工作曲線后直接從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

14、上讀出含量，適合于不同樣品的分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線法的缺點(diǎn)是：需要配制各濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液并準(zhǔn)確測(cè)定；每次樣品分析的色譜條件（檢測(cè)器的響應(yīng)性能，柱溫，流動(dòng)相流速及組成，進(jìn)樣量，柱效等）很難完全相同，因此容易出現(xiàn)較大誤差；標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制時(shí)，一般使用欲測(cè)組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品（或已知準(zhǔn)確含量的樣品），而實(shí)際樣品的組成有差別，因此必將給測(cè)量帶來(lái)一定的誤差。液相色譜法中常用的定性方法有：直接利用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)照定性(用已知物質(zhì)直接和未知樣品對(duì)照定性是液相色譜定性分析中最簡(jiǎn)便、可行的定性方法。在一定的色譜條件下,各種物質(zhì)均有確定不變的保留時(shí)間,故保留時(shí)間可作為定性指標(biāo))、與其它儀器結(jié)合進(jìn)行定性（液相色譜法對(duì)未知物直接進(jìn)行定性

15、有一定難度,而某些儀器,如質(zhì)譜、紅外光譜、核磁共振等是鑒定未知物結(jié)構(gòu)的有效工具。通過(guò)將色譜與質(zhì)譜等聯(lián)用,互相取長(zhǎng)補(bǔ)短,使較復(fù)雜的混合物先經(jīng)色譜分離成單個(gè)組分后,再通過(guò)組分特定碎片離子組成的質(zhì)譜圖對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確定性。常見(jiàn)的聯(lián)用儀器有色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,色譜- 紅外聯(lián)用儀等）、組分保留時(shí)間結(jié)合光譜圖定性（配備有光電二極管陣列檢測(cè)器的液相色譜儀,可利用色譜保留時(shí)間規(guī)律及光譜特征吸收曲線綜合進(jìn)行定性分析。配備紫外光度檢測(cè)器的液相色譜儀也可獲得分離組分的紫外吸收光譜。當(dāng)試樣組分通過(guò)流通池時(shí),短時(shí)間中斷液流,進(jìn)行快速掃描,以得到紫外吸收光譜特征吸收曲線,但是該光譜特征吸收曲線不能完整輸出,只能為定性分析提供信

16、息或據(jù)此選擇最佳檢測(cè)波長(zhǎng)）；液相色譜法中常用的定量方法有：面積歸一化法、主成分自身對(duì)照法、內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法。（2）如何快速建立未知物的液相色譜方法？一般應(yīng)考慮哪些主要因素？答：首先要知道這個(gè)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、pKa值、極性、溶解性、穩(wěn)定性（避光或低溫保存）等化學(xué)物理常數(shù)，然后選擇合適的樣品處理方法，使樣品有較好的萃取回收率和較少的干擾成分存在；而對(duì)于分離分析，如果使用紫外檢測(cè)器，在這之前應(yīng)先做個(gè)化合物的吸收波長(zhǎng)掃描，以找出其最大吸收波長(zhǎng)，然后依據(jù)峰形和化合物的pKa值進(jìn)行水相的pH值調(diào)節(jié)，以找到最佳的流動(dòng)相體系（保證了最大響應(yīng)、最少干擾、最好的分離），再進(jìn)行反相色譜實(shí)驗(yàn)，調(diào)整流動(dòng)相中有機(jī)相的比例

17、，以求得足夠的分離度、合理的操作時(shí)間以及易于檢測(cè)的譜帶。然后改用不同的色譜柱，改變溫度和流動(dòng)相pH值，優(yōu)化篩選溶劑的配比組成。（3）微波輔助萃取法為何能達(dá)到快速高效的萃取效果？ 答：樣品及溶劑中的偶極分子在高頻微波能的作用下,以109/s 圈的速度變換其正、負(fù)極,產(chǎn)生偶極渦流、離子傳導(dǎo)和高頻率摩擦,從而在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的熱量。偶極分子旋轉(zhuǎn)導(dǎo)致的弱氫鍵破裂、離子遷移等加速了溶劑分子對(duì)樣品基體的滲透,待分析成分很快溶劑化,使微波萃取時(shí)間顯著縮短。（4）試比較液相色譜法和氣相色譜法的優(yōu)缺點(diǎn)。答：液相色譜的優(yōu)點(diǎn)有：1、氣相色譜不適用于不揮發(fā)物質(zhì)和對(duì)熱不穩(wěn)定物質(zhì)，而液相色譜卻不受樣品的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性

18、的限制。有些樣品因?yàn)殡y以汽化而不能通過(guò)柱子，熱不穩(wěn)定的物質(zhì)受熱會(huì)發(fā)生分解，也不適用于氣相色譜法。這使氣相色譜法的使用范圍受到了限制。另一方面，液相色譜卻不受樣品的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制。所以液相色譜非常適合于分離生物、醫(yī)藥有關(guān)的大分子和離子型化合物，不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物，種類(lèi)繁多的其它高分子及不穩(wěn)定的化合物。2、對(duì)于很難分離的樣品，用液相色譜常比用氣相色譜容易完成分離，主要有以下三個(gè)方面的原因：液相色譜中，由于流動(dòng)相也影響分離過(guò)程，這就對(duì)分離的控制和改善提供了額外的因素。而氣相色譜中的載氣一般不影響分配，也就是說(shuō)，在液相色譜中，有兩個(gè)相與樣品分子發(fā)生選擇性的相互作用；液相色譜中具有獨(dú)特效能的柱填料

19、（固定相）的種類(lèi)較多，這樣就使固定相的選擇余地更大，從而增加了分離的可能性；液相色譜使用較低的分離溫度，分子間的相互作用在低溫時(shí)更為有效，因此降低溫度一般會(huì)提高色譜分離效率。3、和氣相色譜相比，液相色譜對(duì)樣品的回收比較容易，而且是定量的，樣品的各個(gè)組分很容易被分離出來(lái)。因此，在很多場(chǎng)合，液相色譜不僅作為一種分析方法，而且可以作為一種分離手段，用以提純和制備具有中等純度的單一物質(zhì)。在氣相色譜中所分離出的各樣品組分雖也可以回收，但一般都不太方便，而且定量性差。氣相色譜法的優(yōu)點(diǎn)有：1、分離效率高，分離速度快，操作簡(jiǎn)便。由于氣體粘度小，用其作為流動(dòng)相時(shí)樣品組分在兩相之間可很快進(jìn)行分配：氣體通過(guò)盛有固定

20、相管柱的阻力小，因此分離速度快。一根長(zhǎng)1-2m的色譜柱，一般可有幾千個(gè)理論塔板，對(duì)于長(zhǎng)柱，甚至有一百多萬(wàn)個(gè)理論塔板，這樣就可使一些分配系數(shù)很接近的、難以分離的物質(zhì)，經(jīng)過(guò)多次分配平衡，得到分離。2、樣品用量少，檢測(cè)靈敏度高。由于樣品是在氣態(tài)下分離和在氣體中進(jìn)行檢測(cè)的，有許多高靈敏度的檢測(cè)器可供使用，雖樣品用量少也能檢測(cè)出來(lái)。氣相色譜可以檢測(cè)出10-11-10-13g的物質(zhì)。3、選擇性好?？蛇x擇對(duì)樣品組分有不同作用力的液體、固體作為固定相，在適當(dāng)操作溫度下，使組分的分配系數(shù)有較大差異，從而將物理、化學(xué)性質(zhì)相近的組分分離開(kāi)。取供試品，按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法配制不含內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄

21、色譜圖I；再配制含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，在同樣的條件下注樣，記錄色譜圖。記錄的時(shí)間除另有規(guī)定外，應(yīng)為該品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)峰保留時(shí)間的倍數(shù)，色譜圖上內(nèi)標(biāo)峰高應(yīng)為記錄儀滿(mǎn)標(biāo)度的30%以上，否則應(yīng)調(diào)整注樣量或檢測(cè)器靈敏度。 如果色譜圖中沒(méi)有與色譜圖上內(nèi)標(biāo)峰保留時(shí)間相同的雜質(zhì)峰，則色譜圖中各雜質(zhì)峰面積之和應(yīng)小于內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積（溶劑峰不計(jì)在內(nèi)）。如果色譜圖中有與色譜圖上內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰保留時(shí)間相同的雜質(zhì)峰，應(yīng)將色譜圖上的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積減去色譜圖中此雜質(zhì)峰面積，即為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的校正面積；色譜圖中各雜質(zhì)峰總面積加色譜圖中此雜峰面積，即為各雜質(zhì)峰的校正總面積，各雜質(zhì)峰的校正總面積應(yīng)小于內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的校正面積。 按各

22、品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱(chēng)(量)取對(duì)照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測(cè)量對(duì)照品和供試品待測(cè)成分的峰面積（或峰高），從而計(jì)算出含量。 由于微量注射器不易精確控制進(jìn)樣量，當(dāng)采用外標(biāo)法測(cè)定供試品中某雜質(zhì)或主成分含量時(shí)，以定量環(huán)進(jìn)樣為好。本實(shí)驗(yàn)采用微波輔助萃取法快速萃取蔬果中的維生素C，采用高效液相色譜進(jìn)行分析，以維生素C標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的色譜峰面積對(duì)其濃度做校準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品中維生素C的峰面積，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度。2 材料與方法2.1儀器與試劑高效液相色譜儀：LC-20AT；微波萃取儀（上海新儀微波化學(xué)科技有限公司）；色譜柱：依利特或DikmaC18柱 (250 mm&#

23、215;4.6 mm， I.D.5 m)；進(jìn)樣柱：白云x進(jìn)樣柱。氣相色譜條件：汽化溫度為200；檢測(cè)器溫度為250；載氣（N2）總量為40 mL.min-1，分流比為30：1；氫氣和空氣流量分別為30 mL.min-1和300mL.min-1；程序升溫：初始溫度40，保持2min，升溫速率為20min-1并升至150；進(jìn)樣量0.51L。試劑：乙腈（色譜純），冰乙酸，維生素C，磷酸二氫鉀等均為分析純；橘子、金桔、蘋(píng)果等水果樣品。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。 維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液：快速準(zhǔn)確稱(chēng)取0.025 g 維生素C，用1 mol/L乙酸溶液溶解，定量轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，用1 mol/L乙酸溶液定容，得

24、到100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液備用，現(xiàn)用現(xiàn)配。色譜條件：流動(dòng)相：3%的乙腈0.05 mol/L KH2PO4水溶液（v/v）；流速1mL/min；柱溫30，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm；進(jìn)樣量10L。2.2實(shí)驗(yàn)過(guò)程1、按操作說(shuō)明開(kāi)啟液相色譜儀，設(shè)定方法參數(shù)。2、樣品準(zhǔn)備：準(zhǔn)確稱(chēng)取切碎的水果樣品（質(zhì)量在5.0g附近，記錄準(zhǔn)確質(zhì)量），以1 mol/L乙酸50 mL為萃取溶劑，微波功率設(shè)為600 W，萃取時(shí)間為10 min，萃取溫度設(shè)定為50，平行萃取兩次。萃取液過(guò)濾后用1 mol/L乙酸溶液定容至100 mL，制成供試品溶液。3、定性分析：分別取10L 50 mg/L的維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液，進(jìn)HP

25、LC分析。根據(jù)保留時(shí)間定性分析水果中的維生素C。4、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別配制5，20，50，80，100 mg/L的維生素C樣品溶液，待液相色譜穩(wěn)定后進(jìn)樣分析。以維生素C色譜峰面積對(duì)濃度作圖，繪制校準(zhǔn)曲線。5、定量分析：供試品溶液經(jīng)0.45m微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC分析。記錄其維生素C的色譜峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蔬果樣品中維生素C的含量，結(jié)果以mg/100 g表示。3 討論與結(jié)論3.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)溶液的量記錄：表一 標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC色譜數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度c /( mg·L-1)5205080100峰面積A139341591488156810325309853175985保留時(shí)間/m

26、in2.7942.8352.7682.8002.7783.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制根據(jù)峰面積對(duì)濃度作圖：Figure 1 濃度與峰面積直線圖由圖所得峰面積（A）對(duì)標(biāo)溶液濃度c的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=32074c/(mg·L-1)-34595；相關(guān)系數(shù)R2=0.9999。3.3 樣品提取液的測(cè)量結(jié)果記錄分別以橘子、金桔、蘋(píng)果三種水果的提取液為樣品進(jìn)行HPLC色譜分析，所得HPLC的色譜數(shù)據(jù)和色譜圖如下：表二 樣品的質(zhì)量及HPLC色譜數(shù)據(jù)樣品橘子金桔蘋(píng)果樣品質(zhì)量m/g5.185.135.00保留時(shí)間t/min2.8322.8092.874峰高49345110501306峰面積A4592945193

27、531215Figure 2 橘子中維生素C的HPLC色譜圖Figure 3 金桔中維生素C的HPLC色譜圖Figure 4 蘋(píng)果中維生素C的HPLC色譜圖3.4水果中Vc含量的計(jì)算將測(cè)得的各種樣品中維生素C色譜峰的峰面積代入3.2所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=32074c/(mg·L-1)-34595，從而求出各種樣品中的維生素C濃度；再根據(jù)提取液的體積（100ml）和樣品質(zhì)量，求出所測(cè)水果中的維生素C含量，結(jié)果記錄如下表。表三.樣品的數(shù)據(jù)處理表樣品橘子金桔蘋(píng)果樣品質(zhì)量m/g5.185.135.00峰面積A4592945193531215提取液中的Vc濃度c/(mg·L-1)15.4017.271.12水果中的Vc含量mg/100g29.7333.662.243.5實(shí)驗(yàn)誤差分析實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，可能出現(xiàn)的誤差分兩類(lèi)：1、系統(tǒng)誤差：高效液相色譜儀，微波萃取儀，量筒等的儀器誤差；實(shí)驗(yàn)操作個(gè)人因感官和運(yùn)動(dòng)器官的反應(yīng)或習(xí)慣不同而產(chǎn)生的誤差；2、偶然誤差：在定容量取和稱(chēng)量過(guò)程中的讀數(shù)誤差。 3.6實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析標(biāo)準(zhǔn)曲線分析：通過(guò)紫外可見(jiàn)范圍內(nèi)全波長(zhǎng)的掃描，發(fā)現(xiàn)265nm處為維生素C最大吸收峰，實(shí)測(cè)維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)時(shí)間均在2.802±0.034s的范圍之內(nèi)，最大相對(duì)誤差僅為1.