分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)理論及操作答案匯總

1、實(shí)驗(yàn)答案一、基本原理題1 限制性內(nèi)切酶有那些特點(diǎn)？1能識(shí)別雙鏈分子的某種特定核苷酸序列2使每條 DNA 鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開2、 限制性內(nèi)切酶有那些類型，我們DNA 重組時(shí)常用的是哪類？ 答：限制性內(nèi)切酶主要分成三大類。第一類限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專一的核苷酸順序，并在識(shí)別點(diǎn)附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機(jī)的。這類限制性內(nèi)切酶在DNA重組技術(shù)或基因工程中沒有多大用處，無法用于分析 DNA 結(jié)構(gòu)或克隆基因。 這類酶如 EcoB、EcoK 等。第二類限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。由于這類限制

2、性內(nèi)切酶的識(shí)別和切割的核苷酸都是專一的。所以總能得到同樣核苷酸順序的DNA 片段，并能構(gòu)建來自不同基因組的DNA 片段，形成雜合 DNA 分子。因此，這種限制性內(nèi)切酶是 DNA 重組技術(shù)中最常用的工具酶之一 。這種酶識(shí)別的專一核苷酸順序最常見的 是 4 個(gè)或6 個(gè)核苷酸，少數(shù)也有識(shí)別 5 個(gè)核苷酸以及 7 個(gè)、9 個(gè)、10 個(gè)和 11 個(gè)核苷酸的。 第二類限制性內(nèi)切酶的識(shí)別順序是一個(gè)回文對(duì)稱順序，即有一個(gè)中心對(duì)稱軸， 從這個(gè)軸朝二個(gè)方向“讀”都完全相同。這種酶的切割可以有兩種方式。一是交錯(cuò)切割，結(jié)果形成兩條單 鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。另一種是在同一位

3、置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。第三類限制性內(nèi)切酶也有專一的識(shí)別順序，但不是對(duì)稱的回文順序。它在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈。但這幾個(gè)核苷酸對(duì)則是任意的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長(zhǎng)度 DNA 片段，具有各種單鏈末端。這對(duì)于克隆基因或克隆DNA 片段沒有多大用處。3、何為細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)？是一種存在于細(xì)菌（可能還有其他原核生物），可保護(hù)個(gè)體免于外來 DNA （如噬菌體）侵入的系統(tǒng)，主要有限制內(nèi)切酶和甲基化酶組成的二元系統(tǒng)。細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)包含三個(gè)連鎖基因：（1）hsd R:編碼限制性核酸內(nèi)切酶（2）hsd M：編碼限制性甲基化酶（3）hsd S:編碼限制性酶和甲基化

4、酶的協(xié)同表達(dá)大多數(shù)限制性內(nèi)切酶常常伴隨有12 種修飾酶（DNA 甲基化酶），后者能保護(hù)細(xì)胞自身的DNA 不被限制性內(nèi)切酶破壞。修飾酶識(shí)別的位點(diǎn)與相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶相同，它們的作用 是甲基化每條鏈中的一個(gè)堿基，而不是切開DNA 鏈。甲基化所形成的甲基基團(tuán)能伸入到限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的雙螺旋大溝中，阻礙限制性內(nèi)切酶發(fā)揮作用。這樣，限制性內(nèi)切酶和它的“搭檔”修飾酶一起組成 R-M 系統(tǒng)。在某些 R-M 系統(tǒng)中，限制性內(nèi)切酶和修飾酶是兩 種不同的蛋白，它們各自獨(dú)立行使自己的功能；另一些R-M 系統(tǒng)本身就是一種大的限制 -修飾復(fù)合酶，由不同亞基或同一種亞基的不同結(jié)構(gòu)域來分別執(zhí)行限制或修飾的功能。4、說說

5、熱激轉(zhuǎn)化法和電擊轉(zhuǎn)化法的區(qū)別。電擊法：使用瞬時(shí)高壓電 （數(shù)千伏特）處理細(xì)胞懸液，微生物細(xì)胞膜在高壓電的作用下發(fā)生 去極化，產(chǎn)生微孔，懸液中溶解的核酸即可通過細(xì)胞膜上的孔洞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部?；瘜W(xué)法：使用低滲溶液處理細(xì)胞懸液(0.1M CaCI2 )，微生物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生一些變化，使得細(xì)胞在熱激時(shí)(42 度 90 秒)變得很容易從溶液中攝取DNA。具體機(jī)理目前仍然不是十分清楚，但是很有效。做電擊轉(zhuǎn)化時(shí)，懸液中有近70%的細(xì)胞會(huì)因電擊而死亡，但是這種方法很直接，轉(zhuǎn)化效率很高。當(dāng)需要高的轉(zhuǎn)化效率時(shí)，比如制作基因文庫(kù)，可以采用電擊轉(zhuǎn)化，另外，做酵母等真 核生物轉(zhuǎn)化時(shí)一般都是電擊?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化法操作簡(jiǎn)單，不需要

6、特殊設(shè)備，轉(zhuǎn)化效率足以滿足一般克隆實(shí)驗(yàn)的需要，故使用范圍非常廣。5、堿裂解法提取質(zhì)粒的基本原理是什么？在堿性條件下，染色體 DNA 和質(zhì)粒 DNA 的氫鍵斷裂，致使宿主染色體 DNA 變性，但閉合 環(huán)狀的質(zhì)粒 DNA 由于拓?fù)淅p繞而不能彼此分開。當(dāng)以 pH 4.0 的 NaAc 高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其 pH至中性時(shí)，質(zhì)粒 DNA 迅速恢復(fù)原有的構(gòu)型，重新形成超螺旋分子，保存在溶液中，而染色 體 DNA 不能復(fù)性，形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過離心，染色體 DNA、蛋白質(zhì)-SDS 復(fù)合物等 一起沉淀下來而被除去。6、CsCI 密度梯度離心的原理是什么？將質(zhì)量差異微小的分子分開。用氯化銫濃鹽液，以105g 以

7、上的強(qiáng)大離心力的作用，鹽的分子被甩到離心管的底部。同時(shí)，擴(kuò)散作用使溶液中Cs+和 CI -離子呈分散狀態(tài)，與離心力的方向相反，經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的離心， 溶液達(dá)到一種平衡狀態(tài)。反向擴(kuò)散力與沉降力之間的平衡作用，產(chǎn)生了一個(gè)連續(xù)的CsCI 濃度梯度。離心管底部溶液的密度最大，上部最小。DNA 分子溶于 CsCI 溶液中，經(jīng)過離心，將逐漸集中在一條狹窄的帶上。帶上的DNA 分子密度與該處 CsCI 相等。7、質(zhì)粒載體具備的基本要素是什么？是染色質(zhì)外的雙鏈共價(jià)閉合環(huán)形DNA、能自主復(fù)制，是能獨(dú)立復(fù)制的復(fù)制子、質(zhì)粒對(duì)宿主生存并不是必需的。必須包括三部分：遺傳標(biāo)記基因，復(fù)制區(qū)，目的基因。8、質(zhì)粒圖譜上的 MCS

8、指的是什么？MCS 多克隆位點(diǎn)(multiple cloning site ):是包含多個(gè)(最多 20 個(gè))限制性酶切位點(diǎn) (restriction site)的一段很短的 DNA 序列。也稱為多位點(diǎn)接頭(polyli nker),是基因工程中常用到的載 體質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)配置序列.MCS 中，每個(gè)限制性酶切位點(diǎn)通常是唯一的，即它們?cè)谝粋€(gè)特定的 載體質(zhì)粒中只出現(xiàn)一次。9、 按拷貝數(shù)，質(zhì)粒有哪些基本類型？我們使用的pUC19 和 pBS 屬于哪種類型？ 咼拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體ColE1、pMB1 派生質(zhì)粒具有高拷貝數(shù)的特點(diǎn)。適合大量增殖克隆基因，或需要大量表達(dá)的 基因產(chǎn)物。低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體由 pSC10

9、1 派生來的載體特點(diǎn)是分子量小的拷貝數(shù)。它有特殊的用途：當(dāng)有些被克隆的基因的表達(dá)產(chǎn)物過多時(shí)會(huì)嚴(yán)重影響寄主菌的正常代謝活動(dòng)，導(dǎo)致寄主菌的死亡時(shí)，就需要低拷貝的載體。pUC19 載體，高達(dá) 500700 個(gè)以高效克隆的 pBS-T 為載體，其目的基因拷貝數(shù)可等同pUC19 載體,高達(dá) 500700 個(gè)10、 氯霉素提高質(zhì)?？截悢?shù)的原理是什么？氯霉素是一種蛋白質(zhì)合成抑制劑，能夠抑制染色體的復(fù)制，而不影響質(zhì)粒pBR322 的復(fù)制。這樣經(jīng)過氯霉素處理使得細(xì)胞內(nèi)pBR322 得到高拷貝。11、 藍(lán)白斑篩選的基本原理是什么？藍(lán)白斑篩選是重組子篩選的一種方法：是根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如a-互補(bǔ)、抗生素

10、基因等?，F(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個(gè)大腸桿菌的DNA 的短區(qū)段，其中有3-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前 146 個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多 克隆位點(diǎn)（MCS ），它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到3-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼3-半乳糖苷酶 C 端部分序列的宿主細(xì)胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣,lacZ 基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，稱為a-互補(bǔ)。由a-互補(bǔ)而產(chǎn)生的 LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑 IPTG 的作用下，在生

11、色 底物 X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識(shí)別。然而，當(dāng)外源DNA 插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無a-互補(bǔ)能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍(lán)白斑篩選。如用藍(lán)白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣 化菌平板37C溫箱倒置培養(yǎng) 12-16hr 后，有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。12、作為受體的大腸桿菌應(yīng)該具有什么特性？遺傳背景清楚；目標(biāo)基因表達(dá)水平高；表達(dá)系統(tǒng)成熟完善；易于培養(yǎng)（培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)快、 培養(yǎng)周期短、抗污染能力強(qiáng)）、成本低;被美國(guó) FDA 批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物。缺點(diǎn)： 表達(dá)產(chǎn)物缺少飯以后的修飾（如糖基化、烷基化、磷酸化

12、、特異性的蛋白水解加工等）；同時(shí)高表達(dá)時(shí)易折疊錯(cuò)誤導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物沒有活性，而且大腸桿菌本身含有內(nèi)毒素和有毒蛋白， 可能混在產(chǎn)物里，應(yīng)用受限。真核基因在大腸桿菌中表達(dá)： 1，真核生物的啟動(dòng)子不能被原核細(xì)胞（大腸桿菌）的RNA聚合酶識(shí)別；2,真核生物的 mRNA 上沒有 SD 序列，因此不能被原核細(xì)胞核糖體結(jié)合； 3, 真核生物的基因含有內(nèi)含子，原核細(xì)胞缺乏見他們的轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行拼接加工的機(jī)制；4,真核細(xì)胞的基因產(chǎn)物，往往需要翻譯后加工，真核細(xì)胞缺乏翻譯后加工有關(guān)的酶；5,真核生物基因表達(dá)的蛋白質(zhì)易被原核細(xì)胞蛋白酶所降解。13、 轉(zhuǎn)化的概念，轉(zhuǎn)化有哪些方法？轉(zhuǎn)化（transformation ）是某一基

13、因型的細(xì)胞從周圍介質(zhì)中吸收來自另一基因型的細(xì)胞的DNA而使它的基因型和表現(xiàn)型發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象。該現(xiàn)象首先發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法主要有：高壓電穿孔法轉(zhuǎn)化大腸桿菌（電轉(zhuǎn)化法），氯化鈣法制備感受態(tài)細(xì)胞的大腸桿菌轉(zhuǎn)化法.14、 CaCl2制備感受態(tài)細(xì)胞的基本原理？目前，感受態(tài)細(xì)胞的制備常用冰預(yù)冷的CaCl2 處理細(xì)菌的方法制備，即用低滲CaCl2 溶液在低溫（0C）時(shí)處理快速生長(zhǎng)的細(xì)菌，從而獲得感受態(tài)細(xì)菌。此時(shí)細(xì)菌膨脹成球形，外源DNA 分子在此條件下易形成抗DNA 酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附在細(xì)菌表面，通過熱激作用促進(jìn)細(xì)胞對(duì) DNA 的吸收。轉(zhuǎn)化效率可達(dá) 106 107 轉(zhuǎn)化子/微克 DNA。本

14、方法的關(guān)鍵是 選用的細(xì)菌必須處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，實(shí)驗(yàn)操作必須在低溫下進(jìn)行。15、熱激轉(zhuǎn)化法的基本原理是什么?其原理是細(xì)菌處于 OC,CaCI2 的低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗 DNase（ DNA 酶）的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42C短時(shí)間熱沖擊處理，促使細(xì)胞吸收 DNA 復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增值。被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中，重組子中基因得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉(zhuǎn)化子。16、 影響感受態(tài)細(xì)胞效率的因素有哪些？1.細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)：實(shí)驗(yàn)中應(yīng)密切注視細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度，盡量使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（一般通過檢測(cè) OD600

15、來控制。DH5a菌株 OD600 為 0.5 時(shí)細(xì)胞密度是 5X107/mI ）;2.所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進(jìn)行；3.經(jīng)CaCI2 處理的細(xì)胞，在低溫條件下，一定的時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的推移而增加，24小時(shí)達(dá)到最高，之后轉(zhuǎn)化率再下降（這是由于總的活菌數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少造成的）；4.化合物及無機(jī)離子的影響： 在 Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價(jià)金屬離子（如 Mn2+或 Co2+ ）、DMSO 或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提高（100-1000 倍）;5所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化 效率；6.質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響：用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)主要是超螺

16、旋的DNA ;7.定范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率與外源DNA 的濃度呈正比；17、 利用分光光度計(jì)測(cè)定DNA 濃度的基本原理是什么？1OD 值相當(dāng)于多大濃度的雙鏈DNA ?單鏈 DNA ?單鏈 RNA ?DNA 或 RNA 鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫光區(qū)具有較強(qiáng)吸收，其吸收峰在 260nm 處。波長(zhǎng)為260nm 時(shí)，DNA 或 RNA 的光密度 OD260 不僅與總含量有關(guān)，也隨構(gòu)型而有差異。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品來說，濃度為 1 卩 g / ml 時(shí)，DNA 鈉鹽的 OD260 = 0.02 當(dāng) OD260 = 1 時(shí)，dsDNA 濃度 約為 50卩 g / ml ssDNA 濃度約為 37 卩 g / ml RNA

17、濃度約為 40 卩 g / ml 寡核苷酸濃度約為 30 卩 g / ml（youyu底物不同有差異）當(dāng) DNA 樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其他小分子污染物時(shí)，會(huì)影響DNA 吸光度的準(zhǔn)確測(cè)定。一般情況下同時(shí)檢測(cè)同一樣品的 OD260、OD280 和 OD230 ,計(jì)算其比值來衡量樣品的純度。 經(jīng)驗(yàn)值：純 DNA : OD260/OD280疋1.8（ 1.9,表明有 RNA 污染；V1。6,表明有蛋白質(zhì)、酚等污染） 純RNA : 1.7VOD260/OD280V2.0（V1.7 時(shí)表明有蛋白質(zhì)或酚污染；2.0 時(shí)表明可能有異硫氰酸殘存）若樣品不純，則比值發(fā)生變化，此時(shí)無法用分光光度法對(duì)核酸進(jìn)行定量1

18、8、 核酸的定性測(cè)定中，OD268/OD280 比值大小說明什么問題？符合要求純度高的純化 DNA 其 OD260/OD280 在 1.6-1.8 之間，低于此范圍表明蛋白質(zhì)含量 超標(biāo)，高于此范圍表明樣品中含有RNA。要糾正一下，純 DNA 的 A260/A280 應(yīng)大于 1.8,純的 RNA 應(yīng)達(dá)到 2.0,樣品中如果含有蛋 白質(zhì)及苯酚，A260/A280 比值會(huì)明顯下降。對(duì)于純的樣品，只要讀出260nm 的 A 值即可以算出含量。通常以 A 值為 1 相當(dāng)于 50 微克/ml 雙螺旋 DNA，或者 40 微克/ml 單鏈 DNA （ RNA ）, 或者 20 微克/ml 寡核苷酸計(jì)算。OD

19、260 / OD280 1.9-2.0 RNA 居多 純度已經(jīng)很高了純 DNA : OD260/OD280疋1.8（ 1.9,表明有 RNA 污染；V1.6，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染） 純RNA : 1.7VOD260/OD280V2.0（V1.7 時(shí)表明有蛋白質(zhì)或酚污染；2.0 時(shí)表明可能有異硫氰酸殘存）OD 是 optical density (光密度)的縮寫，OD = log (1/trans),其中 trans 為檢測(cè)物的透光值。吸光度吸光度，absorbanee 是指光線通過溶液或某一物質(zhì)前的入射光強(qiáng)度與該光線通過溶液或物質(zhì)后的透射光強(qiáng)度比值的對(duì)數(shù)，影響它的因素有溶劑、濃度、溫度等等吸

20、光系數(shù)與入射光的波長(zhǎng)以及被光通過的物質(zhì)有關(guān)。只要光的波長(zhǎng)被固定下來，同一種物質(zhì)，吸光系數(shù)就不變。當(dāng)一束光通過一個(gè)吸光物質(zhì)(通常為溶液)時(shí)，溶質(zhì)吸收了光能，光的強(qiáng)度減弱。吸光度就是用來衡量光被吸收程度的一個(gè)物理量。吸光度用 A 表示，A = abc,其中 a 為吸光系數(shù)，單位 L/(g?cm),b 為液層厚度(通常為比色 皿的厚度)，單位 cm , c 為溶液濃度，單位 g/L 影響吸光度的因數(shù)是 b 和 c。a 是與溶質(zhì)有 關(guān)的一個(gè)常量，溫度通過影響c,而影響 A。一般來說 OD26O 代表核酸的吸光度，OD28O 代表蛋白質(zhì)的吸光度，OD23O 代表其他雜質(zhì)(多糖 等)的吸光度。 A260/

21、A280 與 OD26O/OD28O 的意思是一樣的。 A 代表吸光值，而 OD 是光 密度值，一個(gè)意思。A260/280 比值一度成為判斷核酸純度的唯一通用標(biāo)準(zhǔn)，純的DNA 一般在 1.8-2.0 之間；后來發(fā)現(xiàn)在抽提過程中使用的許多試劑影響A260 和 A280 讀數(shù)；同時(shí)，對(duì)同一樣品 10 倍數(shù)量級(jí)稀釋后測(cè)定吸光值發(fā)現(xiàn)， 分光光度計(jì)的吸光值僅在一定的區(qū)域是線性的。結(jié)論是：當(dāng)A260 讀數(shù)處在 0.1-0.5 之間，A200 至 U A320 之間的數(shù)值構(gòu)成一條光滑的曲線時(shí)，少量苯酚 (30 ul/ml)殘留使 A230， A260， A280 均變大(差不多增加一倍)， 但 A260/A

22、280 和 A260/A230均在 2 左右。少量異硫氰酸胍 (132 uM)殘留使 A230 變大，但 A260，A280 幾乎不變，所以 A260/A280仍在 2 左右，而 A260/A230 大大低于 2。大量異硫氰 酸胍(2.4 M)殘留使 A230 , A260, A280 均變大，根本就沒有辦法測(cè)定了。PEG (6.25%)殘留使 A230，A260，A280 均變大，但對(duì) A230，A260 影響更大，所以 A260/A280 比 2 大 不少，而A260/A230 仍在 2 左右。核酸抽提中常用的試劑，如Phenol，Guanidine Isothiocyanate，PEG

23、都能使 A260 和 A280的值變大，但是卻可能使二者的比值與高純度核酸的比值一致。因?yàn)锳260 值幾乎是峰值，所以有必要在其兩邊各取一個(gè)：A280 和 A230。干凈的核酸 A260/A230 應(yīng)該在 2 左右。如果有在 230nm 處的強(qiáng)吸收提示污染有酚鹽離子等有機(jī)化合物1. 蛋白質(zhì)污染：確保不要吸入中間層及有機(jī)相。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底。加入氯仿后首先要充分混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。如果所得RNA 的OD260/OD280 比值偏低，則用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。2. 苯酚殘留：確保不要吸入中間層及有機(jī)相。加入氯仿后首先要充分混勻，并且離心分層的 離心力

24、和時(shí)間要足夠。3. 多糖或多酚的殘留：一些特殊的組織和植物中，多糖、多酚含量較多，這些殘留也會(huì)導(dǎo)致OD260/OD280 比值偏低。因此，從這類材料中提取 RNA 時(shí)，需要注意多糖、 多酚雜質(zhì)的去 除。4. 設(shè)備限制：測(cè)定 OD26O 及 OD28O 數(shù)值時(shí)，要使 OD26O 讀數(shù)在 0.1-0.5 之間。此范圍線性 最好。用水稀釋樣品：測(cè) OD 值時(shí)，對(duì)照及樣品稀釋液請(qǐng)使用 10mM Tris，pH7.5。用水作 為稀釋液將導(dǎo)致比值偏低。比值低可能有蛋白污染，高了可能有 DNA 污染，建議你抽提的 RNA 分三管，兩管保存， 另一管用來跑膠和測(cè)定 OD，跑膠是最直觀的，1%的膠就可以，抽提后

25、馬上跑，一般不會(huì)降 解很多，所以設(shè)備材料不需要去酶處理不會(huì)有影響的。你的 od 比低可能是溶解時(shí)用的水的PH 值偏酸?？梢栽囍{(diào)到 8.0 左右再測(cè)，這樣就會(huì)上來了。19、普通瓊脂糖凝膠電泳分離 DNA 的范圍是多少?普通瓊脂糖凝膠分離 DNA 的范圍為 0.2-20kb。20、聚丙烯酰胺凝膠分離 DNA 的范圍是多少?丙烯酰胺（%）有效分離范圍（bp）溴酚蘭*二甲苯青*3.510020001004605.080 500652608.060 4004516012.040 200307015.025 150156020.010 100124521、 分離大片段 DNA，比如 50kb 以上，一般

26、采取什么形式的電泳？介紹基本原理。大分子 DNA（ 一般長(zhǎng)度超過 20kb，在某些情況下，超過 40kb）在電場(chǎng)作用下通過孔徑小于分 子大小的凝膠時(shí)，將會(huì)改變無規(guī)卷曲的構(gòu)象，沿電場(chǎng)方向伸直，與電場(chǎng)平行從而才能通過凝膠。此時(shí)，大分子通過凝膠的方式相同，遷移率無差別（也稱“極限遷移率”），不能分離。脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)解決了這一難題，它應(yīng)用于分離純化大小在102000kb 之間的 DNA片段。這種電泳是在兩個(gè)不同方向的電場(chǎng)周期性交替進(jìn)行的，DNA 分子在交替變換方向的電場(chǎng)中作出反應(yīng)所需的時(shí)間顯著地依賴于分子大小，DNA 越大，這種構(gòu)象改變需要的時(shí)間越長(zhǎng)，重新定向的時(shí)間也越長(zhǎng)， 于是在每個(gè)脈沖時(shí)間內(nèi)可

27、用于新方向泳動(dòng)的時(shí)間越少，因而在凝膠中移動(dòng)越慢。反之，較小的DNA 移動(dòng)較快，于是不同大小的分子被成功分離。在許多實(shí)用的 PFGE 方法中，倒轉(zhuǎn)電場(chǎng)凝膠電泳是最簡(jiǎn)單最常用的方法（FIGE）。通過把一個(gè)在不同電場(chǎng)方向有不同脈沖方式的脈沖電場(chǎng)加在樣品上，倒轉(zhuǎn)電場(chǎng)凝膠電泳（FIGE）設(shè)備能把大小范圍在 102000kb 的 DNA 片段分開。FIGE 也可通過重新確定一個(gè)對(duì)準(zhǔn)完全固定好角 度的電場(chǎng)，這樣會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)展其分離極限達(dá)到10Mb。22、 檢測(cè) DNA 時(shí)，有哪些些形式的染色方式？原理是什么，各有何特點(diǎn)。聚丙烯酰胺凝膠-銀染、瓊脂糖電泳-SYBR Greenl 染色及 EB 染色方法銀染的原理

28、：一、銀離子（一般是AgNO3）和 DNA 結(jié)合;二、還原劑甲醛把 Ag+還原成銀顆粒，最終 DNA 呈現(xiàn)為黑褐色。SYBR Green I 是一種結(jié)合于所有 dsDNA 雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I 發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA 結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)。因此，SYBR Green I 的熒光信號(hào)強(qiáng)度與雙鏈 DNA 的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號(hào)檢測(cè)出PCR體系存在的雙鏈 DNA 數(shù)量。SYBR Green I 的最大吸收波長(zhǎng)約為 497nm ,發(fā)射波長(zhǎng)最大約 為 520nm。這種扁平分子可以嵌入核酸雙鏈的配對(duì)的堿基之間，在紫外線激發(fā)下，未與

29、核酸結(jié)合的溴化乙錠可被激發(fā)出橙紅色螢光。在與DNA 或雙股 RNA 結(jié)合時(shí)，螢光強(qiáng)度會(huì)增強(qiáng) 20 倍，使得核酸電泳后的膠片可以辨識(shí)核酸的相對(duì)位置。在核酸分子中，EB 分子插入到兩層堿基對(duì)之間，發(fā)出紅色熒光。在凝膠中加入終濃度為0.5 卩 g/ml 的 EB,可以在電泳過程中隨時(shí)觀察核酸的遷移情況，這種方法使用于一般性的核酸檢測(cè)。23、PCR 的基本原理是什么？包括哪三個(gè)基本步驟？PCR 技術(shù)的基本原理 類似于 DNA 的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的 寡核苷酸引物。PCR 是一種體外 DNA 擴(kuò)增技術(shù)，是在模板 DNA、引物和 4 種脫氧核苷酸存在的條件下， 依賴于 DNA聚合

30、酶的酶促合反應(yīng)，將待擴(kuò)增的DNA 片段與其兩側(cè)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈引物經(jīng)“高溫變性一一低溫退火一一引物延伸”三步反應(yīng)的多次循環(huán)，使DNA 片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時(shí)間內(nèi)獲得我們所需的大量的特定基因片段。模板 DNA 的變性模板 DNA 經(jīng)加 熱至 93C左右一定時(shí)間后，使模板 DNA 雙鏈或經(jīng) PCR 擴(kuò)增形成的雙鏈 DNA 解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板 DNA 與引物的退火(復(fù)性)模板 DNA 經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55C左右，引物與模板 DNA 單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸DNA 模板-引物結(jié)合 物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNT

31、P 為反應(yīng)原料，靶序列為模板， 按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板 DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需 24 分鐘，23 小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬 倍。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。24、PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物理論上的計(jì)算公式是什么？PCR 的反應(yīng)動(dòng)力學(xué) PCR 的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA 擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的 DNA 擴(kuò)增量可用 Y=(1+X)n 計(jì)算。Y 代表 DNA 片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X 表示平(Y)均每次的擴(kuò)

32、增效率，n 代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100% ,但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。25、何為 PCR 的平臺(tái)效應(yīng)，產(chǎn)生的因素包括哪些？反應(yīng)初期，靶序列 DNA 片段的增加呈指數(shù)形式， 隨著 PCR 產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的 DNA 片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長(zhǎng)期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺(tái)期數(shù)、PCR 擴(kuò)增效率及 DNA 聚合酶 PCR 的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)等因素。大 多數(shù)情況下，平臺(tái)期的到來是不可避免的。26、PCR 中引物設(shè)計(jì)應(yīng)該遵循哪些基本原則？一設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則1、 引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為 20bp 左右。2、 引物擴(kuò)增跨

33、度：以 200-500bp 為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至 10kb 的片段。3、引物堿基：G C 含量以 40-60%為宜，G C 太少擴(kuò)增效果不佳，G C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免 5 個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。上下游引物的 GC 含量不能相差太大。附加序列(RT site, Promoter sequenee)加到 5端，在算 Tm 值時(shí)不算，但在檢測(cè)互補(bǔ) 和二級(jí)結(jié)構(gòu)是要加上它們.引物對(duì)的 Tm 差異不超過 5C,設(shè)計(jì)時(shí)溫度和 GC 含量是個(gè)主要 的參數(shù)，做復(fù)合擴(kuò)增時(shí)更要設(shè)計(jì)成相近的溫度，而且引物加個(gè)尾影響不大。但要切記 BLAST ,包括查閱文獻(xiàn)的引物如果

34、兩個(gè)引物 Tm 不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm 低 5C,或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm 設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5 個(gè)循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm 設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。4、 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。弓 I 物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應(yīng)不能正常進(jìn)行。5、 引物 3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端

35、堿基 不配對(duì)而導(dǎo)致 PCR 失敗。6、 引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。引物 5 端引入酶切位點(diǎn)得黏性末端，隨意加入 3 個(gè)保護(hù)性堿 基，但是要注意不要形成引物二聚體，而且以A 或 G 開頭為好。7、 引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無明顯同源性。引物量：每條引物 的濃度 0.1lumol 或 10100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高 會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。8、 引物酶切：除非產(chǎn)物非常特異，直接酶切PCR 產(chǎn)物效果有時(shí)不是很好，還有一般PCR體系里過

36、量的 dNTPs 會(huì)影響酶切效果。酶切后，可以用標(biāo)準(zhǔn)得乙醇沉淀法沉淀酶切產(chǎn)物，獲得高純度得酶切產(chǎn)物，也即是你的黏性目斷片斷供后邊得試驗(yàn)。27、 說出 PCR 產(chǎn)物與 T 載體連接的原理。TA 克?。篢A 克隆系統(tǒng)由 Invitrogen 公司（San Diego , CA）發(fā)展而來的商業(yè)性試劑盒，它 用 PCR 產(chǎn)物的克隆和測(cè)序。其原理是利用Taq 酶能夠在 PCR 產(chǎn)物的 3末端加上一個(gè)非模板依賴的 A，而 T 載體是一種帶有 3 T 突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一 步到位地把PCR 產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)（ MCS）中。TA 克隆沒有方向性。28、 Gateway

37、 方法進(jìn)行 DNA 重組的原理。Gateway 的原理也是建立在噬菌體DNA 定點(diǎn)整合到細(xì)菌宿主基因組上。在噬菌體和細(xì)菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda 的 attP 位點(diǎn)和大腸桿菌基因組的attB 位點(diǎn)可以發(fā)生定點(diǎn)重組，lambda 噬菌體 DNA 整合到大腸桿菌的基因組 DNA 中，兩側(cè)產(chǎn)生兩個(gè)新位點(diǎn)： attL 和attR。這是一個(gè)可逆的過程，如果在一個(gè)噬菌體編碼蛋白Xis 和 IHF、Int 的共同介導(dǎo)下這兩個(gè)新位點(diǎn)可以再次重組回復(fù)為attB 和 attP 位點(diǎn)，噬菌體從細(xì)菌基因組上裂解下來。這一過程的方向是受控于兩個(gè)重要因素：存在的介導(dǎo)蛋白和重組位點(diǎn)。29、 從制備

38、的總 RNA 中分離出 mRNA 的方法？原理是什么？大多數(shù)真核細(xì)胞 mRNA 的 3端通常具有由 20-30 個(gè)腺苷酸組成的 polyA 尾巴，寡聚胸腺嘧 啶脫氧核糖核苷（OligoT ）可以與之配對(duì)結(jié)合，這就是提取mRNA 最基本的原理。具體到實(shí)驗(yàn)手段上，現(xiàn)在磁珠法、纖維素柱層析法都有在用。磁珠法一般是用生物素標(biāo)記OligoT ,親和素標(biāo)記磁珠（生物素和親和素間具有高度親和力）。實(shí)驗(yàn)時(shí)生物素標(biāo)記的 OligoT 與 mRNA 的 polyA 高效雜交形成復(fù)合體，此復(fù)合體又與標(biāo)有親和素的磁珠結(jié)合。用磁性分離架就可以將這堆復(fù)合物分離出來。最后用無RNase 去離子水將 mRNA 從復(fù)合物中洗脫

39、下來即可。寡聚 dT 纖維素柱層析法的大致流程：總RNA 流經(jīng)寡聚 dT 纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液中，帶 polyA 尾的 mRNA 被特異地結(jié)合在柱上。降低鹽濃度，mRNA 被洗脫。一般過兩次柱后，就可得到較高純度的 mRNA。二、實(shí)驗(yàn)操作1 用含 Amp 的平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，為何會(huì)出現(xiàn)衛(wèi)星菌落。培養(yǎng)時(shí)間太長(zhǎng)了。2、乙醇沉淀 DNA 的基本原理。乙醇能夠消除核酸的水化層，使帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)暴露出來。Na +之類的平衡離子能夠與這些帶電基團(tuán)結(jié)合， 在沉淀形成部位降低多核苷酸鏈之間的排斥作用。因此只有在陽離子的量足以中和暴露的磷酸殘基的電荷時(shí)才會(huì)發(fā)生乙醇沉淀。3、沉淀核酸時(shí)，加入 NaAc

40、有何作用？NaAc 有助于降低 DNA 溶解度。4、溶菌酶的作用是什么？它是糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的3-1,4 糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當(dāng)溶液中 pH 小于 8 時(shí)，溶菌酶作用受到抑制。5、核酸分離時(shí)用到酚、氯仿、異戊醇各有何作用？抽提 DNA 去除蛋白質(zhì)時(shí)，怎樣使用酚與氯仿較好？酞與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA 分開。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。作為

41、表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚 與水相有一定程度的互溶，大約10%15 %的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的 DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會(huì)帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)， 此時(shí)一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時(shí)， 將酚與氯仿混合（1:1）使用。6、如果酚被氧化后，對(duì)分離核酸會(huì)有何影響？7、實(shí)驗(yàn)室提取質(zhì)粒 DNA 通常會(huì)出現(xiàn)幾種帶型，說出他們電泳行為的差別。提完的質(zhì)粒有三種形式存在：超螺旋閉合環(huán)質(zhì)粒，開口的

42、閉合壞質(zhì)粒， 線性質(zhì)粒。三者遷移速率不一樣，所以會(huì)出現(xiàn)三條帶。根據(jù)你質(zhì)粒提取的好壞，出現(xiàn)一到三條帶都屬于正常。你 做個(gè)酶切檢測(cè)，如果酶切充分，只有兩條帶，目的條帶和載體的條帶。不過一般情況都會(huì)有 一條超螺旋質(zhì)粒的條帶亮度更高，濃度更大，可能與marker 相比你的質(zhì)粒會(huì)比理論的小一點(diǎn)，這也是很正常的。8、核酸提取中，為何用 75%乙醇洗滌沉淀？9、說出可以沉淀 DNA 的試劑。10、說出 RNaseA、RNaseH 用途。RNase H是一種核糖核酸內(nèi)切酶，它能夠特異性地水解雜交到DNA 鏈上的 RNA 磷酸二酯鍵，故能分解 RNA/DNA 雜交體系中的 RNA 鏈。該酶不能消化單鏈或雙鏈DN

43、A。RNase A是一種被詳細(xì)研究和具有廣泛應(yīng)用的核酸內(nèi)切酶。RNase A 對(duì) RNA 有水解作用，但對(duì) DNA則不起作用。RNase A 在 C 端和 U 端殘基處專一地催化 RNA 的核糖部分 3-與 5-磷酸二酯 鍵的裂開，形成具有2,3-環(huán)磷酸衍生物寡聚核苷酸。如pG-pG-pC-pA-pG 被切割產(chǎn)生pG-pG-pCp 和 A-pG?？梢杂脕砣コ?DNA 制品中的污染 RNA。它們的合成目前資料還比 較少。11、 堿烈解法提質(zhì)粒時(shí)，使用的溶液H,即含 NaOH 和 SDS 的溶液，有何作用？溶液I50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl , pH=8

44、.0葡萄糖增稠，使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部；EDTA 抑制 DNase 的活性。這一步溶液中還可以加入 RNase,不受 EDTA 影響，并且可以在后續(xù)步驟中被除去溶液n0.2M NaOH / 1% SDS破細(xì)胞的主要是堿，而不是 SDS,所以才叫堿法抽提。12、 堿烈解法提質(zhì)粒時(shí)，使用的溶液川，即含 KAc 的溶液，有何作用？ 溶液川 3M 醋酸鉀/ 2M 醋酸這一步的 K 置換了 SDS （十二烷基磺酸鈉）中的 Na,得到 PDS （十二烷基磺酸鉀）沉淀； SDS 易與蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS 分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)也沉淀

45、了，同時(shí)基因組DNA 也被 PDS 共沉淀。13、 何為限制性內(nèi)切酶的星活性，產(chǎn)生原因有哪些？所謂星活性又稱 Star 活性。是指由于反應(yīng)條件不同而產(chǎn)生的切斷與原來認(rèn)識(shí)序列不同的位 點(diǎn)的現(xiàn)象，也就是說產(chǎn)生Star 活性后，不但可以切斷特異性的識(shí)別位點(diǎn)，還可以切斷非特異性的位點(diǎn)。產(chǎn)生 Star 活性的結(jié)果是酶切條帶增多。所以說 Star 活性與粘端變平端沒關(guān)系。另外，Star 活性除了與酶本身的性質(zhì)有關(guān)外，與甘油濃度，pH 值及離子濃度有關(guān)。一旦出現(xiàn)底物 DNA 不好切斷，需要增加酶量或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間時(shí)，如果使用的是易產(chǎn)生 StaR活性的限制酶切，一般優(yōu)先考慮增加酶量，而不是延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，換句話說

46、，延長(zhǎng)時(shí)間比增加酶量更易產(chǎn)生 Star 活性。另外，實(shí)際上幾乎所有的限制性內(nèi)切酶都可能產(chǎn)生Star 活性。但目前 Star 活性對(duì)實(shí)際實(shí)驗(yàn)室操作過程中的影響并不太大，可以先不考慮。星活性是特異性的限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的DNA 裂解，可以從這些酶的最適顯著不同的反應(yīng)條件下發(fā)生的松弛或改動(dòng)的。 其結(jié)果通常是在非規(guī)范的識(shí)別位點(diǎn)裂解，或有時(shí)完全喪失的特異性。這可能會(huì)導(dǎo)致星活性的差異包括低離子強(qiáng)度，pH 值高，和高（ 5%體積/體積）甘油的濃度。因?yàn)樯虡I(yè)的限制性內(nèi)切酶在一個(gè)緩沖器中，通常提供含有大量的甘油（50%v / v 是典型的），也就是說稀釋的酶溶液不足可導(dǎo)致星活性；此問題最經(jīng)常出現(xiàn)在雙重或多重消化。

47、14、 使用限制性內(nèi)切酶做雙酶切時(shí)，工作的緩沖液如何選擇？15、DNA 電泳用的上樣緩沖液含哪些基本成分，作用是什么?核酸電泳上樣緩沖液具有二個(gè)意閨：第一，使用詵糖成分増加檢酸分子的比重*方便上樣，確保核酸分子 均勻魚樣詁孔里；第二，増加顏您，町以實(shí)時(shí)跟蹤職察；第二，顏料分子任電場(chǎng)環(huán)境口以 Li 如的逼率 移動(dòng) u 謨酚藍(lán)EO.SXTBE 電泳液中，涼脂糖擬膠（0.5%-14%）上釣與閃 0 沖的雙鏈線狀 DNA 的遷移 速度和同.-甲則與 4 kb 的取鏈鴉狀 DNA 的遷移連度相同.其成分包拆*摧糖、澳酚藍(lán)、二甲 苯措藍(lán) FF 導(dǎo)，可用 T DMA 1 RNA 電泳。16、 通過電泳確定未

48、知大小的DNA 片段，原理是什么？借助瓊脂糖凝膠的分子篩作用，核酸片段因其分子量或分子形狀不同，電泳移動(dòng)速度有差異而分離。17、 如果發(fā)現(xiàn)瓊脂糖電泳時(shí)，較大的 DNA 片段，如 3kb 以上的，不能很好分離，應(yīng)該如何 調(diào)整膠的濃度，為什么？分子量越小，膠的濃度越高，分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)上有大致的堿基數(shù)與膠濃度的對(duì)應(yīng)表，查一下就可以。另外，不同的目的也對(duì)膠的濃度有影響。同樣的片段，分析用的膠和分離用的膠濃度有時(shí)候會(huì)不同，一般分離膠濃度會(huì)更高些。18、 感受態(tài)細(xì)胞的制備操作過程中，重點(diǎn)要注意什么？控制好菌株的活力1 細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)：實(shí)驗(yàn)中應(yīng)密切注視細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度，盡量使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（一

49、般通過檢測(cè) OD600 來控制。DH5?菌株 OD600 為 0.5 時(shí)細(xì)胞密度是 5X107/ml）;2 所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進(jìn)行；3 經(jīng) CaCI2 處理的細(xì)胞，在低溫條件下，一定的時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的推移而增加，24 小時(shí)達(dá)到最高，之后轉(zhuǎn)化率再下降（這是由于總的活菌數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少造成的）；4 化合物及無機(jī)離子的影響：在Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價(jià)金屬離子（如Mn 2+或Co2+ ）、DMSO 或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提高（100-1000 倍）；5 所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn) 化效率；6 質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響：

50、用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)主要是超螺旋的DNA ；7 一定范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率與外源DNA 的濃度呈正比。19、 瓊脂糖凝膠電泳使用的緩沖液通常為TAE 何 TBE，二者有什么區(qū)別？TAE 是使用最廣泛的緩沖系統(tǒng)。其特點(diǎn)是超螺旋在其中電泳時(shí)更符合實(shí)際相對(duì)分子質(zhì)量（TBE 中電泳時(shí)測(cè)出的相對(duì)分子質(zhì)量會(huì)大于實(shí)際分子質(zhì)量），且雙鏈線狀 DNA 在其中的遷移率較其他兩種緩沖液快約10%，電泳大于 13kb 的片段時(shí)用 TAE 緩沖液將取得更好的分離效果，此外，回收 DNA 片段時(shí)也易用 TAE 緩沖系統(tǒng)進(jìn)行電泳。TAE 的缺點(diǎn)是緩沖容量小， 長(zhǎng)時(shí)間電泳（如過夜）不可選用，除非有循環(huán)裝置使兩極的緩沖液得到交換。TBE 的

51、特點(diǎn)是緩沖能力強(qiáng)，長(zhǎng)時(shí)間電泳時(shí)可選用TBE，并且當(dāng)用于電泳小于 1kb 的片段時(shí)分離效果更好。TBE 用于瓊脂糖凝膠時(shí)易造成高電滲作用，并且因與瓊脂糖相互作用生 成非共價(jià)結(jié)合的四羥基硼酸鹽復(fù)合物而使DNA 片段的回收率降低， 所以不宜在回收電泳中使用。20、PCR 反應(yīng)中包含哪些基本成分？ 水（構(gòu)建反應(yīng)體系） 引物（促使 dNTP 結(jié)合到模板鏈上從而擴(kuò)增） 模板Taq 酶（DNA 聚合酶，催化形成互補(bǔ)鏈）buffer （緩沖體系）dNTP （反應(yīng)物）21、PCR 的結(jié)果中出現(xiàn)雜帶，可能的原因有哪些？提高退火溫度GSP 與其他 cDNA 的非特異性結(jié)合會(huì)導(dǎo)致在擴(kuò)增目的產(chǎn)物時(shí)得到無關(guān)產(chǎn)物。*Ge

52、neRacer 引物和 cDNA 的非特異性結(jié)合會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生一端帶有Gen eRacer 引物序列的 PCR產(chǎn)物。*RNA 降解。*PCR 管或試劑污染。注意：雜帶一般是因?yàn)闆]有優(yōu)化PCR 條件，可以加入陰性對(duì)照來確定。用 RT 陰性對(duì)照檢測(cè)是否被基因組DNA 污染。如果 RT 陰性對(duì)照的 PCR 結(jié)果也顯示同樣條帶，則需要用 DNase I 重新處理樣品。*在 PCR 反應(yīng)中，非特異的起始擴(kuò)增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物Tm 2 至 5C的溫度下進(jìn)行退火，降低鎂離子或是目的 DNA 的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。*由于 mRNA 剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的RT-P

53、CR 結(jié)果。22、PCR 中的引物二聚體是如何形成的，電泳中處于何位置？23、如何能保證所制備 RNA 的完整性和均一性？24、RNA 制備實(shí)驗(yàn)中使用的胍鹽的用途是什么？25、RNA 制備實(shí)驗(yàn)中使用的 Sarcosyl 的用途是什么？異硫氰酸胍一酚法提取 RNA 的原理如下：GIT 與3巰基乙醇共同作用抑制 RNase 的活性； GIT 與十二烷基肌氨酸鈉（Sarcosyl）作用使蛋白質(zhì)變性，從而釋放RNA ;酸性條件下DNA 極少發(fā)生解離，同蛋白質(zhì)一起變性被離心下來，RNA 則溶于上清中。該法所提RNA純度高完整性好較適合純化mRNA，逆轉(zhuǎn)錄及構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)，因此為大多數(shù)人采用。與氯化

54、銫方法比較，雖然純度稍差一些，小分子RNA，女口 tRNA、snRNA 不易去除，但產(chǎn)量高完整性好，鹽易去除。26、RNA 提取實(shí)驗(yàn)中用于控制 RNase 的措施有哪些？27、RNA 的制備可用于哪些后續(xù)實(shí)驗(yàn)？28、RNA 提取實(shí)驗(yàn)中用到的 DEPC 水如何制備？29、 RNA 的制備實(shí)驗(yàn)中，為何有效控制 RNase 是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵？結(jié)合 RNase 的特點(diǎn)進(jìn)行說明。30、RNA 的非變性膠和變性膠電泳有何區(qū)別？31、簡(jiǎn)述 Northern 雜交的基本過程。32、將 RNA 轉(zhuǎn)移至膜上，常用什么方法，原理是什么？33、實(shí)驗(yàn)制備的總 RNA 經(jīng)非變性的瓊脂糖凝膠電泳后，有哪些特征條帶？34、如何發(fā)

55、現(xiàn)所提取的總 RNA 是否降解，RNA 發(fā)生降解的原因有哪些？35、 Northern 雜交中，RNA 經(jīng)變性電泳后轉(zhuǎn)移至膜上，為使RNA 與膜結(jié)合牢固，常采取什么措施?總結(jié)：生化試劑的作用原理知道原理對(duì)實(shí)驗(yàn)出問題時(shí)分析很有益，所以列出來一起分享！1 葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA 受機(jī)械剪切力作用而降解。EDTA：( 1)螯合 Mg2 +、Ca2+等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對(duì) DNA 的降解作用(DNase 作用時(shí)需要一定的金屬離子作輔基)；(2) EDTA 的存在，有利于溶菌酶的作用，因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán) 境。2.NaOH SDS 液：NaOH :核

56、酸在 pH 大于 5,小于 9 的溶液中，是穩(wěn)定的。但當(dāng)pH 12 或 pHv3 時(shí)，就會(huì)引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液 II 中的 NaOH 濃度為 0.2mo1/L,加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的 pH 就高達(dá) 12.6,因而促使染色體 DNA 與質(zhì)粒 DNA 的變性。 SDS： SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：(1)溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。(2 )解聚細(xì)胞中的核蛋白。(3) SDS 能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為 R-O-SO3-R+ -蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。 但是SDS 能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一

57、步操作中(用 RNase 去除 RNA 時(shí))受到干擾。3. 3mol /L NaAc ( pH4.8)溶液：NaAc 的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH 至 4.8,必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實(shí)際上是NaAc-HAc 的緩沖液。用 pH4.8 的 NaAc 溶液是為了把pH12.6 的抽提液，調(diào)回 pH 至中性，使變性的質(zhì)粒 DNA 能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽 的 3mol /LNaAc 有利于變性的大分子染色體 DNA、RNA 以及 SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀 之。前者是因?yàn)橹泻秃怂嵘系碾姾?，減少相斥力而互相聚合，后者是因?yàn)殁c鹽與SDS 蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物，使

58、沉淀更完全。4. 為什么用無水乙醇沉淀 DNA ?用無水乙醇沉淀 DNA ,這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀 DNA 的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA 很安全，因此是理想的沉淀劑。 DNA 溶液是 DNA 以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去 DNA 周圍的水分子，使 DNA 失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中，是加2 倍體積的無水乙醇與 DNA 相混合，其乙醇的最終含量占67%左右。因而也可改用 95%乙醇來替代無水乙醇(因?yàn)闊o水乙醇的價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95%乙醇昂貴)。但是加 95%的乙醇使總體積增大，而DNA 在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA 損失也增大

59、，尤其用多次乙醇沉淀時(shí)，就會(huì)影響收得率。折中的做法是初次沉淀 DNA 時(shí)可用 95%乙醇代替無水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6 倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置 15 30 分鐘即可。5. 在用乙醇沉淀 DNA 時(shí)，為什么一定要加 NaAc 或 NaCl 至最終濃度達(dá) 0.10.25mol/L ?在 pH 為 8 左右的溶液中，DNA 分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的 NaAc 或 NaCl，使 Na+ 中和 DNA分子上的負(fù)電荷，減少 DNA 分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成 DNA 鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時(shí)，只有部分DNA 形成 DN

60、A 鈉鹽而聚合，這樣就造成 DNA 沉淀不完全，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時(shí)，其效果也不好。在沉淀的DNA 中，由于過多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA 的酶切等反應(yīng)，必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀。6.加核糖核酸酶降解核糖核酸后，為什么再要用SDS 與 KAc 來處理？加進(jìn)去的 RNase 本身是一種蛋白質(zhì)，為了純化DNA，又必須去除之，力口 SDS 可使它們成為 SDS-蛋白復(fù)合物沉淀，再加 KAc 使這些復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使沉淀更加完全。也可用飽和酚、氯仿抽提再沉淀，去除 RNase。在溶液中，有人以 KAc 代替 NaAc , 也可以收到較好效果。7 為什么在保存或抽提 DN