分子發(fā)光分析論文(DOC)

1、HUAZHONG AGRICULTURAL UNIVERSITY分子發(fā)光分析課程論文題 目 超分辨率熒光顯微成像技術(shù)研究進展_Progress in Super-resolution FluorescenceMicroscopy Imaging Techniques姓 名金鑫學(xué) 號 2013310201019學(xué) 院 理學(xué)院專業(yè)班級應(yīng)化 1303中國武漢二一六年四月摘要2014 年諾貝爾化學(xué)獎授予了三位科學(xué)家，以表彰他們在超分辨率熒光顯微成像技術(shù) 方面的重大貢獻。本文就這一技術(shù)的發(fā)展歷程進行簡要概述，并對于超分辨率熒光顯微 技術(shù)的發(fā)展前景進行展望。關(guān)鍵詞 : 諾貝爾獎，超分辨，顯微成像Abstr

2、actThe Nobel Prize in Chemistry was awarded to three scientists in 2014, in recognition of theirsignificant contribution to the super-resolution fluorescence microscopy imaging techniques. Inthis paper, a brief overview on the course of development of this technology, and prospects for thedevelopmen

3、t of super-resolution fluorescence microscopy techniques will be discussed.Key Words: Nobel Prize, Super-resolution, Microscopy imaging1緒論1.1 傳統(tǒng)的分辨?zhèn)鹘y(tǒng)的分辨可以定義為： 如果點擴展函數(shù)較大， 那么對于兩個靠得很近的點， 則不 能分辨。在此基礎(chǔ)上，實現(xiàn)超分辨的方法可分為兩類：基于點擴展函數(shù)調(diào)制的超分辨技 術(shù)，使得點擴展函數(shù)變??；基于隨機單分子定位的超分辨技術(shù)，使得沒有靠得很近的兩 個點同時發(fā)光1。1.2 超分辨率簡介基于點擴展函數(shù)調(diào)制的超分辨技術(shù)的代

4、表為受激發(fā)射光淬滅（簡稱 STED）技術(shù) 早在1994 年，此次獲獎的羅馬尼亞裔德國科學(xué)家 Stefan W-Hell 最先提出了打破光學(xué)衍 射極限的構(gòu)思，并最終于 2000 年在實驗上得以實現(xiàn)5?；陔S機單分子定位的超分辨技術(shù)的核心是，如果圖像上的點不是同時。亮起來，也就是不會有兩個靠得很近的點同時亮，就可以通過定位的方式實現(xiàn)超分辨。雖然一次 定位只能得到少數(shù)幾個分子，但是通過數(shù)千張圖片對數(shù)十萬個單分子的定位，就可以獲 得一張高分辨率的圖像1。2熒光顯微鏡的發(fā)明歷程2.1 光學(xué)顯微鏡光學(xué)顯微鏡自發(fā)明伊始，即與生命科學(xué)結(jié)下了不解之緣。 16 世紀(jì)末期，荷蘭眼鏡商Zaccharias Janss

5、en 和他的兒子把兩個凸透鏡放到一個鏡筒中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鏡筒能放大物 體，這就是顯微鏡的前身。隨后，荷蘭人 Anthony Von Leeuwen -hoek 通過精密研磨的玻 璃透鏡，首次將復(fù)式顯微鏡的分辨率提高到了 300 倍，并用它來觀察牙縫中的微生物 細菌。后來，英國實驗科學(xué)家 Robert Hooke 對這一顯微鏡進行了系統(tǒng)的改進，用它 來觀察軟木塞的微小結(jié)構(gòu)。他看到了上面致密排列的小室，并將其命名為細胞，記錄在 他 1665 年創(chuàng)作的顯微鏡一書中1。2.2 電子顯微鏡1872 年，德國數(shù)學(xué)和物理學(xué)家 Ernst Abbe 根據(jù)光的波動性，得出了以下結(jié)論：對 一個理想的發(fā)光點，在經(jīng)過顯微

6、鏡光學(xué)系統(tǒng)后，將是一個高斯型的艾里斑。由此可以想 到無論一個樣品結(jié)構(gòu)有多復(fù)雜，總是能夠描述為是由一個個點構(gòu)成的，因此，這個點的 像描述了光學(xué)系統(tǒng)的響應(yīng)函數(shù)，或者稱之為系統(tǒng)的分辨率。該函數(shù)即點擴展函數(shù)1。通過阿貝公式2，很容易想到的是，縮短波長即可產(chǎn)生更高的分辨率，比如利用 X 光，實際上電子的德布羅意波長是光波的千分之一，是屬于 X 光的范疇。1986 年，電子 顯微鏡技術(shù)獲得了諾貝爾物理學(xué)獎。2.3 光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡的不足光學(xué)顯微需要所看的對象“色彩斑斕”，而細胞一般是高度透明的。為了能夠看到 細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，人們發(fā)明了染色技術(shù)。最常用的染色技術(shù)一一HE 染色能夠利用 2 種染料對生物組

7、織進行染色，目前仍是臨床采用的判定腫瘤良惡性的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，染色對于 觀察亞細胞結(jié)構(gòu)仍存在較大挑戰(zhàn)：染色是通過對光的直接吸收來產(chǎn)生的反差，也就是讓 細胞器有吸收，而周圍沒有吸收達到反差效果。光的吸收率可以用比爾定量描述，當(dāng)樣 品的厚度非常小時，吸收率幾乎為 0,這也就是薄樣品看上去幾乎透明的原因。電鏡使得過去不能夠看到的樣品細節(jié)能夠被清晰地展現(xiàn)。但是，電鏡卻有著復(fù)雜、 嚴(yán)苛的樣品制備過程，如切片、脫水、固定、鍍金等，這些均會破壞細胞的活性甚至改 變其原有的結(jié)構(gòu)。而且，電鏡只能看到細胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)，對于所觀察到的結(jié)構(gòu)的判斷，貝 U 需要其他技術(shù)輔助辨別。2.4 熒光染色傳統(tǒng)的染色是吸收 A 波長，探

8、測 A 波長的吸收率。為了解決這一問題，可以使系統(tǒng) 吸收 A波長，探測從樣品染色上發(fā)出的B 波長。這樣，僅在有“染色”的地方發(fā)光，沒有染色的地方是完全黑的，即熒光染色。1871 年，Johann Friedrich Wilhelm Adolf von Baeyer因合成熒光素獲 1905 年諾貝爾化學(xué)獎。在此基礎(chǔ)上，能夠特異性地標(biāo)記細胞中的不同細胞器的熒光染色技術(shù)應(yīng) 運而生。2008 年諾貝爾化學(xué)獎的綠色熒光蛋白能夠通過外源性標(biāo)記或者內(nèi)源性轉(zhuǎn)基因的 方式選擇性地讓某一個感興趣的細胞器發(fā)熒光，將活體成像往前推進了一大步o圖 1 HE 染色病理切片圖（a）與細胞熒光顯微圖（b）的對比2.5 超分辨

9、率熒光顯微技術(shù)前文提到，Hell 對于突破衍射極限的執(zhí)著追求造就了 STED 技術(shù)的問世，而后引領(lǐng) 的 STED技術(shù)的發(fā)展和推廣熱潮成就了 STED 技術(shù)在超分辨成像領(lǐng)域的一席之地4o物理學(xué)出身的 Betzig 于 2006 年在Scienee雜志上發(fā)表文章正式提出了光激活定 位超分辨顯微鏡。PALM/STOR 均是通過對熒光分子的激活一定位一漂白三個步驟加之?dāng)?shù) 萬次的循環(huán)最終重構(gòu)出超分辨圖像。相比于STED 技術(shù)，PALM/STOR 在實現(xiàn)上更簡單且 成本更低，多色 PALM 成像、三維 PALM 成像、活細胞 PALM 成像以及厚樣本 PALM 成像相 繼誕生，并且在生物學(xué)研究中迅速普及開

10、來4。Moerner 教授雖然沒有直接提出超分辨成像的概念，卻是第一個觀察到單分子并對 單分子性質(zhì)進行詳細測量的科學(xué)家4。3展望超分辨顯微成像技術(shù)在問世十多年之后便迅速獲得了諾貝爾獎，足見其對化學(xué)領(lǐng)域 尤其是生物學(xué)領(lǐng)域的重大影響。時至今日，三大超分辨成像技術(shù)的理論基礎(chǔ)已比較完 備，但是其應(yīng)用范圍與普通共聚焦顯微鏡相比還有很大差距，因此此次諾貝爾獎的頒發(fā) 勢必會引起更多化學(xué)家、生物學(xué)家的重視，將更多的科研興趣和研究重點投入超分辨顯 微成像技術(shù)上來。高昂的裝備和維護費用也是影響超分辨成像技術(shù)推廣的重要制約因 素。因此如何進一步降低超分辨率研究的成本及其推廣是目前人們需要關(guān)注的主要內(nèi) 容。參考文獻席

11、棚,孫有杰. 超分辨率熒光顯微技術(shù)解析 2014 年諾貝爾化學(xué)獎 J. 北京大學(xué)科技 導(dǎo)報.2015.顧兆泰. 超分辨熒光壽命顯微方法及系統(tǒng) . 浙江大學(xué) D. 2013.1.紀(jì)偉,徐濤,劉貝. 光學(xué)超分辨熒光顯微成像 2014 年諾貝爾化學(xué)獎解析 . 中國科學(xué)院 生物物理研究所 J. 2014.6.李帥. 超分辨熒光顯微方法與系統(tǒng)研究 . 浙江大學(xué) D. 2014.1.7.Hell S W, Wichmann J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission:stimulated- emission- de

12、pletion fluorescence microscopyJ. Optics Letters, 1994, 19(11):780782.Willig K I, Kellner R R, Medda R, et al. Nanoscale resolution in GFP-based microscopyJ. NatureMethods, 2006, 3(9): 721-723課程心得本片文獻主要介紹的是熒光金納米粒子的發(fā)展歷史，從最早的黃金和薄銅的光致發(fā) 光一直到現(xiàn)代的各種粒徑的熒光納米金粒。人們合成了大量的多功能的熒光納米金粒，它們的熒光量子產(chǎn)率也在不斷提升。作者介紹了幾個重要的關(guān)于合

13、成納米金的實驗，并 從納米金的粒徑、表面配體、 金屬原子的價態(tài)和納米顆粒的結(jié)晶度等等結(jié)構(gòu)因素， 分析 了它們對熒光納米金粒發(fā)光的影響，并且用幾個實驗結(jié)果加以佐證。文獻中還根據(jù)各種 結(jié)構(gòu)因素對納米金熒光特性的影響還分析了可能的發(fā)光機理?？v觀文獻整體，由于是一片綜述類型的文章，深度不深但是涉及的面非常廣，要較 好的加以理解需要查閱不少相關(guān)資料。在文獻結(jié)尾處，作者說明了在納米金微粒熒光機 理方面的廣闊前景。學(xué)生對于這一篇文獻的主要心得就是這個地方，實際上現(xiàn)在的化學(xué) 體系發(fā)展的已經(jīng)比較完整了，但是在一些前沿領(lǐng)域，尤其是微觀領(lǐng)域，雖有大量的實驗 數(shù)據(jù)，但是對于機理方面是相對比較薄弱的，很多現(xiàn)象只知道該怎

14、么去做以及會成為什 么樣子，但是對于背后的機理還欠缺一些核心的理論支持，那么是不是去研究這些地方 就一定會有很好的發(fā)展前景呢？學(xué)生認(rèn)為是否定的，機理實際上就是大量的實驗數(shù)據(jù)所 遵循的潛在的某種規(guī)律，基本上只需要足夠多的實驗數(shù)據(jù)，再加上一些運氣的成分以及 能夠識破本質(zhì)的天分，發(fā)現(xiàn)機理的必然性就確定了，剩下的只是時間的問題。所以沒有 必要去追求那個“空中樓閣”，該出來的時候就會出來了，畢竟這個世界上大部分的天 才都是依靠努力的。翻譯正文不同尺寸的熒光金納米粒子Jie Zheng, Chen Zhou, Mengxiao Yu and Jinbin Liu經(jīng)過十多年的努力，大量具有不同的尺寸和表面化

15、學(xué)性質(zhì)的高熒光金屬納米粒子已 被開發(fā)。熒光通常被認(rèn)為是受微粒大小的影響，至于其它的結(jié)構(gòu)因素，例如表面配體， 金屬原子的價態(tài)和納米顆粒的結(jié)晶度也會對熒光的特性與發(fā)光機制有重要的影響。在這 篇綜述中，我們總結(jié)了如何去制造從幾個原子到百萬數(shù)量級原子數(shù)的熒光金納米粒子的 方法并討論了這些結(jié)構(gòu)因素是如何影響它們的光致發(fā)光。1. 引言在納米級尺寸下，金是一種很好的材料，它具有可調(diào)控的電子結(jié)構(gòu)和廣泛的材料特 性。毫無疑問，納米金顆粒的表面等離子共振吸收是其最迷人的財產(chǎn)，本質(zhì)上它是由于 大量的自由電子在連續(xù)能帶中集體震蕩產(chǎn)生的，可以通過改變粒徑等結(jié)構(gòu)參數(shù)來進行調(diào) 節(jié)。例如，對于粒徑大于光的波長的納米金顆粒，其

16、頻率和表面等離子體的帶寬可以用 Mie 氏散射理論定量地描述。當(dāng)顆粒尺寸接近電子的平均自由路徑（對于金約為 50 納 米），粒徑的減少會導(dǎo)致表面等離子激元藍移，這仍然可以用改進的 Mie 理論解釋。其 他的結(jié)構(gòu)參數(shù)，如形狀、聚集度、組成和表面粗糙度也顯著影響表面等離子體及其相關(guān) 性質(zhì)，如表面增強拉曼散射（SERS）和光熱轉(zhuǎn)換等。許多優(yōu)秀的評論將幫助讀者全面了 解這些知名納米金的等離子體特性。在這篇綜述中，我們專注于金納米粒子的熒光特性，這比表面等離子激元更難理 解。經(jīng)過十年的努力，發(fā)光金屬納米粒子已成為一類新興的金屬納米結(jié)構(gòu)。新的不同大 小，高量子產(chǎn)率的發(fā)光金納米粒子的合成方法已經(jīng)得到了發(fā)展，

17、部分發(fā)光機制已經(jīng)被闡 明，多種納米金粒子的應(yīng)用已被展示。尺寸為 0.3 到 20 納米的熒光納米金粒子可以通過 調(diào)諧不同的結(jié)構(gòu)參數(shù)，如粒度，表面配體，價態(tài)和晶粒尺寸來合成，有必要總結(jié)這些因 素是如何影響發(fā)光性能和機制的，這可能有助于發(fā)光金屬納米粒子的應(yīng)用和未來的發(fā) 展。發(fā)光金納米粒子已在過去的十年里被深入的研究，金的發(fā)光觀察最早可追溯到 1969 年。Mooradia 用 488 納米的激光激發(fā)黃金和銅的薄膜，分別在 564 和 620 納米處觀察到 光致發(fā)光。由于黃金或銅膜具有連續(xù)導(dǎo)通的能帶結(jié)構(gòu)，觀察到的量化轉(zhuǎn)換（發(fā)光）并不 是因為帶內(nèi)躍遷而是由于帶間躍遷產(chǎn)生的。圖一是是首次被提出的能夠解釋

18、金和其它金 屬薄膜的光致發(fā)光的光學(xué)機制，這個輻射機制產(chǎn)生于 D 帶上有空穴的費米能級上的電子 重組。在觀察金屬的光致發(fā)光時，具有一個非常大的態(tài)密度和大量的自由電子的系統(tǒng)相 比傳統(tǒng)的已知的熒光基團是相當(dāng)不尋常的，在這項工作發(fā)表后的前20 年里，很少有人注意這一領(lǐng)域。部分原因是由于量子產(chǎn)率僅10-10，對于詳細理解和實際應(yīng)用金屬輻射來說 太小了。在 1986 年，由于在對金屬薄膜的表面增強拉曼光譜研究中不斷發(fā)現(xiàn)了一個持續(xù) 的背景輻射，人們又開始注意到金屬薄膜的光致發(fā)光。博伊德等發(fā)現(xiàn)金膜發(fā)光的范圍為 400 至 653 納米，輻射的最大值決定于激發(fā)波長和膜粗糙度。由于當(dāng)?shù)氐膱鲂?yīng)，表面粗 糙度可以提

19、高光致發(fā)光強度至高達 6 倍。這項研究進一步表明，金薄膜發(fā)光是由于在 D 帶有空穴的費米能級下面的電子復(fù)合直接輻射導(dǎo)致的。方案 1 貴重金屬的能帶結(jié)構(gòu)的示意圖，如圖示出了電子激發(fā)和復(fù)合躍遷。發(fā)光的不僅是觀察到的金膜，也包括小的納米金結(jié)構(gòu)。在1998 年，Wilcoxon 等在440 納米處觀察到尺寸小 5 納米的納米金粒子有比較強烈的藍色輻射。那些發(fā)藍光的金納 米粒子是通過 KCN 蝕刻制造的，其發(fā)射量子產(chǎn)率為io-5大約比散裝金高105倍。然而究竟 是什么在發(fā)光仍舊不清楚。2000 年，穆罕默德等在波長為 560 納米處觀察到的金納米棒 比散裝金的量子產(chǎn)率高一百萬倍。有趣的是，量子產(chǎn)率隨著勵

20、磁功率增加而二次增長， 最大波長線性的增長。這些小金納米粒子和金納米棒的發(fā)光也是由于電子和空穴的帶間 重組的過程而產(chǎn)生的，其通過表面等離子體進一步增強。金納米結(jié)構(gòu)熒光量子產(chǎn)率的增加歸因于上述研究的局部電場增強效應(yīng)，一些額外的 報告表明，非常小的納米金的熒光顯示表面等離子體可能不是高量子產(chǎn)率發(fā)光的必不可 少的金納米結(jié)構(gòu)。2000 年，維特和他的同事報道了在 1.1 到 1.7 納米的近紅外發(fā)光區(qū)的金 納米粒子，量子產(chǎn)率達（4.4 5）入0-5。2001 年，黃和 Murray 用 1.7 納米的金納米粒子觀 察在 770 納米處的熒光量子產(chǎn)率為 3X10-3， Link 小組觀察在 770 納米

21、處 Au28納米簇 （注 釋： 在后來的研究中已用 AU25校正）的熒光量子產(chǎn)率為 210-3，這比金膜的熒光量子產(chǎn) 率高出107倍。由于這些非常小的納米金開始像分子并沒有表現(xiàn)出表面等離子體特性，局 域場增強效應(yīng)不再參與所觀察到的高量子熒光產(chǎn)率。人們進一步提出假說，認(rèn)為金團簇 分子的發(fā)光不僅能夠產(chǎn)生以前就知道的帶內(nèi)躍遷，也能產(chǎn)生帶間躍遷。這些研究是現(xiàn)在 對金納米粒子熒光的基礎(chǔ)。在過去的十年中，大量的尺寸從 0.3到 20 納米的高熒光金（對應(yīng)于從幾十到數(shù)以百萬計的原子金原子數(shù)）已被合成，發(fā)光機制的基本認(rèn)知也有了 很大的進步。在此，我們通過強調(diào)影響發(fā)光性能和發(fā)射機制的因素總結(jié)了這一領(lǐng)域的進 展。

22、已從非等離子和等離子納米金上均觀察到了發(fā)光，發(fā)光源可分為分子發(fā)光金納米粒 子和等離子體金納米粒子。對于分子的金納米粒子，我們可以進一步分為兩類：少原子的金納米團簇和幾納米的金納米粒子。粒子大小、表面配體、價態(tài)和晶粒尺寸都對金納米 粒子的發(fā)光性能有顯著的影響。2.幾個原子發(fā)光的熒光單一的金納米粒子的電子結(jié)構(gòu)是依賴于它的顆粒大小。當(dāng)粒子的尺寸變得可以媲美 金電子的費米波長（0.5 納米）時，納米顆粒的連續(xù)能帶結(jié)構(gòu)分解成離散的能量狀態(tài)，因 此，金納米粒子表現(xiàn)的像分子。在這個非常小的規(guī)模上，金納米粒子通常被稱為納米團 簇（NCS）。在 1987年，金納米粒子被發(fā)現(xiàn)在低溫，氣體介質(zhì)中發(fā)光。Harbich 和同事們制造了被植入氬介質(zhì)的發(fā)光的 AU2和 AU3。雖然這些研究清楚地表明了金納米粒子的大 小與發(fā)光有關(guān)，但是其具體的定量關(guān)系仍舊不明確