Forward genetics and map-based cloning approaches正向遺傳學和圖位克隆方法

1、Forward genetics and map-based cloning approaches正向遺傳學和圖位克隆的方法正向遺傳學和圖位克隆的方法Janny L. Peters, Filip Cnudde and Tom GeratsDepartment of Experimental Botany, Plant Genetics, University of Nijmegen, Toernooiveld 1, NL-6525 ED Nijmegen, The Netherlands TRENDS in Plant Science Vol.8 No.10 October 2003 姓名：專

2、業(yè)：學號：一、正向遺傳學和反向遺傳學二、正向遺傳學的基因功能分析 1、遺傳標記類型 2、分子標記 3、分子標記的檢測技術(shù) 4、利用分子標記進行基因定位 5、圖位克隆三、結(jié)論 目錄目錄正向遺傳學正向遺傳學 經(jīng)典的遺傳學方法。通過生物個體或細胞的基因組的自發(fā)突變或人工誘變，尋找相關(guān)的表型或性狀改變，然后從這些特定性狀變化的個體或細胞中找到對應(yīng)的突變基因，并揭示其功能。例如遺傳病基因的克隆。 優(yōu)點：突變表現(xiàn)型已知，只要這個性狀是由單基因或主效寡基因控制的，那么，按部就班地往前走就應(yīng)該能夠找到控制這個性狀的基因。 不足：不能鑒定被多個基因編碼的特定功能。反向遺傳學反向遺傳學 反向遺傳學的原理與正向遺傳

3、學正好相反，人們首先是改變某個特定的基因或蛋白質(zhì)，然后再去尋找有關(guān)的表型變化。例如反義、共抑制、RNA干擾、定向誘變基因組局部突變等； 優(yōu)點：從基因到基因的突變到突變表現(xiàn)型，可謂單刀直入、立竿見影。 不足：雖然能得到控制功能的所有基因，但不能得到它們的順序及貢獻 簡單地說，正向遺傳學是從表型變化研究基因變化，反向遺傳學則是從基因變化研究表型變化。正向遺傳學的基因功能分析正向遺傳學的基因功能分析 開始于一個突變株的表現(xiàn)型，然后通過遺傳學方法(雜交)分析這性狀的分離組合比例，最后把控制這個性狀的基因克隆。 在這一系統(tǒng)中，突變造成了基因功能的喪失(在少數(shù)情況下是突變造成功能的獲得)，所以野生型性狀被

4、認為是這個基因的正常功能的表現(xiàn)，即基因的功能在研究正式開始以前就是已知的。 當突變的表型導致的結(jié)果是一個T-DNA或轉(zhuǎn)座子插入的結(jié)果，那么，通過定位序列標簽和分析其鄰近序列，目的基因的快速鑒定至少在理論上是可行的。然而被化學和輻射誘導的突變影響的基因鑒定需要使用更復(fù)雜的圖位克隆方法，這個方法將標標記與突變基因記與突變基因聯(lián)系起來去劃分包含目的基因的區(qū)域。遺傳標記類型遺傳標記類型 主要分為4種，即形態(tài)學標記、細胞學標記、生物化學標記和DNADNA分子標記分子標記。 前三種標記都是以表現(xiàn)型為基礎(chǔ)的，而DNA分子標記則是在DNA水平遺傳變異上的直接反映，屬于基因型標記。 分子標記的概念有廣義和狹義之

5、分。廣義的分子標記是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)。狹義分子標記是指能反映生物個體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段，也就是所謂的多態(tài)性(polymorphism)。在這里所說的分子標記主要就是指多態(tài)性。分子標記分子標記 分子標記的優(yōu)點：分子標記的優(yōu)點： 可以在各發(fā)育時期的個體、組織、器官甚至細胞水平作檢測，既不受環(huán)境的影響，也不受基因表達與否的限制； 數(shù)量豐富； 遺傳穩(wěn)定； 對生物的影響表現(xiàn)“中性”； 操作簡便。分子標記的檢測技術(shù)分子標記的檢測技術(shù) 以分子雜交為基礎(chǔ)的分子標記(如限制性片段長度多態(tài)性，RFLP)； 以PCR檢測技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標記（如限制性片段長度多態(tài)性， R

6、FLP ；隨機擴展多態(tài)性DNA，RAPD ；擴展片段長度多態(tài)性， AFLP ）。AFLP技術(shù)步驟利用分子標記進行基因定位利用分子標記進行基因定位 利用分子標記來定位基因，最重要的條件是清晰的遺傳背景以及簡單的方法。 親緣關(guān)系過遠的雜交，后代發(fā)生性狀分離的情況復(fù)雜；使對結(jié)果的分析和判斷都非常困難。所以，很多定位基因的工作起始于“清理”遺傳背景，也就是建立近等基因系(near isotgenic line，NIL)。 用一個含有目的性狀(如抗病性)的供體親本(donor parent)與一優(yōu)良品種如栽培品種，輪回親本(recurrent parent)雜交，在F2代中選擇具有目的性狀的株系，使之與

7、輪回親本回交多代，最后產(chǎn)生的回交后代就是輪回親本的近等基因系。 建立近等基因系是基因定位的重要基礎(chǔ)，近等基因系方法在親本間遺傳背景相差很大的情況下幾乎是必須采用的方法。 缺點：1、需要連續(xù)回交多代，很費時； 2、期間得不到有意義的成果。分離群體分組分析法分離群體分組分析法 如果親本的親緣關(guān)系很近，可以直接在分離群體中根據(jù)目的性狀分組，一組具有目的性狀，一組沒有目的性狀。兩組之間的差異應(yīng)該主要在控制目的性狀的基因區(qū)域。 從每組中選取一定數(shù)量的植物，或者從每株植物分別提取DNA后混合，或者把植物組織混合后提取DNA，然后分析這兩組DNA，看目的性狀與哪個分子標記連鎖。這種方法叫做分離群體分組分析法

8、(Bulked Segregation Analysis，BSA) ，任何有效的標記系統(tǒng)都可以與BSA結(jié)合使用。圖位克隆圖位克隆 圖位克隆(map-based cloning)，也稱為定位克隆(positional cloning)，它是通過已知的遺傳標記來鑒定導致突變型的基因的方法。 這個方法的基本假設(shè)是：突變性狀控制基因與標記連鎖，所以它們之間的距離一定很近，在標記物附近應(yīng)該能夠?qū)び谘芯抗ぷ鞯慕K點。 MBC在模式植物擬南芥中相對簡單，但對其他植物還是很難。這是因為它有詳盡的基因組遺傳圖譜和物理圖譜；存在上萬個隨機分布的分子標記；遺傳轉(zhuǎn)化非常容易，而且已知基因的突變株可以非常方便地從擬南芥資

9、源中心得到。所以，驗證被克隆基因的功能，比其他植物要簡單得多。圖位克隆過程圖位克隆過程 1 1、構(gòu)建遺傳作圖群體、構(gòu)建遺傳作圖群體 一般說來，當標記為顯性遺傳時，欲獲得最大遺傳信息量的F2群體，須借助于進一步的子代測驗，以分辨F2中的雜合體。常使用分離群體分組分析法(bulked segregant analysis，BSA)，其原理是將目標基因的F2(或BC1)代分離體的各個體僅以目標基因所控制的性狀按雙親的表型分為兩群，每一群中的各個體DNA等量混合，形成兩個DNA混合池(如抗病和感病、不育和可育)。 2、篩選與目標基因連鎖的分子標記篩選與目標基因連鎖的分子標記 常用的分子標記有RFLP、

10、RAPD、SSR和AFLP等，研究者可依據(jù)不同的研究目標、對象、目的、條件等，選擇使用這些技術(shù)。 3、借助連鎖圖譜篩選分子標記、借助連鎖圖譜篩選分子標記 現(xiàn)在已建圖的植物已多達幾十種，其中包括了所有重要的農(nóng)作物和模式植物的遺傳圖譜已相當精細，含有數(shù)百甚至數(shù)千個標記。 高密度分子連鎖圖的繪制為篩選與目的基因緊密連鎖的分子標記提供了良好的開端。 4 4、借助比較基因組共享分子標記、借助比較基因組共享分子標記 比較基因組研究主要是利用相同的DNA分子標記在相關(guān)植物種之間進行遺傳或物理作圖，比較這些標記在不同物種基因組中的分布特點，揭示染色體或染色體片段上的基因及其排列順序的相同(共線性)或相似性(同

11、線性)，并由此對相關(guān)物種的基因組結(jié)構(gòu)和起源進化進行分析。 比較基因組作圖使建立高密度遺傳連鎖圖可利用的標記顯著增加，從而大大提高獲取離目標基因很近的分子標記的可能性。 5 5、局部區(qū)域的精細定位、作圖、局部區(qū)域的精細定位、作圖 一旦把目標基因定位在某染色體的特定區(qū)域后，接下來就要對其進行精細的作圖及篩選與目標基因緊密連鎖的分子標記。目前的作圖類型分為兩類，分別是遺傳圖譜遺傳圖譜和物理圖譜和物理圖譜。遺傳圖譜遺傳圖譜(genetic map)(genetic map) 又稱為連鎖圖譜(linkage map)，是指遺傳標記(genetic markers)在染色體上的相對位置，或稱“遺傳距離”。

12、 遺傳距離用遺傳標記在染色體交換過程中分離的頻率來表示，單位是cM (centimorgan，厘摩)。相距1cM的兩個遺傳標記在單染色體交叉(即姐妹染色單體發(fā)生重組)中，具有1相互分離的機會 遺傳圖譜對于分析基因組結(jié)構(gòu)、遺傳育種，以及與其他生物的進化關(guān)系的研究都十分重要。 構(gòu)建遺傳圖譜的主要基礎(chǔ)是擁有足夠多的遺傳標記。物理圖譜物理圖譜 遺傳圖譜表示的是標記之間的相對距離，而DNA序列上兩點之間的絕對距離用物理圖譜來表示。 物理圖譜是進行基因組DNA序列分析的基礎(chǔ)，它的標記都是分子標記，稱為“序列標記位點”(sequencing tagged site，STS)。物理圖譜的距離以堿基（bp）為單

13、位。 物理圖譜包括限制酶切圖譜(restriction map)、連續(xù)片段圖譜(contig map)和DNA序列圖譜，其中DNA序列圖譜是物理圖譜中最精細的圖譜。 在早期，圖譜的進展因缺乏足夠標記而受到阻礙。同工酶多態(tài)性分析使密度圖譜更容易創(chuàng)建。進一步顯著提高了以DNA為基礎(chǔ)和以PCR為基礎(chǔ)的標記系統(tǒng)的發(fā)明。因此,標記的可用性不再是一個瓶頸,今天,這基本上適用于任何生物體。利用標記我們可以構(gòu)建遺傳圖譜和物理圖譜。 6 6、染色體步行、登陸、染色體步行、登陸 找到與目標基因緊密連鎖的分子標記(最好分布在基因兩側(cè))和鑒定出分子標記所在的大片段克隆以后，接著是以該克隆為起點進行染色體步行，逐漸靠近目標基因，以該克隆的末端作為探針篩選基因組文庫，鑒定和分離出鄰近的基因組片段的克隆，再將這個克隆的遠端末端作為探針重新篩選基因組文庫。繼續(xù)這一過程，直到獲得具有目標基因兩側(cè)分子標記的大片段克隆或重疊群。 7 7、鑒定目標基因、鑒定目標基因 篩選和鑒定目的基因是圖位克隆技術(shù)的最后環(huán)節(jié)，找到與目的基因緊密連鎖的分子標記并鑒定出分子標記所在的大片段克隆后，接著是以該克隆為起點進行染色體步行，逐漸靠近目的基因。當遺傳連鎖圖譜指出基因所在的特定區(qū)域時，即可取回需要的克隆，獲得目的基因。 8 8、通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補驗證最終確定、通過遺傳轉(zhuǎn)化