多糖分離純化及含量測定

1、多多糖糖提提取取分分離離與與純純化化流流程程圖圖透析膜透析透析膜透析多糖的提取方法多糖的提取方法 1. 溶劑提取法溶劑提取法 水提醇沉法、酸提法、堿提法、超臨界流體萃取法水提醇沉法、酸提法、堿提法、超臨界流體萃取法 2. 酶解提取法酶解提取法 單一酶解法、復(fù)合酶解法單一酶解法、復(fù)合酶解法 3. 強(qiáng)化提取法強(qiáng)化提取法 超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、高壓脈沖法超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、高壓脈沖法 1. 溶劑法：水提醇沉法溶劑法：水提醇沉法 多糖是極性大分子化合物，提取時(shí)應(yīng)選擇水、醇等極性多糖是極性大分子化合物，提取時(shí)應(yīng)選擇水、醇等極性強(qiáng)的溶劑。強(qiáng)的溶劑。水提醇沉法水提醇沉法是提取多糖最

2、常用的一種方法。是提取多糖最常用的一種方法。 用水作溶劑用水作溶劑來提取多糖時(shí)，可以用熱水浸煮提取，也可來提取多糖時(shí)，可以用熱水浸煮提取，也可以用冷水浸提滲以用冷水浸提滲漉漉，然后將，然后將提取液濃縮提取液濃縮后，在濃縮液中后，在濃縮液中加乙醇，使其最終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到加乙醇，使其最終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70 %左右，利用多糖不左右，利用多糖不溶于乙醇的性質(zhì)，使多糖從提取液中沉淀出來，室溫靜溶于乙醇的性質(zhì)，使多糖從提取液中沉淀出來，室溫靜置一定的時(shí)間，多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和得率均較高。置一定的時(shí)間，多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和得率均較高。 影響多糖提取率的因素有：水的用量、提取溫度、浸影響多糖提取率的因素有：水的用量、提取

3、溫度、浸提固液比、提取時(shí)間以及提取次數(shù)等。提固液比、提取時(shí)間以及提取次數(shù)等。 該種方法提取多糖不需特殊設(shè)備，生產(chǎn)工藝成本低，該種方法提取多糖不需特殊設(shè)備，生產(chǎn)工藝成本低，安全，適合工業(yè)化大生產(chǎn)，是一種可取的提取方法。安全，適合工業(yè)化大生產(chǎn)，是一種可取的提取方法。 但由于水的極性大，容易把蛋白質(zhì)、苷類等水溶性的但由于水的極性大，容易把蛋白質(zhì)、苷類等水溶性的成分浸提出來，從而使提取液存放時(shí)腐敗變質(zhì)，成分浸提出來，從而使提取液存放時(shí)腐敗變質(zhì)，為后為后續(xù)的分離帶來困難，且該法提取比較耗時(shí)，提取率也續(xù)的分離帶來困難，且該法提取比較耗時(shí)，提取率也不高。不高。溶劑法：酸提法溶劑法：酸提法 為了提高多糖的提取

4、率，在水提醇沉法的基礎(chǔ)上發(fā)展為了提高多糖的提取率，在水提醇沉法的基礎(chǔ)上發(fā)展了酸提取法。了酸提取法。 如某些含葡萄糖醛酸等酸性基團(tuán)的多糖在較低如某些含葡萄糖醛酸等酸性基團(tuán)的多糖在較低pH 值下值下難以溶解；難以溶解； 含有胺基的多糖可使用乙酸或鹽酸調(diào)節(jié)提取液成酸性含有胺基的多糖可使用乙酸或鹽酸調(diào)節(jié)提取液成酸性進(jìn)行提取，然后進(jìn)行提取，然后再加乙醇使多糖沉淀析出再加乙醇使多糖沉淀析出，也可加入，也可加入銅鹽等生成不溶性絡(luò)合物或鹽類沉淀而析出銅鹽等生成不溶性絡(luò)合物或鹽類沉淀而析出。 影響多糖提取率的因素有：水的用量、影響多糖提取率的因素有：水的用量、pH值、提取溫值、提取溫度、浸提固液比、提取時(shí)間以及

5、提取次數(shù)等。度、浸提固液比、提取時(shí)間以及提取次數(shù)等。 由于由于H的存在抑制了酸性雜質(zhì)的溶出，稀酸提取法提的存在抑制了酸性雜質(zhì)的溶出，稀酸提取法提取得到的多糖產(chǎn)品純度相對(duì)較高；取得到的多糖產(chǎn)品純度相對(duì)較高； 但在酸性條件下可能引起多糖中糖苷鍵的斷裂，且酸但在酸性條件下可能引起多糖中糖苷鍵的斷裂，且酸會(huì)對(duì)容器造成腐蝕，除弱酸外，一般不宜采用。會(huì)對(duì)容器造成腐蝕，除弱酸外，一般不宜采用。 因此因此酸提法也存在一定的不足之處酸提法也存在一定的不足之處。溶劑法：堿提法溶劑法：堿提法 有的酸性多糖有的酸性多糖, 或分子量較大的多糖或分子量較大的多糖, 在熱水中溶解度在熱水中溶解度不大不大, 一般在稀堿溶液中

6、溶解度較大一般在稀堿溶液中溶解度較大, 所以常用稀的所以常用稀的NaOH 溶液或溶液或Na2CO3 溶液提取。不過用稀堿溶液提取溶液提取。不過用稀堿溶液提取時(shí)時(shí), 提取溫度必須保持在提取溫度必須保持在10 以下以下, 否則多糖容易發(fā)生否則多糖容易發(fā)生降解反應(yīng)。降解反應(yīng)。 多糖在堿性溶液中穩(wěn)定，例如粘多糖的提取多采用堿多糖在堿性溶液中穩(wěn)定，例如粘多糖的提取多采用堿提取法。提取法。 多糖多糖堿法提取堿法提取雖然可提高多糖的收率雖然可提高多糖的收率, 且可縮短提取時(shí)且可縮短提取時(shí)間間, 但提取液中含有其它雜質(zhì)如蛋白質(zhì)但提取液中含有其它雜質(zhì)如蛋白質(zhì), 粘度過大粘度過大, 過濾過濾困難困難, 且有些多糖

7、在堿性較強(qiáng)時(shí)會(huì)水解。且有些多糖在堿性較強(qiáng)時(shí)會(huì)水解。 通常先用熱水法提取通常先用熱水法提取, 然后殘?jiān)儆孟A溶液提取然后殘?jiān)儆孟A溶液提取, 這這樣可將大部分多種類型的多糖提取出來。樣可將大部分多種類型的多糖提取出來。溶劑法：超臨界流體萃取法溶劑法：超臨界流體萃取法 超臨界流體超臨界流體是指物質(zhì)處于臨界溫度和臨界壓力以上時(shí)的是指物質(zhì)處于臨界溫度和臨界壓力以上時(shí)的狀態(tài)，這種流體兼有液體和氣體的特點(diǎn)，即密度大，粘狀態(tài)，這種流體兼有液體和氣體的特點(diǎn)，即密度大，粘稠度小，有極高的溶解，滲透到提取材料的基質(zhì)中，發(fā)稠度小，有極高的溶解，滲透到提取材料的基質(zhì)中，發(fā)揮非常有效的萃取功能。而且這種溶解能力隨著

8、壓力的揮非常有效的萃取功能。而且這種溶解能力隨著壓力的升高而增大，提取結(jié)束后，再通過減壓將其釋放出來，升高而增大，提取結(jié)束后，再通過減壓將其釋放出來，具有保持有效成分的活性和無溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)。具有保持有效成分的活性和無溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)。 超臨界流體萃取技術(shù)超臨界流體萃取技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新的提是近年來發(fā)展起來的一種新的提取分離技術(shù)。由于取分離技術(shù)。由于CO2 的超臨界條件（的超臨界條件（TC31.26 ，Tp7.38 MPa）容易達(dá)到，常作為超臨界萃取的溶劑）容易達(dá)到，常作為超臨界萃取的溶劑，在壓力為，在壓力為840 MPa 時(shí)的超臨界時(shí)的超臨界CO2 足以溶解任何足以溶解任何非極性、中

9、極性化合物，在加入夾帶劑后則可溶解極非極性、中極性化合物，在加入夾帶劑后則可溶解極性化物。性化物。 由于糖類的化合物分子量較大、羥基多、極性大，用由于糖類的化合物分子量較大、羥基多、極性大，用純二氧化碳提取產(chǎn)率較低，加入夾帶劑或加大壓力則純二氧化碳提取產(chǎn)率較低，加入夾帶劑或加大壓力則可提高提取率。該法的缺點(diǎn)是設(shè)備復(fù)雜，運(yùn)行成本高可提高提取率。該法的缺點(diǎn)是設(shè)備復(fù)雜，運(yùn)行成本高，提取范圍有限。，提取范圍有限。2. 酶解法：單一酶解法酶解法：單一酶解法 單一酶解法單一酶解法是指使用一種酶來提取多糖，從而提高提是指使用一種酶來提取多糖，從而提高提取率的生物技術(shù)。其中經(jīng)常使用的酶有蛋白酶、纖維取率的生物

10、技術(shù)。其中經(jīng)常使用的酶有蛋白酶、纖維素酶等。素酶等。 蛋白酶蛋白酶對(duì)植物細(xì)胞中游離的蛋白質(zhì)具有分解作用，使對(duì)植物細(xì)胞中游離的蛋白質(zhì)具有分解作用，使其結(jié)構(gòu)變得松散；蛋白酶還會(huì)使糖蛋白和蛋白聚糖中其結(jié)構(gòu)變得松散；蛋白酶還會(huì)使糖蛋白和蛋白聚糖中游離的蛋白質(zhì)水解，降低它們對(duì)原料的結(jié)合力，有利游離的蛋白質(zhì)水解，降低它們對(duì)原料的結(jié)合力，有利于多糖的浸出。于多糖的浸出。 纖維素酶纖維素酶則能特異性地降解纖維素，使植物細(xì)胞的細(xì)則能特異性地降解纖維素，使植物細(xì)胞的細(xì)胞壁破裂，有利于多糖易從胞內(nèi)釋放。胞壁破裂，有利于多糖易從胞內(nèi)釋放。 影響因素：酶種類和添加量、酶解溫度影響因素：酶種類和添加量、酶解溫度()、酶解

11、、酶解pH 值、水解時(shí)間、料液比有直接關(guān)系。值、水解時(shí)間、料液比有直接關(guān)系。酶解法：復(fù)合酶解法酶解法：復(fù)合酶解法 復(fù)合酶解法復(fù)合酶解法采用一定比例的果膠酶、纖維素酶及中性采用一定比例的果膠酶、纖維素酶及中性蛋白酶，主要利用纖維素酶和果膠酶水解纖維素和果蛋白酶，主要利用纖維素酶和果膠酶水解纖維素和果膠，膠，使植物組織細(xì)胞的細(xì)胞壁破裂使植物組織細(xì)胞的細(xì)胞壁破裂，釋放細(xì)胞壁內(nèi)的，釋放細(xì)胞壁內(nèi)的活性多糖，多糖釋放的多少和復(fù)合酶的加入量、酶解活性多糖，多糖釋放的多少和復(fù)合酶的加入量、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH 值及料液比有直接的關(guān)系。值及料液比有直接的關(guān)系。 酶解法酶解法提取的實(shí)質(zhì)

12、是通過酶解反應(yīng)強(qiáng)化傳質(zhì)過程。該提取的實(shí)質(zhì)是通過酶解反應(yīng)強(qiáng)化傳質(zhì)過程。該法具有條件溫和、雜質(zhì)易除和得率高等優(yōu)點(diǎn)。法具有條件溫和、雜質(zhì)易除和得率高等優(yōu)點(diǎn)。3. 物理強(qiáng)化法：超聲波輔助提取法物理強(qiáng)化法：超聲波輔助提取法 超聲波是頻率高于超聲波是頻率高于20kHz的聲波的聲波，它方向性好，穿透，它方向性好，穿透能力強(qiáng)，易于獲得較集中的聲能。能力強(qiáng)，易于獲得較集中的聲能。 超聲波提取是利用超聲波的超聲波提取是利用超聲波的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)效應(yīng)。 機(jī)械效應(yīng)機(jī)械效應(yīng)可增大介質(zhì)的運(yùn)動(dòng)速度及穿透力，能有效的可增大介質(zhì)的運(yùn)動(dòng)速度及穿透力，能有效的破碎生物細(xì)胞和組織，從而使提取的有效成

13、分溶解于破碎生物細(xì)胞和組織，從而使提取的有效成分溶解于溶劑之中；溶劑之中； 空化作用空化作用, 形成高溫和高壓的環(huán)境形成高溫和高壓的環(huán)境, 增加物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)增加物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)的頻率和速度、溶劑的穿透力的頻率和速度、溶劑的穿透力, 從而加速目標(biāo)成分進(jìn)入從而加速目標(biāo)成分進(jìn)入溶劑溶劑, 提高提取率。提高提取率。 熱效應(yīng)熱效應(yīng)增大了有效成分的溶解速度，這種熱效應(yīng)是瞬增大了有效成分的溶解速度，這種熱效應(yīng)是瞬間的，可使被提取成分的生物活性盡量保持不變。間的，可使被提取成分的生物活性盡量保持不變。 影響因素有：超聲波的頻率、功率、溫度、時(shí)間、料影響因素有：超聲波的頻率、功率、溫度、時(shí)間、料液比、超聲波發(fā)生器的

14、型式。液比、超聲波發(fā)生器的型式。 超聲提取可極大地提高提取效率超聲提取可極大地提高提取效率, 節(jié)約溶劑節(jié)約溶劑, 避免高溫避免高溫對(duì)提取成分的影響對(duì)提取成分的影響, 與常規(guī)提取法相比與常規(guī)提取法相比, 具有提取時(shí)間具有提取時(shí)間短、產(chǎn)率高、無需加熱等優(yōu)點(diǎn)。短、產(chǎn)率高、無需加熱等優(yōu)點(diǎn)。 值得注意的是超聲時(shí)間不宜過長值得注意的是超聲時(shí)間不宜過長,否則提取量反而下降否則提取量反而下降, 原因可能是由于原因可能是由于超聲處理時(shí)間過長超聲處理時(shí)間過長, 導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化變化, 糖鏈斷裂糖鏈斷裂, 使多糖提取含量下降。使多糖提取含量下降。物理強(qiáng)化法：微波輔助提取法物理強(qiáng)化法：微波輔助提取

15、法 微波微波是指波長在是指波長在1mm到到1m范圍（相對(duì)頻率為范圍（相對(duì)頻率為300 300000MHz）的電磁波，介于紅外與無線電波之間。）的電磁波，介于紅外與無線電波之間。 微波協(xié)助萃取植物藥材時(shí)，一方面是微波協(xié)助萃取植物藥材時(shí)，一方面是利用微波透過萃利用微波透過萃取劑到達(dá)物料內(nèi)部取劑到達(dá)物料內(nèi)部，由于物料腺細(xì)胞系統(tǒng)含水量高，由于物料腺細(xì)胞系統(tǒng)含水量高，水分子吸收微波能，產(chǎn)生大量的熱量，所以能快速被水分子吸收微波能，產(chǎn)生大量的熱量，所以能快速被加熱，使胞內(nèi)溫度迅速升高，液態(tài)水汽化產(chǎn)生的壓力加熱，使胞內(nèi)溫度迅速升高，液態(tài)水汽化產(chǎn)生的壓力將細(xì)胞膜和細(xì)胞壁沖破，形成微小的孔洞。將細(xì)胞膜和細(xì)胞壁沖

16、破，形成微小的孔洞。 進(jìn)一步加熱，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部和細(xì)胞壁水分減少，細(xì)胞進(jìn)一步加熱，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部和細(xì)胞壁水分減少，細(xì)胞收縮，表面出現(xiàn)裂紋?？锥椿蛄鸭y的存在使胞外溶劑收縮，表面出現(xiàn)裂紋?？锥椿蛄鸭y的存在使胞外溶劑容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，溶解并釋放出胞內(nèi)有效成分，再擴(kuò)容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，溶解并釋放出胞內(nèi)有效成分，再擴(kuò)散到萃取劑中；散到萃取劑中； 另一方面，在固液萃取過程中，固體表面的另一方面，在固液萃取過程中，固體表面的液膜液膜通常通常是由極性強(qiáng)的萃取劑所組成，在微波輻射作用下，強(qiáng)是由極性強(qiáng)的萃取劑所組成，在微波輻射作用下，強(qiáng)極性分子將瞬時(shí)極化，并以每秒極性分子將瞬時(shí)極化，并以每秒2.45109次的速度做次的速度

17、做極性變換運(yùn)動(dòng)，這就可能對(duì)液膜層產(chǎn)生一定的極性變換運(yùn)動(dòng)，這就可能對(duì)液膜層產(chǎn)生一定的微觀微觀“擾動(dòng)擾動(dòng)”影響，使附在固相周圍的液膜變薄，溶劑與溶影響，使附在固相周圍的液膜變薄，溶劑與溶質(zhì)之間的結(jié)合力受到一定程度的削弱，從而使固液浸質(zhì)之間的結(jié)合力受到一定程度的削弱，從而使固液浸取的擴(kuò)散過程所受的阻力減小，促進(jìn)擴(kuò)散過程的進(jìn)行取的擴(kuò)散過程所受的阻力減小，促進(jìn)擴(kuò)散過程的進(jìn)行。 在微波協(xié)助浸取過程中，萃取劑種類、微波劑量、物在微波協(xié)助浸取過程中，萃取劑種類、微波劑量、物料含水量、溫度、萃取時(shí)間及料含水量、溫度、萃取時(shí)間及pH值等都對(duì)萃取效果產(chǎn)值等都對(duì)萃取效果產(chǎn)生影響。其中，萃取劑種類、微波作用時(shí)間和溫度對(duì)

18、生影響。其中，萃取劑種類、微波作用時(shí)間和溫度對(duì)萃取效果影響較大。萃取效果影響較大。 微波輔助提取多糖和其他的萃取方法比較，微波萃取微波輔助提取多糖和其他的萃取方法比較，微波萃取效率高，操作簡單，且不會(huì)引入雜質(zhì)，多糖純度高，效率高，操作簡單，且不會(huì)引入雜質(zhì)，多糖純度高，能耗小，操作費(fèi)用低，符合環(huán)境保護(hù)要求，是很好的能耗小，操作費(fèi)用低，符合環(huán)境保護(hù)要求，是很好的多糖提取方法。多糖提取方法。物理強(qiáng)化法：高壓脈沖法物理強(qiáng)化法：高壓脈沖法 高壓脈沖法高壓脈沖法是對(duì)兩電極間的流態(tài)物料反復(fù)施加高電壓是對(duì)兩電極間的流態(tài)物料反復(fù)施加高電壓的短脈沖（典型為的短脈沖（典型為2080 kV/cm）進(jìn)行處理。）進(jìn)行處理

19、。 動(dòng)物、植物、微生物的細(xì)胞，在外加電場作用下，產(chǎn)動(dòng)物、植物、微生物的細(xì)胞，在外加電場作用下，產(chǎn)生生橫跨膜電位橫跨膜電位，絕緣的生物膜由于電場形成了微孔，絕緣的生物膜由于電場形成了微孔，通透性發(fā)生變化，當(dāng)整個(gè)膜電位達(dá)到極限值通透性發(fā)生變化，當(dāng)整個(gè)膜電位達(dá)到極限值(約為約為1V)時(shí)，膜破裂，膜結(jié)構(gòu)變成無序狀態(tài)，形成細(xì)孔，滲透時(shí)，膜破裂，膜結(jié)構(gòu)變成無序狀態(tài)，形成細(xì)孔，滲透能力增強(qiáng)。電位差達(dá)到臨界點(diǎn)，細(xì)胞破裂。從而有利能力增強(qiáng)。電位差達(dá)到臨界點(diǎn)，細(xì)胞破裂。從而有利于多糖的提取。于多糖的提取。二、多糖的分離純化二、多糖的分離純化 1. 除蛋白除蛋白 Sevage 法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷法法、三氯

20、乙酸法、三氟三氯乙烷法 2. 色素的去除色素的去除 吸附法（吸附法（DEAE-纖維素、硅藻土等）、氧化法（過氧纖維素、硅藻土等）、氧化法（過氧化氫）、離子交換法化氫）、離子交換法 3. 多糖的純化多糖的純化 超濾法、季胺鹽沉淀法、柱層析法和色譜法等超濾法、季胺鹽沉淀法、柱層析法和色譜法等1. 除蛋白除蛋白 采用醇沉或其它溶劑沉淀得到的粗多糖中常含有較多采用醇沉或其它溶劑沉淀得到的粗多糖中常含有較多的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì), 需要除蛋白。需要除蛋白。 除蛋白的方法傳統(tǒng)上有除蛋白的方法傳統(tǒng)上有Sevage 法、三氯乙酸法、三氟法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷法三氯乙烷法等。等。 Sevage 法法 根據(jù)蛋白質(zhì)

21、在氯仿等有機(jī)溶劑中變性的特點(diǎn)，用根據(jù)蛋白質(zhì)在氯仿等有機(jī)溶劑中變性的特點(diǎn)，用V(氯氯仿仿) V(戊醇或正丁醇戊醇或正丁醇)為為5 1 或或4 1，混合物劇烈振，混合物劇烈振搖搖2030 min，蛋白質(zhì)變性生成凝膠，離心分離，分，蛋白質(zhì)變性生成凝膠，離心分離，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)。去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)。 一般按多糖水溶液的一般按多糖水溶液的1/51/4體積加入。體積加入。 此種方法只能除去少量蛋白質(zhì)，須反復(fù)多次，多糖有損失，此種方法只能除去少量蛋白質(zhì)，須反復(fù)多次，多糖有損失，得率不高得率不高, 且氯仿對(duì)人體也有一定毒性且氯仿對(duì)人體也有一定毒性, 操作時(shí)應(yīng)注意。操作時(shí)應(yīng)注意

22、。 該法優(yōu)點(diǎn)是條件溫和該法優(yōu)點(diǎn)是條件溫和, 可避免多糖的降解。利用蛋白酶可水可避免多糖的降解。利用蛋白酶可水解蛋白質(zhì)的特性解蛋白質(zhì)的特性, 在多糖樣品溶液中加入一些蛋白質(zhì)水解酶在多糖樣品溶液中加入一些蛋白質(zhì)水解酶如中性蛋白酶和糜蛋白酶如中性蛋白酶和糜蛋白酶, 再用再用Sevage 法效果更佳。法效果更佳。 此法不能除去脂蛋白，因?yàn)橹鞍兹苡诼确?。此法不能除去脂蛋白，因?yàn)橹鞍兹苡诼确隆Ｈ纫宜岱ㄈ纫宜岱?三氯乙酸三氯乙酸是一種有機(jī)酸，使多糖提取液中的蛋白質(zhì)與是一種有機(jī)酸，使多糖提取液中的蛋白質(zhì)與有機(jī)酸作用而變性沉淀。有機(jī)酸作用而變性沉淀。 該法是在多糖水提液中滴加該法是在多糖水提液中滴加5%

23、10%與多糖水提取液與多糖水提取液等體積的三氯乙酸，混勻靜置過夜，離心除去膠狀沉等體積的三氯乙酸，混勻靜置過夜，離心除去膠狀沉淀，重復(fù)以上的操作直至溶液不再繼續(xù)混濁為止，得淀，重復(fù)以上的操作直至溶液不再繼續(xù)混濁為止，得無蛋白質(zhì)的多糖。無蛋白質(zhì)的多糖。 三氯乙酸濃度越大，除蛋白質(zhì)效果越好，但對(duì)多糖的三氯乙酸濃度越大，除蛋白質(zhì)效果越好，但對(duì)多糖的影響也越大，可能是三氯乙酸影響也越大，可能是三氯乙酸對(duì)多糖結(jié)構(gòu)具有破壞作對(duì)多糖結(jié)構(gòu)具有破壞作用，使多糖降解用，使多糖降解，而且這種破壞作用隨著三氯乙酸濃，而且這種破壞作用隨著三氯乙酸濃度增大而增強(qiáng)。度增大而增強(qiáng)。三氟三氯乙烷法三氟三氯乙烷法 將多糖溶液與三

24、氟三氯乙烷等體積混合，低溫?cái)嚢鑼⒍嗵侨芤号c三氟三氯乙烷等體積混合，低溫?cái)嚢?0 min 左右，離心分離得上層水層，水層繼續(xù)用上述方左右，離心分離得上層水層，水層繼續(xù)用上述方法反復(fù)處理幾次，得無蛋白質(zhì)的多糖溶液，此法效率法反復(fù)處理幾次，得無蛋白質(zhì)的多糖溶液，此法效率較較Seavg 法高，但溶劑沸點(diǎn)低，易揮發(fā)，不宜大量應(yīng)法高，但溶劑沸點(diǎn)低，易揮發(fā)，不宜大量應(yīng)用。用。2. 色素的去除色素的去除 中草藥來源的多糖中草藥來源的多糖, 可能含有酚型化合物而顏色較深可能含有酚型化合物而顏色較深, 這類色素大多呈負(fù)性離子這類色素大多呈負(fù)性離子,不能用活性炭吸附劑脫色不能用活性炭吸附劑脫色, 可以用弱堿性樹脂可

25、以用弱堿性樹脂DEAE-纖維素來吸附色素纖維素來吸附色素，這樣不，這樣不僅可以達(dá)到脫色的目的僅可以達(dá)到脫色的目的, 而且可以進(jìn)行多糖的分離。而且可以進(jìn)行多糖的分離。 若多糖與色素結(jié)合若多糖與色素結(jié)合, 易被易被DEAE 纖維素吸附纖維素吸附, 不能被水不能被水洗脫洗脫, 這類色素可用這類色素可用低溫氧化法脫色低溫氧化法脫色，溫度較高下氧化，溫度較高下氧化易引起多糖的降解。易引起多糖的降解。 對(duì)于同時(shí)含有游離蛋白質(zhì)和色素的多糖對(duì)于同時(shí)含有游離蛋白質(zhì)和色素的多糖, 可通過可通過生成金生成金屬絡(luò)合物的方法以同時(shí)除去蛋白和色素屬絡(luò)合物的方法以同時(shí)除去蛋白和色素, 方法是加入菲方法是加入菲林試劑、氯化銅

26、、氫氧化鋇和醋酸鉛等與多糖生成不林試劑、氯化銅、氫氧化鋇和醋酸鉛等與多糖生成不溶性絡(luò)合物溶性絡(luò)合物, 經(jīng)分離后用陰離子交換樹脂分解絡(luò)合物得經(jīng)分離后用陰離子交換樹脂分解絡(luò)合物得到多糖。到多糖。 3. 多糖的純化多糖的純化 超濾法超濾法 季胺鹽沉淀法季胺鹽沉淀法 柱層析法柱層析法 色譜法色譜法 其他方法其他方法超濾法超濾法 膜分離技術(shù)膜分離技術(shù)（membrane separation technology，MST）是一種高效分離技術(shù)，分離過程以選擇透過性膜作）是一種高效分離技術(shù)，分離過程以選擇透過性膜作為分離介質(zhì)，通過在膜兩側(cè)施加某種推動(dòng)力（壓力差為分離介質(zhì)，通過在膜兩側(cè)施加某種推動(dòng)力（壓力差、化

27、學(xué)位差、電位差等），使原料液中組分有選擇性、化學(xué)位差、電位差等），使原料液中組分有選擇性的通過膜。目前應(yīng)用較多的是超濾和微濾技術(shù)。如采的通過膜。目前應(yīng)用較多的是超濾和微濾技術(shù)。如采用中空纖維超濾膜用中空纖維超濾膜, 對(duì)多糖去蛋白質(zhì)后的提取液通過超對(duì)多糖去蛋白質(zhì)后的提取液通過超濾去除小分子雜質(zhì)。濾去除小分子雜質(zhì)。季胺鹽沉淀法季胺鹽沉淀法 季銨鹽及其氫氧化物是一類乳化劑季銨鹽及其氫氧化物是一類乳化劑, 可與酸性糖形成不可與酸性糖形成不溶性沉淀溶性沉淀, 常用于常用于酸性多糖的分離酸性多糖的分離。當(dāng)溶液的。當(dāng)溶液的pH 值增值增高或加入硼砂緩沖液使糖的酸度增高高或加入硼砂緩沖液使糖的酸度增高, 也會(huì)

28、與中性多糖也會(huì)與中性多糖形成沉淀。形成沉淀。 常用的季銨溴化物常用的季銨溴化物(CTAB) 及其氫氧化物及其氫氧化物(CTA-OH) 和和十六烷基氯化吡啶十六烷基氯化吡啶 (CPC) , 其濃度一般為其濃度一般為1% 10% (W /V ), 它們可在酸性、中性、微堿性和堿性中分級(jí)沉它們可在酸性、中性、微堿性和堿性中分級(jí)沉淀分離出酸性多糖。淀分離出酸性多糖。 柱層析方法柱層析方法 纖維素柱層析纖維素柱層析 陰離子交換柱層析陰離子交換柱層析 凝膠柱層析凝膠柱層析 親和層析親和層析 纖維素柱層析纖維素柱層析 柱中的載體是纖維素。柱中的載體是纖維素。先用乙醇液將柱內(nèi)纖維素平衡先用乙醇液將柱內(nèi)纖維素平

29、衡好好, 然后將多糖混合物全部沉淀于惰性的纖維素上面。然后將多糖混合物全部沉淀于惰性的纖維素上面。用不同濃度乙醇水溶液用不同濃度乙醇水溶液(如如80%, 60%, 40%, 20% ) 梯度梯度洗脫洗脫, 則不同多糖就依次洗脫出來。則不同多糖就依次洗脫出來。先洗脫的是分子量先洗脫的是分子量最小的多糖最小的多糖, 最終洗脫的是分子量最大的多糖。最終洗脫的是分子量最大的多糖。在洗脫在洗脫過程中過程中, 由于各種多糖在柱上進(jìn)行無數(shù)次的溶解和沉淀由于各種多糖在柱上進(jìn)行無數(shù)次的溶解和沉淀過程過程, 最終將各種多糖分離開來。最終將各種多糖分離開來。 這種方法實(shí)質(zhì)上與分步沉淀法相反這種方法實(shí)質(zhì)上與分步沉淀法

30、相反, 可稱其為分步溶解可稱其為分步溶解法。其理論塔板數(shù)較高法。其理論塔板數(shù)較高, 所以流出液的純度高。所以流出液的純度高。 但該法的缺點(diǎn)是流速慢但該法的缺點(diǎn)是流速慢, 純化周期長純化周期長, 特別是對(duì)于粘度特別是對(duì)于粘度較大的酸性多糖較大的酸性多糖, 更顯得流速過慢。更顯得流速過慢。 陰離子交換柱層析陰離子交換柱層析 至今應(yīng)用最廣泛的陰離子交換劑有二乙基氨基乙基纖維至今應(yīng)用最廣泛的陰離子交換劑有二乙基氨基乙基纖維素素(DEAE-cellulose) , DEAE-葡聚糖葡聚糖(DEAE-Sephadex) 及及DEAE-瓊脂糖瓊脂糖(DEAE-Sepharose) 三種三種, 其中以其中以D

31、EAE-cellulose 應(yīng)用得最廣泛。應(yīng)用得最廣泛。DEAE-cellulose 具有開放性的具有開放性的骨架骨架, 多糖能自由進(jìn)入載體中并進(jìn)行迅速擴(kuò)散。它有較多糖能自由進(jìn)入載體中并進(jìn)行迅速擴(kuò)散。它有較大的比表面積大的比表面積, 雖然其離子交換容量僅為雖然其離子交換容量僅為0.70 0.75 mmol/g, 但其對(duì)多糖的吸附量較離子交換樹脂大許多。但其對(duì)多糖的吸附量較離子交換樹脂大許多。 陰離子交換柱層析陰離子交換柱層析是目前多糖純化中（也是柱層析中是目前多糖純化中（也是柱層析中）應(yīng)用最普遍的一種方法）應(yīng)用最普遍的一種方法, 特別是對(duì)于體積較大的多糖特別是對(duì)于體積較大的多糖溶液溶液, 大多

32、數(shù)首先采用陰離子交換柱層析。通過柱層析大多數(shù)首先采用陰離子交換柱層析。通過柱層析, 多糖溶液得到濃縮及初步純化多糖溶液得到濃縮及初步純化(有的多糖通過該步驟有的多糖通過該步驟即可得到各種均一多糖組分即可得到各種均一多糖組分)。 由于纖維素上的離子交換基團(tuán)較少由于纖維素上的離子交換基團(tuán)較少, 排列疏散且呈弱堿排列疏散且呈弱堿性性, 所以對(duì)大分子的吸附較弱所以對(duì)大分子的吸附較弱, 用一定離子濃度的鹽就用一定離子濃度的鹽就可將其洗脫下來?？蓪⑵湎疵撓聛怼?陰離子交換柱層析適合于分離各種酸性、中性多糖及陰離子交換柱層析適合于分離各種酸性、中性多糖及粘多糖。它的分離機(jī)理包括粘多糖。它的分離機(jī)理包括離子交

33、換離子交換, 而更重要的是吸而更重要的是吸附與解吸附附與解吸附, 所以其不僅可應(yīng)用于中性多糖與酸性多糖所以其不僅可應(yīng)用于中性多糖與酸性多糖的分離的分離, 也可應(yīng)用于不同中性多糖的分離。也可應(yīng)用于不同中性多糖的分離。 凝膠柱層析凝膠柱層析 根據(jù)多糖分子的大小和形狀的不同即按分子篩的原理根據(jù)多糖分子的大小和形狀的不同即按分子篩的原理進(jìn)行分離的進(jìn)行分離的。凝膠柱層析在多糖的分離純化上應(yīng)用得。凝膠柱層析在多糖的分離純化上應(yīng)用得很普遍。通常在獲得粗多糖后很普遍。通常在獲得粗多糖后, 先用陰離子交換柱層析先用陰離子交換柱層析、透析、干燥、透析、干燥, 溶解后再用凝膠柱層析。溶解后再用凝膠柱層析。 凝膠柱層

34、析是目前植物多糖最常用的高級(jí)純化方法。凝膠柱層析是目前植物多糖最常用的高級(jí)純化方法。 常用的凝膠有各種型號(hào)的交聯(lián)葡聚糖凝膠常用的凝膠有各種型號(hào)的交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex)、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖凝膠(Sepharose) 和聚丙烯酰胺凝膠和聚丙烯酰胺凝膠(Bio-gel)三大類，以及后來在這些凝膠上進(jìn)行性能改良的新一三大類，以及后來在這些凝膠上進(jìn)行性能改良的新一代凝膠代凝膠, 如如Sephacryl、Superdex 和和Superose 等。等。展開展開劑為各種濃度的鹽溶液及緩沖溶液劑為各種濃度的鹽溶液及緩沖溶液, 離子強(qiáng)度最好不低離子強(qiáng)度最好不低于于0.2 mol/L (否則拖尾嚴(yán)重否

35、則拖尾嚴(yán)重)。 親和層析親和層析 某些特定多糖具有和某些相對(duì)應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合某些特定多糖具有和某些相對(duì)應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合的特性的特性, 如一種如一種凝集素凝集素(刀豆球蛋白刀豆球蛋白) 能專一地與分支多能專一地與分支多糖結(jié)合。分子之間的這種結(jié)合能力稱為親和力糖結(jié)合。分子之間的這種結(jié)合能力稱為親和力, 使它們使它們結(jié)合后再將其解離結(jié)合后再將其解離, 可以純化多糖?？梢约兓嗵?。 把欲分離的可親和的一對(duì)分子的一方作為把欲分離的可親和的一對(duì)分子的一方作為配基配基(ligand)與不溶性載體結(jié)合使固定化與不溶性載體結(jié)合使固定化, 裝入色譜柱裝入色譜柱(親和柱親和柱), 然后然后把含有欲分離的多糖

36、溶液作把含有欲分離的多糖溶液作流動(dòng)相流動(dòng)相, 這時(shí)溶液中只有能這時(shí)溶液中只有能和和配基具有親和力的多糖分子被結(jié)合而吸附配基具有親和力的多糖分子被結(jié)合而吸附, 其他多糖其他多糖則流出柱外則流出柱外, 然后再改變流動(dòng)相的離子強(qiáng)度及然后再改變流動(dòng)相的離子強(qiáng)度及pH, 使配使配基與多糖解離基與多糖解離, 則被純化的多糖就流出柱外。則被純化的多糖就流出柱外。 其他方法其他方法 分級(jí)沉淀法分級(jí)沉淀法 大多數(shù)活性多糖可溶于水，大多數(shù)活性多糖可溶于水，3 個(gè)碳以下個(gè)碳以下的多糖還可溶于乙醇，的多糖還可溶于乙醇，隨著聚合度的增大，多糖在乙隨著聚合度的增大，多糖在乙醇中的溶解度逐漸降低。醇中的溶解度逐漸降低。根據(jù)

37、這一性質(zhì)可在多糖的濃根據(jù)這一性質(zhì)可在多糖的濃縮水溶液中分批加入乙醇，使乙醇的體積濃度逐漸增縮水溶液中分批加入乙醇，使乙醇的體積濃度逐漸增加到加到50，100，200，900 mL/L，從而使不同聚合度的，從而使不同聚合度的多糖分別沉淀析出。多糖分別沉淀析出。 如在五味子多糖提取液中加入無水乙醇，使其體積分如在五味子多糖提取液中加入無水乙醇，使其體積分?jǐn)?shù)分別達(dá)到數(shù)分別達(dá)到10 %，30 %，45 %，65 %，進(jìn)行分級(jí)沉，進(jìn)行分級(jí)沉淀，最后將剩余的母液直接蒸發(fā)濃縮，得到淀，最后將剩余的母液直接蒸發(fā)濃縮，得到5 個(gè)分級(jí)個(gè)分級(jí)的五味子多糖組分。的五味子多糖組分。三、多糖含量的測定方法三、多糖含量的測

38、定方法 多糖含量測定常規(guī)方法是以多糖含量測定常規(guī)方法是以無水葡萄糖為對(duì)照品無水葡萄糖為對(duì)照品, 采用采用苯酚苯酚-硫酸法硫酸法, 或者蒽酮或者蒽酮-硫酸法硫酸法 。 上述兩種方法由于操作簡單上述兩種方法由于操作簡單, 試劑容易獲得而在多糖含試劑容易獲得而在多糖含量測定中被廣泛采用。量測定中被廣泛采用。苯酚苯酚-硫酸法的原理硫酸法的原理 多糖在硫酸存在下先水解成單糖多糖在硫酸存在下先水解成單糖, 再脫水生成具有呋喃再脫水生成具有呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物。由環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物。由五碳糖生成的是糠醛五碳糖生成的是糠醛, 甲基五碳糖甲基五碳糖生成的是生成的是5-甲糠醛甲糠醛, 六碳糖生成的是六碳糖生成的是5-羥

39、甲糠醛羥甲糠醛?？啡?。糠醛酸在此條件下往往脫羧酸在此條件下往往脫羧, 并生成糠醛?？啡┘捌溲苌锊⑸煽啡?。糠醛及其衍生物和苯酚縮合成有色物質(zhì)和苯酚縮合成有色物質(zhì), 在在480 nm 處有最大吸收處有最大吸收, 吸收吸收值與糖的含量呈線性關(guān)系。值與糖的含量呈線性關(guān)系。蒽酮蒽酮-硫酸法的原理硫酸法的原理 蒽酮蒽酮-硫酸法其原理是糖類與濃硫酸在沸水浴中迅速硫酸法其原理是糖類與濃硫酸在沸水浴中迅速脫脫水生成糠醛或其衍生物水生成糠醛或其衍生物, 再與蒽酮試劑縮合再與蒽酮試劑縮合, 形成藍(lán)綠形成藍(lán)綠色溶液色溶液, 在在620 nm 處有最大吸收處有最大吸收, 吸收值與糖的含量呈吸收值與糖的含量呈線性關(guān)系

40、。線性關(guān)系。 這兩種方法也存在較為嚴(yán)重的缺陷這兩種方法也存在較為嚴(yán)重的缺陷: 首先首先, 葡萄糖是單糖葡萄糖是單糖, 而植物多糖的組成是多樣的而植物多糖的組成是多樣的, 只用只用葡萄糖作為參照不確切葡萄糖作為參照不確切; 其次其次, 顯色試劑的不專屬顯色試劑的不專屬, 單糖的干擾嚴(yán)重單糖的干擾嚴(yán)重, 實(shí)際上測得實(shí)際上測得的結(jié)果是總糖的結(jié)果。在未嚴(yán)格純化的植物多糖樣品的結(jié)果是總糖的結(jié)果。在未嚴(yán)格純化的植物多糖樣品中中, 這種情況更為普遍。這種情況更為普遍。 為排除還原性單糖的干擾為排除還原性單糖的干擾, 可采用可采用DNS( 3, 5-二硝基水楊二硝基水楊酸酸)比色法測定還原糖含量比色法測定還原

41、糖含量。其原理是在堿性溶液中。其原理是在堿性溶液中, 3, 5-二硝基水楊酸與還原糖共熱后被還原成棕紅色氨基化二硝基水楊酸與還原糖共熱后被還原成棕紅色氨基化合物合物, 在一定范圍內(nèi)還原糖的量與反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度呈在一定范圍內(nèi)還原糖的量與反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度呈比例關(guān)系。比例關(guān)系。 再將通過硫酸再將通過硫酸-苯酚法或者蒽酮苯酚法或者蒽酮-硫酸法得到的總糖結(jié)果硫酸法得到的總糖結(jié)果減去還原糖減去還原糖, 即得較準(zhǔn)確的多糖含量。即得較準(zhǔn)確的多糖含量。糖醛酸含量測定糖醛酸含量測定 糖醛酸含量測定則以糖醛酸含量測定則以咔唑咔唑-硫酸法硫酸法多見。多見。 該法的原理在于糖醛酸在硫酸存在下會(huì)與該法的原理在于糖醛酸在硫

42、酸存在下會(huì)與咔唑咔唑反應(yīng)生反應(yīng)生成含羰基的紫紅色產(chǎn)物。該產(chǎn)物在成含羰基的紫紅色產(chǎn)物。該產(chǎn)物在530 nm下有最大吸下有最大吸收收, 吸收值與糖含量呈線性關(guān)系。吸收值與糖含量呈線性關(guān)系。四、純度與相對(duì)分子質(zhì)量的檢測四、純度與相對(duì)分子質(zhì)量的檢測 純度鑒定純度鑒定 分子量的測定分子量的測定 結(jié)構(gòu)測定結(jié)構(gòu)測定 包括多糖一級(jí)結(jié)構(gòu)測定、多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)測定包括多糖一級(jí)結(jié)構(gòu)測定、多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)測定純度鑒定純度鑒定 多糖是高分子化合物，其純品微觀上是不均一的，通多糖是高分子化合物，其純品微觀上是不均一的，通常所說的多糖純品實(shí)質(zhì)上是一定分子量范圍的均一組常所說的多糖純品實(shí)質(zhì)上是一定分子量范圍的均一組分。分。 多糖純度鑒定的常用方法：超離心、高壓電泳、凝