基因重組與基因工程

1、第十四章第十四章基因重組與基因工程基因重組與基因工程基因重組基因重組：genomic recombination重組重組DNA：recombinant DNA第一節(jié)、自然界的基因重組第一節(jié)、自然界的基因重組 轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化：transformation 整合：整合：integration 轉(zhuǎn)導：轉(zhuǎn)導：transduction 轉(zhuǎn)位：轉(zhuǎn)位：transposition轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化： 由外來由外來DNA引引起生物起生物類型改類型改變的過變的過程稱為程稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化。細菌的轉(zhuǎn)化細菌的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 病毒癌基因病毒癌基因感染宿主細感染宿主細胞后，可整胞后，可整合到宿主染合到宿主染色體上，從色體上，從而使

2、宿主細而使宿主細胞癌變。胞癌變。轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染：噬菌體感染宿主菌后，核酸進入菌體噬菌體感染宿主菌后，核酸進入菌體內(nèi)的過程。內(nèi)的過程。細胞的轉(zhuǎn)化細胞的轉(zhuǎn)化整合整合 整合：整合： 噬菌體感染大腸桿菌的第一步噬菌體感染大腸桿菌的第一步 噬菌體粘附于細胞壁上，將自身的噬菌體粘附于細胞壁上，將自身的 DNA注入菌體中。注入菌體中。 此此 DNA可可與細菌染與細菌染色體重組，成為細菌染色體的一部分。色體重組，成為細菌染色體的一部分。 溶原菌：溶原菌：整合了噬菌體基因組的細菌。整合了噬菌體基因組的細菌。 裂解：裂解： 噬菌體感染大腸桿菌的第二步噬菌體感染大腸桿菌的第二步 DNA利用菌體的酶系統(tǒng)，復制自身及利用菌

3、體的酶系統(tǒng)，復制自身及外殼蛋白，組裝成大量新外殼蛋白，組裝成大量新 噬菌體，并噬菌體，并將細菌漲破。將細菌漲破。 整合整合 溶原溶原和和裂裂解解可可以相以相互轉(zhuǎn)互轉(zhuǎn)變。變。轉(zhuǎn)導轉(zhuǎn)導 溶原菌中溶原菌中 DNA可以原樣地切離出來，可以原樣地切離出來，也可以也可以把鄰近的宿主把鄰近的宿主DNA在切離時帶走在切離時帶走一部分。后者稱一部分。后者稱轉(zhuǎn)導轉(zhuǎn)導。 帶有宿主帶有宿主DNA的噬菌體稱的噬菌體稱轉(zhuǎn)導噬菌體轉(zhuǎn)導噬菌體。 來源于宿主的基因稱來源于宿主的基因稱轉(zhuǎn)導基因轉(zhuǎn)導基因。轉(zhuǎn)位轉(zhuǎn)位 轉(zhuǎn)位轉(zhuǎn)位：一個或一組基因從一處轉(zhuǎn)到基因：一個或一組基因從一處轉(zhuǎn)到基因組的另一個位置。組的另一個位置。 這些游動的基因稱

4、為這些游動的基因稱為轉(zhuǎn)位子轉(zhuǎn)位子(transposon)。轉(zhuǎn)位轉(zhuǎn)位第二節(jié)、基因工程第二節(jié)、基因工程 基因工程基因工程：是用分離純化或人工合成的：是用分離純化或人工合成的DNA在體外與載體在體外與載體DNA結(jié)合，成為重組結(jié)合，成為重組DNA，用以轉(zhuǎn)化宿主，篩選出能表達重用以轉(zhuǎn)化宿主，篩選出能表達重組組DNA的活細胞，加以純化、傳代、擴的活細胞，加以純化、傳代、擴增，成為增，成為克隆克隆。也叫。也叫基因克隆基因克隆或或重組重組DNA技術(shù)技術(shù)。 分子水平上操作，細胞水平上表達。分子水平上操作，細胞水平上表達。 賦予重組賦予重組DNA以新的生命力。以新的生命力。基因工程基因工程腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移與細胞表面

5、的糖鏈類型有關(guān)，腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移與細胞表面的糖鏈類型有關(guān)，而后者又與糖基轉(zhuǎn)移酶的表達相關(guān)。而后者又與糖基轉(zhuǎn)移酶的表達相關(guān)。已經(jīng)證實已經(jīng)證實GnT-與轉(zhuǎn)移有關(guān)。與轉(zhuǎn)移有關(guān)。轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)入GnT-基因基因肝癌細胞株肝癌細胞株SMMC7721觀察其遷移、侵襲、粘附等生物學行為觀察其遷移、侵襲、粘附等生物學行為轉(zhuǎn)入反義轉(zhuǎn)入反義GnT-基因基因轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移 轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移 基因克隆基因克隆分分切切接接轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)篩篩載體和目的基因載體和目的基因 載體載體：vector 在宿主細胞內(nèi)可獨立復制的完整在宿主細胞內(nèi)可獨立復制的完整DNA分分子。但必須利用宿主的酶系統(tǒng)，才能有子。但必須利用宿主的酶系統(tǒng)，才能有進一步的基因表達能力。進一步

6、的基因表達能力。 常用的載體有：常用的載體有： 質(zhì)粒、質(zhì)粒、 噬菌體噬菌體 、 M13 噬菌體噬菌體 逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA、昆蟲病毒、昆蟲病毒DNA 載體與宿主共培育可大量生成，經(jīng)純化載體與宿主共培育可大量生成，經(jīng)純化后可用于基因工程。后可用于基因工程。質(zhì)粒質(zhì)粒 質(zhì)粒質(zhì)粒：plasmid 環(huán)形雙鏈環(huán)形雙鏈DNA，大小約為數(shù)千堿基對，大小約為數(shù)千堿基對，存在于大多數(shù)細菌的胞質(zhì)中。存在于大多數(shù)細菌的胞質(zhì)中。 拷貝數(shù)拷貝數(shù)：每個細菌能容納的質(zhì)粒數(shù)目。：每個細菌能容納的質(zhì)粒數(shù)目。 質(zhì)粒的性質(zhì)：質(zhì)粒的性質(zhì)： 易于從一個細菌轉(zhuǎn)移入另一個細菌。易于從一個細菌轉(zhuǎn)移入另一個細菌。 有兩三個抗藥性基因。有兩

7、三個抗藥性基因。 有一個限制性內(nèi)切酶切口。有一個限制性內(nèi)切酶切口。質(zhì)粒質(zhì)粒 pBR322：常用的常用的質(zhì)粒質(zhì)粒噬菌體載體噬菌體載體 噬菌體噬菌體 、 M13 噬菌體噬菌體 易于感染大腸桿菌易于感染大腸桿菌 噬菌體噬菌體DNA比質(zhì)粒大，對限制性內(nèi)切比質(zhì)粒大，對限制性內(nèi)切酶有不止一個切口，需經(jīng)過改造。酶有不止一個切口，需經(jīng)過改造。 一個切口：插入型載體。一個切口：插入型載體。 二個切口：置換型載體。二個切口：置換型載體。噬菌體載體噬菌體載體目的基因的來源目的基因的來源 直接從染色體直接從染色體DNA中分離：原核生物中分離：原核生物 人工合成：簡單的多肽人工合成：簡單的多肽 從從mRNA合成合成cD

8、NA：真核生物：真核生物 基因文庫：基因文庫：(gene library） G文庫：用基因組的全部文庫：用基因組的全部DNA制備。制備。 c文庫：文庫： 用細胞的全部用細胞的全部mRNA制備出全套制備出全套cDNA后建庫。后建庫。從從mRNA合成合成cDNA限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用 限制性內(nèi)切酶可辨認限制性內(nèi)切酶可辨認46個核苷酸：回文結(jié)構(gòu)個核苷酸：回文結(jié)構(gòu) 回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)：palindrome DNA雙鏈具有方向相反順序一致的結(jié)構(gòu)。雙鏈具有方向相反順序一致的結(jié)構(gòu)。 平端：平端：blunt end 在同一水平上切斷兩條鏈。在同一水平上切斷兩條鏈。(鈍型末端鈍型末端) 粘性末端：粘

9、性末端：sticky end 堿基序列被酶以錯開幾個核苷酸的形式切開。堿基序列被酶以錯開幾個核苷酸的形式切開。限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用 Alu I .AGCT. .AG CT. 平端平端 .TCGA. .TC GA. BamH I GGATCC .G GATTC 粘性粘性 .CCTAGG CCTAAG G 末端末端 限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用切載體切載體切目的基因切目的基因限制性限制性內(nèi)切酶內(nèi)切酶相同粘性末端相同粘性末端兩者相連兩者相連要點：避免切斷目的基因要點：避免切斷目的基因載體和目的基因的連接載體和目的基因的連接 人工連接器人工連接器：linker 人工合成的寡核苷

10、酸，安置有限制性內(nèi)人工合成的寡核苷酸，安置有限制性內(nèi)切酶的識別序列。切酶的識別序列。 DNA連接酶連接酶：可用于連接堿基互補的二：可用于連接堿基互補的二段核酸鏈。段核酸鏈。 連接方式：連接方式： 粘端連接方式粘端連接方式 尾接法尾接法粘端連接粘端連接尾接法尾接法重組體的轉(zhuǎn)化重組體的轉(zhuǎn)化 基因的轉(zhuǎn)移：基因的轉(zhuǎn)移： 重組體進入宿主細胞的過程，已開發(fā)了很多重組體進入宿主細胞的過程，已開發(fā)了很多方法。方法。 化學法：化學法：CaCl2轉(zhuǎn)移法、堿金屬離子轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移法、堿金屬離子轉(zhuǎn)移法 物理法：顯微注射法、基因槍法、電穿孔法物理法：顯微注射法、基因槍法、電穿孔法 生物學法：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體生物學

11、法：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體重組體的轉(zhuǎn)化重組體的轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化：重組載體導入宿主后，利用宿主轉(zhuǎn)化：重組載體導入宿主后，利用宿主的酶系統(tǒng)表達的過程。即改變宿主性狀的酶系統(tǒng)表達的過程。即改變宿主性狀的過程。的過程?；蚬こ痰谋磉_體系的發(fā)展基因工程的表達體系的發(fā)展載體宿主第一代質(zhì)粒、噬菌體細菌第二代穿梭質(zhì)粒酵母第三代動 植 物 病 毒 、昆蟲載體組織培養(yǎng)細胞第四代DNA 直接導入生殖細胞DNA重組體的篩選與鑒定重組體的篩選與鑒定 根據(jù)重組載體的表型進行篩選：根據(jù)重組載體的表型進行篩選： 如質(zhì)粒的抗藥性、營養(yǎng)素的依賴型如質(zhì)粒的抗藥性、營養(yǎng)素的依賴型 DNA限制酶切圖譜分析：限制酶切圖譜分析： 提取經(jīng)粗選

12、后的宿主提取經(jīng)粗選后的宿主DNA，用限制性內(nèi)，用限制性內(nèi)切酶切割后與原來載體比較。切酶切割后與原來載體比較。 利用核酸雜交和放射自顯影進行鑒定：利用核酸雜交和放射自顯影進行鑒定：用目的基因作探針監(jiān)測宿主用目的基因作探針監(jiān)測宿主DNA是否重是否重組體。組體。DNA重組體的篩選與鑒定重組體的篩選與鑒定 滅活法滅活法篩選重篩選重組體。組體。提取轉(zhuǎn)化細胞提取轉(zhuǎn)化細胞DNA限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳與原來載體及重組體比較與原來載體及重組體比較DNA重組體的篩選與鑒定重組體的篩選與鑒定DNA重組體的篩選與鑒定重組體的篩選與鑒定菌落菌落硝酸纖維素濾膜硝酸纖維素濾膜探針探針X線底片線

13、底片顯影顯影平板平板基因工程策略基因工程策略第三節(jié)、基因工程的應(yīng)用第三節(jié)、基因工程的應(yīng)用 生命科學研究趨勢生命科學研究趨勢 基因診斷和基因治療基因診斷和基因治療 基因工程產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用基因工程產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用生命科學研究趨勢生命科學研究趨勢 基因的結(jié)構(gòu)與功能研究基因的結(jié)構(gòu)與功能研究 基因表達的調(diào)控基因表達的調(diào)控 各種生物大分子之間的識別及結(jié)合各種生物大分子之間的識別及結(jié)合 了解生命的奧秘了解生命的奧秘基因診斷和基因治療基因診斷和基因治療基因工程產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用基因工程產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用 基因工程疫苗：安全廉價基因工程疫苗：安全廉價 乙肝疫苗、甲肝疫苗乙肝疫苗、甲肝疫苗 巨細胞病毒、流行性出血熱

14、、輪狀病毒、巨細胞病毒、流行性出血熱、輪狀病毒、 基因工程生產(chǎn)激素類：基因工程生產(chǎn)激素類： 胰島素、生長激素胰島素、生長激素 細胞因子：細胞因子： 生長因子、腫瘤壞死因子、造血因子、生長因子、腫瘤壞死因子、造血因子、干擾素干擾素第五節(jié)、聚合酶鏈反應(yīng)第五節(jié)、聚合酶鏈反應(yīng) 聚合酶鏈反應(yīng)：聚合酶鏈反應(yīng)：PCR polymerase chain reaction 耐熱細菌：耐熱細菌：DNA聚合酶能耐高溫，在聚合酶能耐高溫，在7080有很高的催化力。有很高的催化力。 原理：以目的原理：以目的DNA為模板，快速合成大為模板，快速合成大量的量的DNA，用于檢測、制備、研究。，用于檢測、制備、研究。第五節(jié)、聚合酶鏈反應(yīng)第五節(jié)、聚合酶