目的基因的克隆與基因文庫的構建(2)課件

1、生物工程專業(yè)核心課程基 因 工 程基因工程523416789基因工程的基本概念基因工程的基本原理基因工程所需的基本條件基因工程的操作過程目的基因的克隆與基因文庫的構建大腸桿菌基因工程酵母基因工程哺乳動物基因工程高等植物基因工程5 目的基因的克隆與基因文庫的構建C PCR法B cDNA法A 鳥槍法D 化學合成法E 基因文庫的構建5 目的基因的克隆與基因文庫的構建 基因工程或DNA重組技術三大用途的前提條件是從生物體基因組中分離克隆目的基因，目的基因獲得之后，或確定其表達調(diào)控機制和生物學功能，或建立高效表達系統(tǒng)，構建具有經(jīng)濟價值的基因工程菌（細胞），或?qū)⒛康幕蛟隗w外進行必要的結(jié)構功能修飾，然后輸

2、回細胞內(nèi)改良生物體的遺傳性狀，包括人體基因治療。 一般來說，目的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類：一類是構建感興趣的生物個體的基因文庫，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基因組文庫中挑出含有目的基因的重組克?。涣硪活愂抢肞CR擴增技術甚至化學合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆表達。A 鳥槍法5 目的基因的克隆與基因文庫的構建鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略鳥槍法操作的改進鳥槍法克隆目的基因的局限性鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 隨機克隆供體細胞的全基因組DNA片段，然后通過快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子，進而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細菌目的基

3、因的克隆分離 鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略染色體DNA的切斷 超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端 全酶切： 片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開， 大小不可控 部分酶切： 片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整 與載體連接 如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇表達型載體如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為轉(zhuǎn)化受體細胞 受體細胞；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇能使目的基因表達的受體細胞篩選含有目的基因的目的重組子 菌落原位雜交法、基因產(chǎn)

4、物功能檢測法（篩選模型的建立） 鳥槍法操作的改進使用這一改進方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中目的重組子的出現(xiàn)頻率 使用特征性限制性內(nèi)切酶切開染色體DNA 鳥槍法操作的改進例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI片段中，將染色體DNA用SalI切開，瓊脂糖凝膠電泳分離，用刀片切下相當于1.6 - 2.0 kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠塊中回收DNA片段，然后與載體進行拼接在連接前將DNA片段進行分級分離 2.0 kb1.6 kb1.8 kb鳥槍法操作的改進凍融法

5、濾紙法吸附法低融點凝膠法溶解法凝膠DNA片段回收技術 鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識不能獲得的最小長度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構B cDNA法5 目的基因的克隆與基因文庫的構建cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略cDNA法分離目的基因的基本程序cDNA法法克隆目的基因的局限性cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略mDNAcDNA第一鏈的合成 5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 35ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTT

6、TTTTTTp 5cDNA第一鏈引物退火逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPscDNA第二鏈的合成 煮沸NaOH自身引導法：獲得的雙鏈cDNA 5端會有幾對堿基缺失AAAAAAAAAAAAAA5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTOH 3KlenowdNTPsS1cDNA第二鏈的合成 DNApol dNTPsRNaesH置換合成法：獲得的雙鏈cDNA 5端也會有幾對堿基缺失5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTT

7、TTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAp 55S1 AAAATTTOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55TTTTTTTTTTTTTTOH 3AAAAAAAAAAAAAA 55TTTTTTTTTTTTTT 33T4-DNA ligasecDNA第二鏈的合成 dCTPTdT引導合成法：獲得的雙鏈cDNA 能保留完整的5端序列5ppp5G G AAAAAOH 3TTTTTp 53 HO5ppp5G G AAAAACCCCCCCOH 33 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 55 pGGGGGGG3 HOCC

8、CCCCCTTTTTp 55 pGGGGGGGAAAAAOH 3NaOH退火KlenowdNTPscDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略雙鏈cDNA的克隆 雙鏈平頭的cDNA通?？梢允褂孟铝腥N方法克隆入載體中： 平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收 平頭兩端分別接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，這樣重組分子可通過加熱局部變性和S1核酸酶處理回收插入片段加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收 cDNA法分離目的基因的基本程序完備分離程序 提取細胞總mRNA，合成總cDNA，將之全部克隆，然后借助于合適的篩選手段找到目的重組子 篩選時，若使用的是多拷貝載體，則采用菌落原位雜交法篩選；若使用的是

9、表達型載體，則采用菌落免疫雜交法篩選 完備分離程序適用于mRNA分子數(shù)少的目的基因的克隆，如人胰島素基因、干擾素基因、凝血因子VIII基因等 cDNA法分離目的基因的基本程序特異分離程序 提取細胞總mRNA，瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標mRNA，由此合成雙鏈cDNA，然后進行克隆 特異分離程序較適用于mRNA豐度極高的目的基因克隆如血紅蛋白基因等 cDNA法分離目的基因的基本程序差異分離程序 利用兩組細胞mRNA種類的差異，分離克隆差異mRNA所對應的cDNA，因而這種程序較適用于分離克隆新基因 例如：正常的大鼠FR3T3成纖維細胞中，有些新基因是不能自發(fā)表達的，需在多瘤病毒感染之后方可轉(zhuǎn)錄。

10、任務是要分離克隆這些新基因，進而研究其生物學功能 差異分離程序 多瘤病毒感染的FR3T3細胞正常的FR3T3細胞總mRNA總mRNAcDNA雙鏈cDNA單鏈cDNA提取mRNA合成cDNA合成第二鏈克隆提取mRNA共價交聯(lián)上柱原位雜交病毒誘導表達的基因cDNA克隆cDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA結(jié)構 細菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在細胞中含量少，對酶和堿極為敏感，分離純化困難僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因 C PCR法5 目的基因的克隆與基因文庫的構建 PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又稱為聚合酶鏈反應或PCR擴增技術，

11、是一種高效快速的體外DNA聚合程序 使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴增目的基因或DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學合成聚合反應必 需的雙引物 PCR法定向擴增目的基因的基本原理55目的基因5變性加熱55引物退火55底物聚合5555加熱變性5555555555555555555555555退火 引物底物聚合加熱變性引物退火底物聚合123 由Taq DNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物中，其3末端總是會帶有一個非模板依賴型的突出堿基，而且這個堿基幾乎總是A，因為Taq DNA聚合酶對dATP具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基的存在，克隆時即可以采取TdT末端加同聚尾的方法與載體拼接，也可以使

12、用專門的T載體克隆 PCR克隆目的基因的基本程序55AATT55PCR擴增產(chǎn)物T 載體T7lacZ MCSoriAprD 化學合成法5 目的基因的克隆與基因文庫的構建化學合成法的基本戰(zhàn)略化學合成的單元操作DNA化學合成的用途化學合成法的基本戰(zhàn)略全基因合成化學合成目的基因的前提條件是基因的DNA序列已知，有三種戰(zhàn)略：小片段粘接法： 混合退火根據(jù)目的基因全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體 化學合成法的基本戰(zhàn)略全基因合成補釘延長法： 混合退火根據(jù)目的基因兩條互補鏈全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段以及20-30堿基長的單鏈DNA中

13、片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體 Klenow酶聚合化學合成法的基本戰(zhàn)略全基因合成大片段酶促法： 混合退火根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40-50堿基長的單鏈DNA片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體 Klenow酶聚合化學合成法的基本戰(zhàn)略全基因合成 上述三種方法各有利弊：化學合成DNA的單片段愈短，收率就愈高，但由于化學合成的份額較大，成本較高；在大片段酶促法合成目的基因時，雖然化學合成的份額相對較小，成本較低，但大片段化學合成的收率極低，例如，每聚合一個單體的產(chǎn)物收率為95%則合成50個堿基長的DNA單鏈大片段的總收率只有7.7%化學合成法的基本戰(zhàn)略探針等寡聚核苷酸合成 在

14、某些情況下，往往只知道目的基因編碼產(chǎn)物的部分氨基酸序列，而基因序列未知，此時需要從已知的氨基酸序列推測為其編碼的DNA序列，然后合成探針，篩選由鳥槍法或cDNA法得到的重組子，最終獲得含有目的基因的目的重組子 由于大多數(shù)氨基酸擁有簡并密碼子，故在探針序列的設計時必須考慮下列問題：生物體對簡并密碼子的偏愛性，合成系列探針探針應具有足夠的長度，通常在17-20個核苷酸之間探針內(nèi)部不應出現(xiàn)可能的互補區(qū)域化學合成法的基本戰(zhàn)略探針等寡聚核苷酸合成某段連續(xù)的氨基酸序列Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile所有可能的DNA序列TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACA

15、TA C T GATG G G T T C CGA CGG CGT CGC設計的簡并探針序列TGTATGGACGAIATGATGTATGGATGAIATGATGCATGGACGAIATGATGCATGGATGAIATGA A G此外還可以參考各種生物體的EST數(shù)據(jù)庫進行傾向性簡并序列設計expressed sequence tag化學合成的單元操作 化學合成DNA的實質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個個接上去，每接一個單體就是一個循環(huán)反應，包括：基團保護、分離、縮合、分離、去保護五大操作單元。 從反應機理上來講，DNA化學合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸液三酯法；具體操作過程又有液相合成

16、和固相合成兩種形式。前者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應中間物的分離程序簡便，DNA合成儀就是根據(jù)固相亞磷酸液三酯法原理設計的化學合成的單元操作OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeOHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeHDMT： 二甲氧基三苯甲基激活縮合氧化脫取代基玻璃珠連接臂DNA化學合成的用途合成天然基因修飾改造基因 設計新型基因 制備探針、引物、接頭 如生長激素釋放抑制素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、干擾素如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等 基因等E 基因文庫的構建5 目的基因的克隆與基因文庫的構建基因文庫的基本概念基因文庫的

17、構建程序基因組文庫重組克隆的排序基因文庫的基本概念基因庫與基因文庫基因庫（gene pool） 特定生物體全基因組的集合（天然存在） 基因文庫（gene library or gene bank） 從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式基因組文庫（含有全部基因） 存在（人工構建）。根據(jù)構建方法的不同，基因文庫分為： cDNA文庫（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構基因） 基因文庫的基本概念基因文庫構建的基本戰(zhàn)略用鳥槍法構建基因組文庫，材料來自染色體DNA用cDNA法構建cDNA文庫，材料來自mRNA在高度分化的生物體中，不同組織和細胞在不同時段的mRNA種類不同（即基因的表達譜不同），因此

18、同種生物體的cDNA文庫一般還有組織細胞的界定，如肝組織cDNA文庫或胚胎組織cDNA文庫等。很顯然， cDNA文庫的信息量遠小于基因組文庫基因文庫的基本概念基因文庫的完備性基因文庫的完備性是指：在構建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N之間的關系可用下式表示：N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )其中： P = 任一基因被克隆（或存在于基因文庫中）的概率 f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因組的大小 例如，人的單倍體DNA總長為2.9 x 109 bp，基因文庫中克隆片段的平均大小為15 kb，則構建一個完備性為0.9的基因文庫至少需要45萬個克隆

19、；而當完備性提高到0.9999時，基因文庫至少需要180萬個克隆基因文庫的基本概念基因文庫的質(zhì)量標準除了盡可能高的完備性外，一個理想的基因文庫應具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過大 以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度 避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域 以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選基因文庫的構建程序基因組DNA的制備 為了最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性， 用于基因組文庫構建的DNA在分離純化操作中應盡量避免過度的斷裂。制備的DNA分子量越大，經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末端的DNA片段的比率就越低，重

20、組率和完備性也就越高AAAA用常規(guī)方法制備的染色體DNA的長度一般在100 kb左右如果先將細胞固定在低融點凝膠中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的緩沖液中浸泡，可獲得1000 kb大小的DNA片段基因文庫的構建程序基因組DNA的切割 用于基因組文庫構建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法，其目的是： 第一，保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū) 第二，保證DNA片段大小均一超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭 部分酶切法一般選用四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶，如：Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控 連接前，上述處理的DNA片

21、段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機連為一體！基因文庫的構建程序載體和受體的選擇 出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構建的載體通常選裝載量較大的l-DNA或考斯質(zhì)粒；對于大型基因組（如動植物和人類）需使用YAC或BAC載體l-DNA 由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文庫構建的載體通常選質(zhì)粒 上述幾種載體的最大裝載量如下：質(zhì)?？妓官|(zhì)粒15 kb25 kb45 kbBAC300 kbYAC400 kb 用于基因文庫構建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌基因文庫的構建程序從基因文庫中篩選目的基因 大型基因組文庫一般由數(shù)十萬甚至上百萬個重

22、組克隆組成。除了一些具有特殊功能的蛋白質(zhì)編碼基因（如抗藥性基因、結(jié)合蛋白編碼基因等）可以采用特殊的正選擇篩選程序（如抗藥性篩選法、酵母雙雜交技術等）直接篩選外，一般的基因組文庫篩選均需多輪操作步驟基因文庫的構建程序從基因文庫中篩選目的基因密集鋪板（1-10萬）雜交挖取鋪板鋪板目的重組克隆基因文庫的構建程序基因文庫構建的技術性問題在基因組文庫的構建過程中，最應引起重視的問題是：嚴禁外源DNA片段之間的連接！為了避免上述情況的發(fā)生，可采取下列措施的組合： 將待連接的DNA片段根據(jù)載體的裝載量分級分離用堿性磷酸單酯酶除去DNA片段的末端磷酸基團 用TdT酶在DNA片段的末端上增補同聚尾末端 基因組文

23、庫重組克隆的排序 大型基因文庫（包括人的基因文庫）的構建在技術上并不十分困難，如果一個YAC基因文庫的插入片段總和為整個基因組的十倍以上時，一般就能從基因文庫中調(diào)出任何一段DNA序列。然而基因文庫的克隆都是隨機序列，必須將所有的克隆排列成一個像天然染色體DNA上所表現(xiàn)出的信息順序。這項工作的工作量可能遠大于基因組文庫的構建，屬于基因文庫的后期制作基因組文庫重組克隆的排序 將單一的YAC克隆插入DNA片段用限制性內(nèi)切酶分布均勻地水解成若干片段，末端標記同位素 然后再用Sau3AI或MboI將末端標記的DNA片段降解成碎片，聚丙烯酰胺凝膠電泳，每10個YAC克隆走在同一塊板上，形成10個克隆的特征性DNA指紋圖譜 電腦分析指紋圖譜，如發(fā)現(xiàn)任何兩個克隆DNA的指紋圖譜有部分相同的，則其兩個YAC片段就有互相重疊的可能性，于是這兩個YAC克隆的DNA片段克隆在染色體上是排列一起的 酶切片段末端標記法酶切片段末端標記法HHHHS S S