如何正確設(shè)計(jì)從生物樣品中分離純化生物大分子

1、10 10級(jí)臨床七年二班級(jí)臨床七年二班 第五組第五組 生物大分子生物大分子指的是作為生物體內(nèi)主要活性成分的各種分子量達(dá)到上萬(wàn)或更多的有機(jī)分子。常見(jiàn)的生物大分子包括蛋白質(zhì)、核酸、脂類(lèi)、糖類(lèi)。實(shí)際上生物大分子的特點(diǎn)在于其表現(xiàn)出的各種生物活性和在生物新陳代謝中的作用。 生物大分子生物大分子大多數(shù)是由簡(jiǎn)單的組成結(jié)構(gòu)聚合而成的，例如蛋白質(zhì)的組成單位是氨基酸，核酸的組成單位是核苷酸等。蛋白質(zhì)、核酸和多糖是3類(lèi)主要的生物大分子，它們?cè)诜肿咏Y(jié)構(gòu)和生理功能上差別很大，然而，在以下幾個(gè)方面又顯出共性： 在活細(xì)胞內(nèi)，生物大分子和相應(yīng)的生物小分子之間的互變，通常通過(guò)脫水縮合，或加水分解。 蛋白質(zhì)鏈（或稱(chēng)肽鏈）、核酸鏈

2、和糖鏈都有方向性，盡管方向性的體現(xiàn)各不相同。 蛋白質(zhì)、核酸和多糖分子都有各具特征的高級(jí)結(jié)構(gòu)，正確的高級(jí)結(jié)構(gòu)是生物大分子執(zhí)行其生物功能的必要前提。 在活細(xì)胞中，生物大分子互相密切配合，共同參與生命過(guò)程，甚至很多情況下形成生命活動(dòng)必不可少的復(fù)合大分子，如核蛋白、糖蛋白。1. 1. 確定要分離提純的生物大分子的目的和要求確定要分離提純的生物大分子的目的和要求不論是學(xué)生學(xué)習(xí)簡(jiǎn)單的分離提純方法，還是科研人員進(jìn)行研究、開(kāi)發(fā)或者探索新物質(zhì)，一個(gè)明確的目的和要求都是必不可少的。本課題要求對(duì)生物大分子進(jìn)行分離提純，也即在了解生物大分子（即蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖類(lèi)）的前提下，進(jìn)行盡可能完善的提純，同時(shí)也應(yīng)注意滿(mǎn)足

3、現(xiàn)實(shí)設(shè)備情況。2. 2. 建立相應(yīng)可靠的分析測(cè)定方法建立相應(yīng)可靠的分析測(cè)定方法 分離提純最為重要的就是最終的“純度”，所以一套完善可靠地分析測(cè)定方法就是進(jìn)行工作的前提條件。沒(méi)有這雙“眼睛”，將無(wú)法得到最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3. 3. 查閱文獻(xiàn)調(diào)研和預(yù)備性實(shí)驗(yàn)查閱文獻(xiàn)調(diào)研和預(yù)備性實(shí)驗(yàn) 要進(jìn)行分離提純就必須掌握四種生物大分子的一般理化性質(zhì)以及需要提純的產(chǎn)物的一些特殊理化性質(zhì)，只有這樣才能進(jìn)行分離提純的工作。4. 4. 生物材料的破碎和處理生物材料的破碎和處理 需要分離的生物大分子往往貯存在生物體內(nèi)，而根據(jù)生物種類(lèi)的不同，如微生物、動(dòng)物、植物等，有不同的生物材料處理方式，而處理方式的得當(dāng)與否，往往也決定著

4、最終的提取率的高低甚至實(shí)驗(yàn)的可行性。5.5.分離純化方案的選擇和探索分離純化方案的選擇和探索 同樣的一類(lèi)物質(zhì)往往有很多種方案可以進(jìn)行分離提純，但如何根據(jù)所需生物大分子的種類(lèi)、它所處的生物環(huán)境、客觀因素等種種條件來(lái)選擇最好的一種分離純化方式，是整個(gè)實(shí)驗(yàn)最為困難的步驟。而在一些尖端領(lǐng)域，甚至需要研究人員自行探索新的方案，這無(wú)疑又大大加大了這一步的難度。所以可以說(shuō)，這一步是整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中最為困難的一步，也應(yīng)是投入精力最多、選擇最仔細(xì)的一步。 6.6.生物大分子純度的檢測(cè)生物大分子純度的檢測(cè) 根據(jù)提純的生物大分子種類(lèi)不同，選用相應(yīng)的檢測(cè)方式進(jìn)行檢測(cè)。 7.7.產(chǎn)物的濃縮、干燥與保存產(chǎn)物的濃縮、干燥與保

5、存 物理、化學(xué)方法：物理、化學(xué)方法： 比色法、氣相/液相色譜法、 光譜法（紫外可見(jiàn)、紅外和熒光等分光光度法） 、 電泳法、以及核磁共振等。但應(yīng)注意，如果實(shí)驗(yàn)對(duì)精確性要求較高則必須同時(shí)采用 2-3 種不同的純度鑒定法才能確定。生物學(xué)的測(cè)定法：生物學(xué)的測(cè)定法： 酶活測(cè)定、蛋白質(zhì)含量測(cè)定、免疫化學(xué)方法、放射性同位素示蹤法等； 在水和各種有機(jī)溶劑中的溶解性。 在不同溫度、ph 值和各種緩沖液中生物大分子的穩(wěn)定性。 固態(tài)時(shí)和凍干時(shí)的穩(wěn)定性。 物理性質(zhì)： 分子的大小、穿膜的能力、帶電的情況、在電場(chǎng)中的行為、 離心沉降的表現(xiàn)、在各種凝膠、樹(shù)脂等填料中的分配系數(shù)等。 化學(xué)性質(zhì)： 對(duì)各種蛋白酶、水解酶的穩(wěn)定性和

6、對(duì)各種化學(xué)試劑的穩(wěn)定性。 對(duì)其他生物分子的特殊親和力等。1.1. 分離純化原則：l 保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性 意義：遺傳信息全部?jī)?chǔ)存在一級(jí)結(jié)構(gòu)之中，核酸的級(jí)結(jié)構(gòu)還決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。 具體原則：溫度不要過(guò)高；控制ph值范圍(ph值5-9); 保持一定離子強(qiáng)度; 減少物理因素對(duì)核酸的機(jī)械剪切力。l 防止核酸生物降解防止核酸生物降解 dna酶抑制劑：金屬離子螯合劑；陰離子型表面活性劑 rna酶抑制劑：皂土；depc(二乙基焦碳酸鹽)；肝素；復(fù)合硅酸鹽；rnase阻抑蛋白；氧釩核糖核苷復(fù)合物 分離純化的分離純化的步驟步驟：l 取材取材：

7、核酸在細(xì)胞內(nèi)部，所以需要破碎細(xì)胞才能取得核酸，常用方法如下：高速組織搗碎機(jī)搗碎；玻璃勻漿器勻漿；超聲波處理法；液氮研磨法；化學(xué)處理法(sds、lds，吐溫80等）；生化法（溶菌酶、纖維素酶等）l 除雜除雜： 肝糖元、淀粉及粘多糖：取材前盡量減少組織中多糖的含量，如先使動(dòng)物饑餓數(shù)天然后殺死；加入淀粉酶；在濃磷酸鹽存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液；以鈣鹽沉淀dna，再以草酸鉀處理，使之形成dna鉀鹽回收，然后用離子交換法吸附dna。 蛋白質(zhì)的除去：加入去污劑如sds；氯仿-戊醇或辛醇對(duì)提取液搖蕩抽提；苯酚水溶液抽提；加入濃鹽溶液如nacl。 不同類(lèi)型核酸的分離：（1）從dna中除去rna：核

8、糖核酸酸酶選擇地破壞rna；鈣鹽分步沉淀；活性炭吸附。（2）從rna中除去dna：苯酚水溶液抽提；加入脫氧核糖核酸酶處理。 同類(lèi)核酸的分離：（1）rna混合物的分離：多應(yīng)用柱層析、梯度離心及逆流分溶等方法。（2）dna混合物的分離：常用磷酸鈣、ecteola-纖維素、deae-纖維素和甲基化白蛋白柱層析，逆流分溶，梯度離心等方法。l 濃縮濃縮：常用沉淀的方法。其好處是：改變核酸的溶解緩沖液；重新調(diào)整核酸的濃度；去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。常用方法如下： 鹽溶液沉淀：如mgcl2；naac；kac等。 有機(jī)溶劑沉淀：如乙醇；異丙醇；聚乙二醇（peg）；精胺等。 低溫長(zhǎng)時(shí)間沉淀，易導(dǎo)致鹽與dna共

9、沉淀，影響以后的實(shí)驗(yàn)。一般使用0冰水，10-15min， dna樣品足可達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。l 測(cè)定：一般選用紫外分光光度法或溴乙錠熒光法測(cè)定核酸的含量。l 保存：對(duì)dna和rna有不同的保存方式： 對(duì)dna：dna樣品溶于ph8.0的te，4 或-20 保存；長(zhǎng)期保存樣品中可加入1滴氯仿。 對(duì)rna：rna樣品溶于0.3 mol/l naac (ph5.2)或雙蒸滅菌水中，-70 保存；長(zhǎng)期保存可以沉淀形式貯于乙醇中；在rna溶液中，加1滴0.2 mol/l氧釩核糖核苷復(fù)合物凍貯于-70,可保存數(shù)年。i. 注意注意：組織破碎的方法會(huì)影響提取的脂質(zhì)的濃度，因此分析的時(shí)候必須將各種破碎方法進(jìn)行比較。i

10、i. 操作方法操作方法：按照f(shuō)olch method法進(jìn)行操作：l 先配制氯仿/甲醇=2/1（v/v），取組織按1：20的量和氯仿/甲醇一起組織均漿，分層后在室溫下在搖床中搖動(dòng)15-20分鐘。l 均漿通過(guò)濾紙過(guò)濾或者離心獲得液體。l 在離心獲得的液體中加入0.2倍體積的水或者0.9%的生理鹽水，渦旋幾秒鐘混均，然后2000rpm離心得到兩相溶液，如果需要的話(huà)用甲醇/水（1/1）的將兩相界面洗一到兩次，洗的過(guò)程不要讓甲醇/水與下層混合。l 通過(guò)離心和虹吸去掉上層后，下層氯仿相含有脂質(zhì)，如果體積在2-3ml以下則通過(guò)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器或在氮?dú)庀聺饪s。l 二氯甲烷可以替代氯仿，結(jié)果表明二氯甲烷/甲醇能夠

11、取代氯仿/甲醇，因此能夠避免氯仿帶來(lái)的健康、安全和管理問(wèn)題。a. 單、雙糖：常見(jiàn)的單、雙糖一般采用合成的方式。制備如下：脫脂去雜濃縮再次去雜脫色 濃縮 冷卻 結(jié)晶（進(jìn)一步純化）。b. 多糖的分離純化：l 脫脂：由于多糖被脂質(zhì)包圍，通常用醇或醚回流脫脂。l 提?。?熱水浸提法 微波輔助提取法 超聲輔助法 索氏提取法 醇提法 其它方法（如稀堿液浸提法、稀酸液浸提法、酶法等）l 除雜除雜： 除蛋白質(zhì)：沙維積法（sevag法）；三氟三氯乙烷法；三氯醋酸法；酶解法；鹽酸法；其它方法（如加入5%znso4溶液和飽和ba（oh）2溶液，振蕩后離心去蛋白，但此方法不夠徹底）。 除色素：活性炭除色素；弱堿性樹(shù)脂

12、deae纖維素或duolitea7來(lái)吸附色素（針對(duì)植物色素）；氧化脫色（糖和色素時(shí)結(jié)合，易被deae纖維素吸附，不能被水洗脫的）；依次用丙酮、無(wú)水乙醚和無(wú)水乙醇洗滌多糖；用4:1的氯仿-正丁醇除色素 除低聚糖等小分子雜質(zhì)：逆向流水透析法。l 純化純化： 分部沉淀法 鹽析法 季銨鹽沉淀法 柱層析 制備性區(qū)域電泳 膜分離法 金屬絡(luò)合物法 其它方法（如超過(guò)濾法、活性炭柱色譜、lkb柱色譜系統(tǒng)等）l 定義：粘多糖是一類(lèi)廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)的含糖醛酸和氨基糖殘基的復(fù)合多糖l 提?。吼ざ嗵谴蠖嗯c蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，首先常用酶降解部分蛋白或用堿使多糖-蛋白質(zhì)間的鍵斷裂，促進(jìn)提取時(shí)的溶解。然后用普通蛋白沉淀法沉淀蛋

13、白。l 分離：采用有機(jī)溶劑分離法、季銨化合物沉淀法或離子交換層析法即可。l 含量的測(cè)定：測(cè)定方法：硫酸苯酚法、硫酸蒽酮法、比色定量法、分光光度法、紙色譜法、離子交換色譜法、yaphe 法、薄層色譜法、酶法、原子吸收法、hplc 法、凝膠電泳法、親和電泳法、連續(xù)流動(dòng)分析法檢測(cè)法、次亞碘酸鹽定量法、蒽酮硫酸法（總糖）、dns 法（ 還原法）、磷鉬比色法、鄰鉀苯胺比色法等. 每種方法只對(duì)某些多糖的測(cè)量效果好. 比色法、分光光度法、離子交換色譜法、酶法和電泳法等可同時(shí)用于多糖的定性定量分析。l 純度鑒定純度鑒定：多糖是高分子化合物，其純品微觀上是不均一的，通常所說(shuō)的多糖純品實(shí)質(zhì)上是一定分子量范圍的均一

14、組分. 多糖純度鑒定的常用方法：超離心、高壓電泳、凝膠層析、hlpc 法等. 現(xiàn)在應(yīng)用較多的是hlpc 法，旋光度測(cè)定也是純度測(cè)定的一種方法。l 分子量的測(cè)定分子量的測(cè)定：多糖分子量的測(cè)定是研究多糖性質(zhì)的一項(xiàng)重要工作. 常用方法：滲透壓法、蒸氣壓滲透劑法、端基法、粘度法、光散射法、凝膠色譜法、超過(guò)率法、沉淀法、凝膠電泳法、hplc 法、超離心分析法、分子篩色譜法、gpc 法、malditofms 法.l 結(jié)構(gòu)測(cè)定結(jié)構(gòu)測(cè)定：u 多糖一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定：多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析，主要是分析組成多糖的單糖類(lèi)型、數(shù)目、連接方式及苷建構(gòu)型. 常用化學(xué)法和儀器分析法。u 多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定：目前研究多糖的二級(jí)結(jié)構(gòu)常用的

15、手段是nmr 技術(shù)。近年來(lái)，以精確三維結(jié)構(gòu)知識(shí)為基礎(chǔ)揭示重要生命活動(dòng)的規(guī)律已達(dá)到前所未有的深度和廣度。（1 1）基本原理基本原理：一是利用混合物中幾個(gè)組分分配系數(shù)的差異，把它們分配到兩個(gè)或幾個(gè)相中， 如鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、層析和結(jié)晶等；二是將混合物置于某一物相（大多數(shù)是液相）中，通過(guò)物理力場(chǎng)的作用，使各組分分配于不同的區(qū)域， 從而達(dá)到分離的目的， 如電泳、離心、超濾等。關(guān)鍵技術(shù)是電泳、層析和高速與超速離心。純化蛋白質(zhì)大分子涉及純度和產(chǎn)率 實(shí)際中兩者不能兼得，視目的而取舍。（2 2） 前處理前處理：l 定義：把蛋白質(zhì)從原來(lái)的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來(lái)，并保持原來(lái)的 天然狀態(tài)，不丟失生物活性

16、。l 選擇適當(dāng)?shù)姆椒?，破碎組織和細(xì)胞： 動(dòng)物組織和細(xì)胞：用電動(dòng)搗碎機(jī)或勻漿器破碎或用超聲波處理法破碎； 植物組織和細(xì)胞：使用石英砂和適當(dāng)?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ㄆ扑榛?用纖維素酶處理。 細(xì)菌細(xì)胞：常用方法有超聲波振蕩，與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理等。 如果蛋白質(zhì)主要集中在某一亞細(xì)胞， 例如細(xì)胞核、染色體、核糖體或可溶性的細(xì)胞漿等。用差速離心方法分離， 收集亞細(xì)胞組分材料。 如果蛋白質(zhì)是與細(xì)胞膜或膜質(zhì)細(xì)胞器結(jié)合， 必須用超聲波或去污劑使膜結(jié)構(gòu)解聚。（3 3）粗分級(jí)粗分級(jí)：l 定義：選用一套適當(dāng)方法，把蛋白質(zhì)混合物提取液中，所要的蛋白質(zhì)與其他雜蛋白質(zhì)分離開(kāi)來(lái)。 l 方法：鹽析、等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑

17、分級(jí)分離等方法。（4 4）細(xì)分級(jí)細(xì)分級(jí)：l 定義：樣品的進(jìn)一步提純。l 方法： 層析法：凝膠過(guò)濾，離子交換層析，吸附層析以及親和層析等。 電泳法：包括區(qū)帶電泳、等電聚焦等 （5 5）進(jìn)一步分離純化進(jìn)一步分離純化l 沉淀法：根據(jù)不同物質(zhì)在溶劑中的溶解度不同，將目的蛋白質(zhì) 大分子轉(zhuǎn)入固相沉淀或留在液相，而與雜質(zhì)得到初步的分離。 包括：鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、結(jié)晶、等電點(diǎn)沉淀、選擇性沉淀等 l 離心：懸液中的各種粒子（細(xì)胞，細(xì)胞器及分子）有不同的分子量或密度 ，因此離心時(shí)有不同的速率。 包括：差速離心、速率區(qū)帶離心l 電泳：物質(zhì)的電荷質(zhì)量比決定其在電場(chǎng)中移動(dòng)的速度。各種蛋白質(zhì)在同一ph條件下，因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場(chǎng)中的遷移率不同而得以分開(kāi)。 包括：sds 聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠（sds-page）、等電聚焦、