基因工程的基本操作程序

1、1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序復(fù)習(xí)復(fù)習(xí)1.什么是基因工程？什么是基因工程？2.基因工程的基本工具有哪些？基因工程的基本工具有哪些？3.基因工程的最大優(yōu)點(diǎn)？基因工程的最大優(yōu)點(diǎn)？4.“分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀”、“分子縫合針?lè)肿涌p合針”和和“分子運(yùn)分子運(yùn)輸車(chē)輸車(chē)” 分別指什么？分別指什么？5.質(zhì)粒的本質(zhì)、特點(diǎn)是什么？載體的種類(lèi)、必質(zhì)粒的本質(zhì)、特點(diǎn)是什么？載體的種類(lèi)、必須具備的條件？須具備的條件？1.目的基因目的基因的獲取的獲取2.基因表達(dá)基因表達(dá)載體的構(gòu)建載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞4.目的基因的目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)與鑒定基因工程的基本操作分四個(gè)

2、步驟基因工程的基本操作分四個(gè)步驟有了目的基因，我們才能賦予一種有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性生物以另一種生物的遺傳特性使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并可進(jìn)行遺傳、表達(dá)和發(fā)揮作用并可進(jìn)行遺傳、表達(dá)和發(fā)揮作用 載體進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，才能載體進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物實(shí)現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化體內(nèi)的轉(zhuǎn)化才能確定目的基因是否真正在受體才能確定目的基因是否真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)一、目的基因的獲取一、目的基因的獲?。ㄒ唬┠康幕虻母拍睿海ㄒ唬┠康幕虻母拍睿?編碼

3、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,也可以是一些具有也可以是一些具有調(diào)控作用的因子調(diào)控作用的因子（二）獲取目的基因的常用方法有哪些（二）獲取目的基因的常用方法有哪些?1.從基因文庫(kù)中獲取從基因文庫(kù)中獲取2.利用利用PCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增3.人工合成人工合成1.從基因文庫(kù)中直接獲取從基因文庫(kù)中直接獲?。?）基因文庫(kù)的概念：）基因文庫(kù)的概念：（2）基因文庫(kù)的分類(lèi)）基因文庫(kù)的分類(lèi):種種類(lèi)類(lèi)基因組文庫(kù)：基因組文庫(kù)：含有一種生物的含有一種生物的全部全部基因基因部分基因文庫(kù)：部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的只包含了一種生物的部分部分基因，如：基因，如：cDNA文庫(kù)文庫(kù)（3）獲取目的基因的依據(jù)：）獲取目的

4、基因的依據(jù)：某生物體內(nèi)全部某生物體內(nèi)全部DNA 許多許多DNA片段片段受體菌群體受體菌群體（4）基因文庫(kù)的構(gòu)建方法）基因文庫(kù)的構(gòu)建方法限制酶限制酶與運(yùn)載體與運(yùn)載體連接連接基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)某種生物某個(gè)時(shí)期的某種生物某個(gè)時(shí)期的mRNAcDNA反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄受體菌群體受體菌群體與運(yùn)載體與運(yùn)載體連接連接部分基因文庫(kù)部分基因文庫(kù)（cDNA文庫(kù)）文庫(kù)）導(dǎo)入導(dǎo)入導(dǎo)入導(dǎo)入基因組文庫(kù)的構(gòu)建基因組文庫(kù)的構(gòu)建通過(guò)對(duì)受通過(guò)對(duì)受體菌的培體菌的培養(yǎng)而儲(chǔ)存養(yǎng)而儲(chǔ)存基因基因 cDNA文庫(kù)的構(gòu)文庫(kù)的構(gòu)建建-反轉(zhuǎn)錄法：反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使錄成的信使RNARNA為模為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的

5、單鏈的單鏈DNADNA，然后在，然后在酶的作用下合成雙酶的作用下合成雙鏈鏈DNADNA，從而獲得所，從而獲得所需的基因。需的基因。目的基因的目的基因的mRNAmRNA單鏈單鏈DNADNA反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶DNADNA聚合酶聚合酶雙鏈雙鏈DNADNA( (目的基因目的基因) ) 概念：概念：PCR全稱(chēng)為全稱(chēng)為_(kāi)，是一項(xiàng)，是一項(xiàng)在生物在生物_復(fù)制復(fù)制_的核酸合成技術(shù)。的核酸合成技術(shù)。 條件：條件：_、_ 、 _、_原理：原理：_方式：以方式：以_方式擴(kuò)增，即方式擴(kuò)增，即_結(jié)果：結(jié)果：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外體外特定特定DNA片段片段DNA復(fù)制復(fù)制已知基因的核苷酸序列（前提）已知基因的核苷酸序

6、列（前提）四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸一對(duì)引物一對(duì)引物耐熱的耐熱的DNA聚合酶（聚合酶（Taq酶）酶）指數(shù)指數(shù)2n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增地?cái)U(kuò)增2.利用利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因過(guò)程：過(guò)程：a.DNA變性變性(90-95):雙鏈雙鏈DNA模板在熱作用模板在熱作用下，下，_斷裂，形成斷裂，形成_。b.退火退火(復(fù)性復(fù)性55-60):系統(tǒng)溫度降低，引物與系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部模板結(jié)合，形成局部_。 c.延伸延伸(70-75):在在Taq酶的作用下，從引物酶的作用下，從引物處延伸，合成與模板互補(bǔ)的處延伸，合成與模

7、板互補(bǔ)的_。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNA雙鏈雙鏈DNA鏈鏈PCR技術(shù)擴(kuò)增與技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較復(fù)制的比較PCR技術(shù)技術(shù)DNA復(fù)制復(fù)制相相同同點(diǎn)點(diǎn)原理原理原料原料條件條件不不同同點(diǎn)點(diǎn)解旋解旋方式方式場(chǎng)所場(chǎng)所酶酶結(jié)果結(jié)果堿基互補(bǔ)配對(duì)堿基互補(bǔ)配對(duì)四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶DNA在高溫下變性在高溫下變性解旋解旋解旋酶催化解旋酶催化體外復(fù)制體外復(fù)制主要在細(xì)胞核主要在細(xì)胞核熱穩(wěn)定的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶聚合酶 細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNA片段片段形成整個(gè)形成整個(gè)DNA分子分子目的基因的目的基因的mRNA單鏈單鏈DNA (cDNA）雙鏈雙鏈DNA(即目的

8、基因即目的基因)反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄合成合成1）反轉(zhuǎn)錄法：）反轉(zhuǎn)錄法：以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈的單鏈DNA，然后在酶的，然后在酶的作用下合成雙鏈作用下合成雙鏈DNA，從而，從而獲得所需的基因。獲得所需的基因。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的氨基的氨基酸序列酸序列mRNA的核苷的核苷酸序列酸序列結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因的核苷酸的核苷酸序列序列目的目的基因基因推測(cè)推測(cè)化學(xué)化學(xué)合成合成2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法法 ：3.人工合成目的基因人工合成目的基因 1.下列屬于獲取目的基因的方法的是下列屬于獲取目的基因的方法的是 利用利用

9、mRNA反轉(zhuǎn)錄形成從基因組文反轉(zhuǎn)錄形成從基因組文庫(kù)中提取從受體細(xì)胞中提取利用庫(kù)中提取從受體細(xì)胞中提取利用PCR技術(shù)合成利用技術(shù)合成利用DNA轉(zhuǎn)錄形成轉(zhuǎn)錄形成 人工合成人工合成A. B. C. D. D二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程的基因工程的 核心核心1.1.目的：目的： 使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。啟動(dòng)子啟動(dòng)子插入基因插入基因表達(dá)載體表達(dá)載體復(fù)制原點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)抗生素基因抗生素基因終止子終止子基因表達(dá)載體基因表達(dá)載體模式圖模式圖

10、2.基因表達(dá)載體的組成基因表達(dá)載體的組成(1)啟動(dòng)子啟動(dòng)子(2)終止子終止子(3)目的基因目的基因(4)標(biāo)記基因等標(biāo)記基因等它們各自的作用是什么它們各自的作用是什么? ?啟動(dòng)子啟動(dòng)子插入基因插入基因表達(dá)載體表達(dá)載體復(fù)制原點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)抗生素基因抗生素基因終止子終止子知識(shí)點(diǎn)一知識(shí)點(diǎn)一 原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 與與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子終止子能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能，能編碼蛋白質(zhì)編碼蛋白質(zhì) 編碼區(qū)：編碼區(qū)：非編碼區(qū)非編碼區(qū)原核原核細(xì)胞細(xì)胞的基的基因結(jié)因結(jié)構(gòu)

11、構(gòu)有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于列，在該序列中，最重要的是位于編碼區(qū)上游的編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。包括啟動(dòng)子和終止子包括啟動(dòng)子和終止子不能轉(zhuǎn)錄為信使不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋，不能編碼蛋 白質(zhì)。白質(zhì)。非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子終止子啟動(dòng)子啟動(dòng)子:位于基因首端的一段能與位于基因首端的一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能聚合酶結(jié)合并能起始起始mRNA合成的序列。沒(méi)有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。合成的序列。沒(méi)有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶

12、聚合酶:能夠識(shí)別啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)并與其結(jié)合的能夠識(shí)別啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì)一種蛋白質(zhì)。(以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落)終止子終止子:位于基因尾端的一段特殊的位于基因尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動(dòng)，并使其從聚合酶的移動(dòng)，并使其從DNA模板鏈上脫離下來(lái)，模板鏈上脫離下來(lái)，使轉(zhuǎn)錄終止。使轉(zhuǎn)錄終止。真核真核細(xì)胞細(xì)胞的的基因基因結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)：非編碼區(qū)：外顯子外顯子:能編碼蛋白質(zhì)的序列能編碼蛋白質(zhì)的序列有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)等。聚合酶結(jié)合位

13、點(diǎn)等。編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與與RNA聚合酶聚合酶結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子內(nèi)含子 外顯子外顯子 啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 內(nèi)含子內(nèi)含子:不能編碼蛋白質(zhì)的序列不能編碼蛋白質(zhì)的序列知識(shí)點(diǎn)二知識(shí)點(diǎn)二 真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞原核細(xì)胞真核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)不同點(diǎn)編碼區(qū)是編碼區(qū)是_的的編碼區(qū)是間隔的編碼區(qū)是間隔的、_的的相同點(diǎn)相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的都由能夠編碼蛋白質(zhì)的_和具和具有調(diào)控作用的有調(diào)控作用的_區(qū)組成的區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較連續(xù)連續(xù)不連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼

14、非編碼在細(xì)胞質(zhì)中在細(xì)胞質(zhì)中將將mRNA分離并分離并加入反轉(zhuǎn)錄酶加入反轉(zhuǎn)錄酶合成第二條合成第二條DNA鏈鏈外顯子外顯子內(nèi)含子內(nèi)含子外顯子外顯子 外顯子外顯子內(nèi)含子內(nèi)含子真核細(xì)胞的基因真核細(xì)胞的基因在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄RNA在核內(nèi)內(nèi)含子在核內(nèi)內(nèi)含子被切去，外顯子被切去，外顯子彼此連接彼此連接在細(xì)胞質(zhì)中將在細(xì)胞質(zhì)中將mRNA分離并加入分離并加入反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶合成第二條合成第二條DNA鏈鏈基因的基因的cDNA不含不含內(nèi)含子內(nèi)含子mRNA原核細(xì)胞的基因原核細(xì)胞的基因在細(xì)胞質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)錄內(nèi)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子：?jiǎn)?dòng)子：位于基因的位于基因的首端的一段特殊的首端的一段特殊的DNA片斷，它是片斷，它是RNA聚

15、合酶聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能有了它才能驅(qū)動(dòng)基因驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終，最終獲得蛋白質(zhì)獲得蛋白質(zhì)。終止子：終止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNA片片斷，斷，能終止能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄。標(biāo)記基因：標(biāo)記基因：為了為了鑒別鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)。啟動(dòng)子啟動(dòng)子插入基因插入基因表達(dá)載體表達(dá)載體復(fù)制原點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)抗生素基因抗生素基因終止子終止子質(zhì)粒質(zhì)粒DNA分子分子限制酶處理限制酶處理一個(gè)切口一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)黏性末端二個(gè)切口二個(gè)切口

16、獲得目的基因獲得目的基因DNA重組重組DNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）同一種同一種3.過(guò)程過(guò)程:連接酶連接酶切割質(zhì)粒和目的基因的限制酶必須是同一種切割質(zhì)粒和目的基因的限制酶必須是同一種酶，以獲得相同的粘性末端，利于重組質(zhì)粒的酶，以獲得相同的粘性末端，利于重組質(zhì)粒的構(gòu)建。構(gòu)建。插入的目的基因只是結(jié)構(gòu)基因部分，其表達(dá)插入的目的基因只是結(jié)構(gòu)基因部分，其表達(dá)需要調(diào)控序列，因而用作載體的質(zhì)粒的插入部需要調(diào)控序列，因而用作載體的質(zhì)粒的插入部位前須有啟動(dòng)子，后須有終止子。位前須有啟動(dòng)子，后須有終止子。注意：注意：資資料料科學(xué)家在培育抗蟲(chóng)棉時(shí)，科學(xué)家在培育抗蟲(chóng)棉時(shí)，起初把蘇云金芽孢桿菌的起初把蘇云金芽孢

17、桿菌的抗蟲(chóng)基因插入載體質(zhì)粒中，抗蟲(chóng)基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲(chóng)基因在棉花體內(nèi)結(jié)果抗蟲(chóng)基因在棉花體內(nèi)沒(méi)有表達(dá)。沒(méi)有表達(dá)。 啟動(dòng)子啟動(dòng)子插入基因插入基因表達(dá)表達(dá)載體載體復(fù)制復(fù)制原點(diǎn)原點(diǎn)抗生素抗生素基因基因終止子終止子然后在插入抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入抗蟲(chóng)基因然后在插入抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入抗蟲(chóng)基因啟動(dòng)子啟動(dòng)子，導(dǎo)入棉花受精卵，長(zhǎng)成的棉花植株，導(dǎo)入棉花受精卵，長(zhǎng)成的棉花植株還是沒(méi)有抗蟲(chóng)能力?？茖W(xué)家又在有啟動(dòng)子、還是沒(méi)有抗蟲(chóng)能力?？茖W(xué)家又在有啟動(dòng)子、抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入抗蟲(chóng)基因抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入抗蟲(chóng)基因終止子終止子，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長(zhǎng)的植株，有了導(dǎo)入棉

18、花受精卵，結(jié)果成長(zhǎng)的植株，有了抗蟲(chóng)能力?？瓜x(chóng)能力。 資料證明：載體構(gòu)建組成要完整資料證明：載體構(gòu)建組成要完整載體載體與與表達(dá)載體表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)三部分結(jié)構(gòu)用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用既用到限制酶切割載體，又用到到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵啟動(dòng)子、終止子啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的

19、基因表達(dá)必不可少對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。注意注意三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞(一一)轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化： (二二)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 方法方法將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胫参锛?xì)胞植物細(xì)胞將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)雱?dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胛⑸锛?xì)胞微生物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞目的基因進(jìn)入目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持受體細(xì)胞內(nèi)維持_和和_的過(guò)程的過(guò)

20、程受體細(xì)胞受體細(xì)胞穩(wěn)定穩(wěn)定表達(dá)表達(dá)1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力 農(nóng)桿菌特點(diǎn)：農(nóng)桿菌特點(diǎn)：（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法原理：原理：Ti質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。上。過(guò)程：過(guò)程：優(yōu)點(diǎn)：比較經(jīng)濟(jì)和有效優(yōu)點(diǎn)：比較經(jīng)濟(jì)和有效Ti質(zhì)粒質(zhì)粒T-DNA攜帶外源攜帶外源基因的基因的DNA構(gòu)建表達(dá)載體構(gòu)建表達(dá)載體轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌含目的基因的含目的基因的重組重組

21、Ti質(zhì)粒質(zhì)粒導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入植物細(xì)胞植物細(xì)胞植物細(xì)胞將目的基因插入將目的基因插入染色體的染色體的DNA中中表現(xiàn)出新性狀表現(xiàn)出新性狀的植株的植株農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖Hind限制性酶限制性酶HindIIIHindIII目的目的DNATi質(zhì)粒質(zhì)粒蘇云金桿菌蘇云金桿菌構(gòu)建表達(dá)載體構(gòu)建表達(dá)載體Bt毒素毒素蛋白基因蛋白基因 蘇云金桿菌蘇云金桿菌T-DNA(可轉(zhuǎn)移可轉(zhuǎn)移-DNA) 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的過(guò)程：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的過(guò)程：目的目的DNAamp黏性末端黏性末端在質(zhì)粒的在質(zhì)粒的tet基因內(nèi)切開(kāi)基因內(nèi)切開(kāi)目的目的DNA質(zhì)粒和外源質(zhì)粒和外源DNA的的Hind限制性限制性酶切示意圖酶切示意圖DNA連接酶

22、連接酶脫分化脫分化導(dǎo)入植物細(xì)胞通過(guò)組織培養(yǎng)產(chǎn)生新個(gè)體導(dǎo)入植物細(xì)胞通過(guò)組織培養(yǎng)產(chǎn)生新個(gè)體再分化再分化移植移植個(gè)體生物學(xué)個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定水平的鑒定如蟲(chóng)吃后中毒死亡，則說(shuō)明如蟲(chóng)吃后中毒死亡，則說(shuō)明攝入了抗蟲(chóng)基因并得到表達(dá)攝入了抗蟲(chóng)基因并得到表達(dá)導(dǎo)入植導(dǎo)入植物細(xì)胞物細(xì)胞組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌（2）基因槍法：適合單子葉植物基因槍法：適合單子葉植物（3）花粉管通道法：如抗蟲(chóng)棉花粉管通道法：如抗蟲(chóng)棉目的目的基因基因子房子房花粉管通道法花粉管通道法2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法：顯微注射法方法：顯微注射法程序：程序：目的基因表達(dá)載體提純目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩┤÷眩ㄊ?/p>

23、精卵） 顯微注射顯微注射受精卵受精卵 新性狀動(dòng)物新性狀動(dòng)物3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少物質(zhì)少方法：方法：用用Ca2+處理細(xì)胞處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞 表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合 細(xì)胞吸收細(xì)胞吸收DNA分子分子感受態(tài)感受態(tài)Ca2+處理法處理法若通過(guò)基因過(guò)程生產(chǎn)人的糖蛋白若通過(guò)基因過(guò)程生產(chǎn)人的糖蛋白可以用大腸桿菌作為工程菌嗎？可以用大腸桿菌作為工程菌嗎？不可以，糖蛋白上的糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)不可以，糖蛋白上的糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加工完成，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾和高爾基體上加工完成，而

24、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體存在真核細(xì)胞中，大腸桿菌是原核生基體存在真核細(xì)胞中，大腸桿菌是原核生物，細(xì)胞中不含這兩種細(xì)胞器。物，細(xì)胞中不含這兩種細(xì)胞器。以酵母菌作為工程菌可以嗎以酵母菌作為工程菌可以嗎?可以，酵母菌為真核生物（真菌類(lèi)）可以，酵母菌為真核生物（真菌類(lèi)）四四. .目的基因的檢測(cè)與鑒定目的基因的檢測(cè)與鑒定檢查是否成功檢查是否成功檢測(cè)檢測(cè)(分子分子水平水平)鑒定鑒定（個(gè)體水平）（個(gè)體水平）檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上上是否插入了目的基因是否插入了目的基因檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA檢測(cè)目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)檢測(cè)目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)抗蟲(chóng)鑒定、

25、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法方法方法方法方法方法DNA分子雜交分子雜交分子雜交（注意與上不同之分子雜交（注意與上不同之處）處）抗原抗原-抗體雜交抗體雜交（一）檢測(cè)（一）檢測(cè)1.檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插上是否插 入了目的基因入了目的基因 (關(guān)鍵步驟關(guān)鍵步驟)首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性同位片段用放射性同位 素等作標(biāo)記素等作標(biāo)記,以此做探針以此做探針使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯若顯 示出雜交帶示出雜交帶,表明目的基因已插入染色

26、體表明目的基因已插入染色體 DNA中中（1）方法）方法: DNA分子雜交分子雜交（2）過(guò)程）過(guò)程:目的基因片段目的基因片段非目的基因片段非目的基因片段目的基因片段目的基因片段放射性標(biāo)記放射性標(biāo)記基因探針基因探針基因探針基因探針目的基因的檢測(cè)示意圖目的基因的檢測(cè)示意圖DNA分子雜交示意圖分子雜交示意圖 采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒(méi)有互補(bǔ)堿基序列一起，形成雜合雙鏈區(qū)

27、；在沒(méi)有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。的部位，仍然是兩條游離的單鏈。 2.檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA方法方法: 分子雜交分子雜交過(guò)程過(guò)程: 用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交雜交,若出現(xiàn)雜交帶若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了出了mRNA提取提取3.檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法方法抗原抗原-抗體雜交抗體雜交蘇云金桿菌蘇云金桿菌Bt毒素蛋白毒素蛋白將將Bt毒蛋白毒蛋白注射小鼠體內(nèi)注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管從小鼠血管抽出血液分離抽出血液分離出抗出抗Bt毒素的毒素的抗體抗體抗體抗體蛋白質(zhì)蛋

28、白質(zhì)(抗原抗原) 出現(xiàn)出現(xiàn)雜交帶雜交帶脫脫分分化化組織組織培養(yǎng)培養(yǎng)證明：證明：提取蛋白質(zhì)與提取蛋白質(zhì)與Bt毒素蛋白質(zhì)一樣毒素蛋白質(zhì)一樣例例: :用棉鈴飼喂棉鈴蟲(chóng)，用棉鈴飼喂棉鈴蟲(chóng)，如蟲(chóng)吃后不出現(xiàn)中毒如蟲(chóng)吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說(shuō)明未攝入目的癥狀，說(shuō)明未攝入目的基因或攝入目的基因基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲(chóng)吃后中毒未表達(dá)。如蟲(chóng)吃后中毒死亡，則說(shuō)明攝入了死亡，則說(shuō)明攝入了抗蟲(chóng)基因并得到表達(dá)?？瓜x(chóng)基因并得到表達(dá)。（二）（二）鑒定鑒定個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定抗蟲(chóng)、抗病接種實(shí)驗(yàn)，活性比較實(shí)驗(yàn)抗蟲(chóng)、抗病接種實(shí)驗(yàn)，活性比較實(shí)驗(yàn) 不能，受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出特定的不能，受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，

29、才能說(shuō)明目的基因完成了性狀，才能說(shuō)明目的基因完成了表達(dá)表達(dá)。 受體細(xì)胞攝入受體細(xì)胞攝入DNA分子后就說(shuō)明目的分子后就說(shuō)明目的基因完成了表達(dá)嗎？基因完成了表達(dá)嗎？若不能表達(dá)，若不能表達(dá)，要對(duì)抗蟲(chóng)基因要對(duì)抗蟲(chóng)基因再進(jìn)行再進(jìn)行修飾修飾。歸納歸納: : 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.獲取目的基因獲取目的基因u從基因文庫(kù)從基因文庫(kù)u利用利用PCRu化學(xué)方法人工合成化學(xué)方法人工合成2.構(gòu)建基因表達(dá)載體構(gòu)建基因表達(dá)載體u目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞u農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法4.目

30、的基因的檢測(cè)與鑒定目的基因的檢測(cè)與鑒定u檢測(cè)：分子水平；是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯檢測(cè)：分子水平；是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯u鑒定：個(gè)體生物學(xué)水平鑒定：個(gè)體生物學(xué)水平1.有關(guān)基因工程的敘述正確的是有關(guān)基因工程的敘述正確的是 A.限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用B.重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成C.質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體D.蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供 資料資料D練習(xí)練習(xí)2.基因工程是在基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基因操作的基本步驟設(shè)計(jì)施工的。在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)

31、配對(duì)的步驟是中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是A.人工合成目的基因人工合成目的基因B.目的基因與運(yùn)載體結(jié)合目的基因與運(yùn)載體結(jié)合C.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 D.目的基因的檢測(cè)和表達(dá)目的基因的檢測(cè)和表達(dá)C練習(xí)練習(xí)3.(2008理綜山東卷理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開(kāi)發(fā)利用糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開(kāi)發(fā)利用備受關(guān)注。我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出備受關(guān)注。我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。了耐鹽水稻新品系。(1)獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用分子所用的限制性?xún)?nèi)切酶作用于圖中的的限

32、制性?xún)?nèi)切酶作用于圖中的 處，處，DNA連接酶作用于連接酶作用于 處。（填處。（填“a”或或“b”）aa(2)將重組將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和_。(3)由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株需由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株需要利用要利用_技術(shù)，該技術(shù)的核心技術(shù)，該技術(shù)的核心是是_和和_?；驑尫ɑ驑尫ㄖ参锝M織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)（花粉管通道法）（花粉管通道法）脫分化脫分化再分化再分化(4)為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標(biāo)記的既要用放射性同位素標(biāo)記的_作探針進(jìn)行分

33、子雜交檢測(cè)，又要用作探針進(jìn)行分子雜交檢測(cè)，又要用_方法從個(gè)體水平鑒定水稻方法從個(gè)體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。植株的耐鹽性。耐鹽基因耐鹽基因濃度鹽水澆灌濃度鹽水澆灌一定一定 4.4.（20092009年天津高考改編）為從根本上解年天津高考改編）為從根本上解決水稻中的高植酸問(wèn)題，可將植酸酶基因?qū)Q水稻中的高植酸問(wèn)題，可將植酸酶基因?qū)胨?，培育低植酸轉(zhuǎn)基因水稻品種。如圖入水稻，培育低植酸轉(zhuǎn)基因水稻品種。如圖是獲取植酸酶基因的流程。是獲取植酸酶基因的流程。酵母菌DNAmRNAcDNAcDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)含目的基因的菌株目的基因含目的基因的菌株目的基因提取提取構(gòu)建篩選篩選構(gòu)建ABC分離分離 據(jù)圖回答

34、：據(jù)圖回答：（1 1）圖中基因組文庫(kù)）圖中基因組文庫(kù) cDNAcDNA文庫(kù)。文庫(kù)。（2 2）B B過(guò)程需要的酶是過(guò)程需要的酶是 （3 3）目的基因和除可從構(gòu)建的文庫(kù)中分）目的基因和除可從構(gòu)建的文庫(kù)中分離外，還可以分別利用圖中離外，還可以分別利用圖中 和和 為模板直接進(jìn)行為模板直接進(jìn)行PCRPCR擴(kuò)增，該過(guò)程中所用擴(kuò)增，該過(guò)程中所用酶的顯著特點(diǎn)是酶的顯著特點(diǎn)是（4 4）A A、C C過(guò)程中都是篩選獲取目的基因過(guò)程中都是篩選獲取目的基因的過(guò)程，請(qǐng)說(shuō)出篩選的依據(jù)的過(guò)程，請(qǐng)說(shuō)出篩選的依據(jù)大于逆轉(zhuǎn)錄酶DNAcDNA耐高溫可依據(jù)基因的相關(guān)信息（基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及基因的表達(dá)產(chǎn)物等）獲取目的基因。5.下列有關(guān)基因工程的敘述下列有關(guān)基因工程的敘述,正確的是正確的是()。A.載體上的標(biāo)記基因有利于促進(jìn)目的基因在受體細(xì)載體上的標(biāo)記基因有利于促進(jìn)目的基因在受體細(xì) 胞中表達(dá)胞中表達(dá)B.用逆轉(zhuǎn)錄法合成胰島素基因時(shí)只能從胰島用逆轉(zhuǎn)錄法合成胰島素基因時(shí)只能從胰島B細(xì)胞細(xì)胞 中提取相關(guān)的模板中提取相關(guān)的