浙江大學(xué)-劉振偉教授高級培訓(xùn)班-膜片鉗技術(shù)數(shù)據(jù)處理與分析.ppt

1、Clampfit 10膜片鉗實驗數(shù)據(jù)的處理與分析2014年4月23-25日杭州 浙江大學(xué)膜片鉗技術(shù)高級培訓(xùn)班膜片鉗技術(shù)高級培訓(xùn)班劉振偉劉振偉2Patch clamp training classApr. 23-25, 20143Patch clamp training classApr. 23-25, 20144Patch clamp training classApr. 23-25, 2014一、基線的調(diào)零一、基線的調(diào)零l 基線的確認(rèn)基線的確認(rèn) 全細(xì)胞記錄基線易確認(rèn)，單通道記錄基線不易確認(rèn)。 單通道開放時間較長 所記錄的時間較短 同時開放的通道數(shù)目較多且長時間持續(xù)開放確定通道電流的方向：電流

2、方向向上，最負(fù)向是基線位置，反之亦然。如何確定：膜片兩側(cè)液體、鉗制電位 單通道電流基線的確認(rèn)單通道電流基線的確認(rèn)如果通道開放時電流向上，則基線在最下面的位置基線通道開放5Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 6Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 基線基線不在零點不在零點的的原因原因 封接電阻的改變：漏電流 失調(diào)電位的存在：偏移、漂移 噪聲的干擾：交流干擾 高通濾波的影響：對記錄線的起始部位產(chǎn)生影響7Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 基線基線調(diào)

3、零方法調(diào)零方法打開Analyze/Adjust/Baseline（1）Subtract mean of（去除均值法）：適用于去除直流偏移。（2）Subtract slope of（去除斜率法）：適合于去除持續(xù)線性漂移。（3）Subtract fixed value（去除固定值法）：適用于去除直流偏移。數(shù)值有正負(fù)之分。（4）Adjust manually（手工調(diào)零法）：適合于單通道電流的基線或基線漂移無規(guī)律。8Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 坐標(biāo)零點坐標(biāo)零點Epoch A段（1）Subtract mean of（去除均值法）（2）Subtra

4、ct slope of（去除斜率法）9Patch clamp training classApr. 23-25, 2014（3）Subtract fixed value（去除固定值法） （4）Adjust manually（手工調(diào)零法）10Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 基線調(diào)零的注意事項基線調(diào)零的注意事項（1）有些只相對值（如電流幅度的變化值），不需要將基線調(diào)零。但多數(shù)情況需要基線調(diào)零，建議都要進行基線調(diào)零。（2）對于基線變動復(fù)雜的數(shù)據(jù)，基線調(diào)零可能會用到上述的幾種方法。（3）對于某些基線變動，Clampfit中的基線調(diào)零方法可能也無法

5、準(zhǔn)確調(diào)零。建議最好在采集數(shù)據(jù)時就設(shè)法調(diào)整好基線。11Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示基線調(diào)零方法演示基線調(diào)零方法12Patch clamp training classApr. 23-25, 2014二二、壞點的去除壞點的去除l 壞點產(chǎn)生的原因壞點產(chǎn)生的原因 刺激偽跡：給標(biāo)本施加刺激時產(chǎn)生。 電容瞬變電流：電容的充放電反應(yīng)。 瞬時脈沖干擾（Glitch）：打開電源開關(guān)（日光燈、儀器設(shè)備開啟時） 手機來電：一過性高頻。人手靠近記錄探頭：高幅、高頻。13Patch clamp training classApr. 23-2

6、5, 2014l 壞點的賦值壞點的賦值 （1）Data value at cursor 1：Cursor 1的數(shù)值。 （2）Mean between cursor 1.2：Cursor 1-2之間均值。 （3）Mean between cursor 3.4：Cursor 3-4之間均值。 （4）Straight -line fit between cursor 1.2：Cursor 1-2之間的直線擬合值。 （5）Fixed value(pA/mV)：輸入一個固定的數(shù)值。14Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示去除壞點演示

7、去除壞點15Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 注意事項注意事項 （1）壞點太多時，應(yīng)在記錄前予以去除。（2）壞點持續(xù)時間短，如果出現(xiàn)持續(xù)時間較長的壞點，則數(shù)據(jù)要廢棄。16Patch clamp training classApr. 23-25, 2014三三、濾波濾波l 信號采集前的濾波信號采集前的濾波 全細(xì)胞通道電流記錄：1-2 kHz 全細(xì)胞突觸活動記錄：10 kHz 單通道電流記錄：10 kHz 動作電位記錄：10 kHz17Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 信號采集后的濾波信號采

8、集后的濾波 18Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 Lowpass Highpass Bandpass Notch Electrical Interference l Clampfit濾波類型濾波類型 19Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Lowpass 最為常用。 Clampfit根據(jù)采樣定理與Nyquist定理自動算出f-3dB范圍并顯示在該框底部。 7種類型：（1）8-pole Bessel：數(shù)據(jù)失真小，普遍用于時域數(shù)據(jù)。（2）Boxcar：數(shù)碼濾波器，用于時域數(shù)據(jù)。當(dāng)前數(shù)據(jù)點及其前后

9、一些數(shù)據(jù)點（取決于Smoothing points，取3-99中的奇數(shù)）的平均值賦予當(dāng)前數(shù)據(jù)點，完成濾波。 Smoothing points值越大，數(shù)據(jù)幅度削減越大。 （3）Gaussian：數(shù)碼濾波器，同Boxcar，但當(dāng)前數(shù)據(jù)點在平均值中所占的比例較大。（4）RC (8-coincident-pole)：用于時域數(shù)據(jù)。（5）RC ( single-pole)：用于時域數(shù)據(jù)。（6）8-pole Butterworth：用于頻域數(shù)據(jù)。（7）8-pole Chebyshev：用于頻域數(shù)據(jù)。 20Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfi

10、t演示演示Lowpass濾波濾波21Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Highpass 又稱交流耦合（AC Coupling），可削弱低頻信號而通過高頻信號。 Clampfit提供兩種：8-pole Bessel，單極RC 采用- f-3dB ，Clampfit自動計算出f-3dB范圍并顯示在該框底部。 最常見的是在神經(jīng)元上進行細(xì)胞內(nèi)記錄時使用高通濾波器，它可降低膜電位的低頻振蕩對突觸電流的干擾。22Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示演示Highpass濾波濾波23P

11、atch clamp training classApr. 23-25, 2014l Bandpass 相當(dāng)于低通濾波與高通濾波的交叉，需要同時設(shè)定高通濾波與低通濾波。 高通濾波的f-3dB不能高于低通濾波的f-3dB 。 帶通濾波用于欲記錄的信號頻率較為單一和固定時，對其它頻率的噪聲進行濾波。24Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Notch 帶阻濾波：削弱某一特定頻率（如50 Hz交流）信號。 中心頻率（Center frequency）：10-3,000 Hz。 頻率寬度（3dB width）：頻率寬度。-3dB width越窄，濾波需

12、要的數(shù)據(jù)點越多，濾波效果越好。25Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示演示Notch濾波濾波26Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Electrical Interference（EI）電干擾濾波器（Electrical interference filter, EI）為數(shù)碼濾波器?？赏瑫r去除50 Hz及其諧波（100 Hz、150 Hz等）的復(fù)雜交流噪聲。Harmonics from 1 to：用于設(shè)定欲去除的交流諧波的最高數(shù)目，最大數(shù)目為20（對應(yīng)于1 kHz），一般

13、去除第1-3個就夠了。Cycles to average：數(shù)目越大，-3dB頻率寬度越窄，濾波效果越好，但需時越長。Reference frequency：選50 Hz。27Patch clamp training classApr. 23-25, 2014EI所需最少數(shù)據(jù)點的計算舉例所需最少數(shù)據(jù)點的計算舉例 濾波器所需最少數(shù)據(jù)點 （采樣頻率/ 50 Hz） Cycles to average若采樣頻率 10 kHz，則一個50 Hz正弦波周期的采樣點數(shù) 10 kHz / 50 200 點若設(shè)定Cycles to average 10，則需要的最少采樣點數(shù) 2,000點 采樣數(shù)據(jù)點不夠的話，將

14、不能清除諧波干擾。28Patch clamp training classApr. 23-25, 2014四四、數(shù)據(jù)文件內(nèi)部、數(shù)據(jù)文件內(nèi)部/ /之間的數(shù)學(xué)運算之間的數(shù)學(xué)運算l Analyze/Average Traces平均文件內(nèi)任意幾條相同的Trace，獲得平均后的一條Trace。要求： Clampex軟件的Fixed-length events、Episodic stimulation和High-speed oscilloscope模式。 重復(fù)記錄的信號，時程必須固定不變。29Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 降低信號噪聲降低信號噪聲信號

15、頻率譜與噪聲頻率譜一致或有重疊時，濾波不行。平均Trace的原理：設(shè)有N條Trace，則（見表）： 先累加所有N條Trace，此時信號幅度增大為原來的N倍，而噪聲卻只增大為原來的N倍。 然后再除以Trace條數(shù)N， 信號幅度不發(fā)生大的變化，而噪聲幅度卻降低為原來的1/N。30Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示演示Average Traces功能功能31Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Analyze/Segmented Average可對幾個Trace中的某一相同時段

16、（如Epoch A）或Cursor 1-2之間的時間段進行平均，平均后的文件通常用于Analyze/Subtract Control功能中的Control File。32Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Analyze/Arithmetic對文件內(nèi)的任何Trace進行加減乘除等運算，使原來的Trace得到新值。 如t3=t1+t2，t3=2t1+3t2Results窗口中的該功能可對不同Column的數(shù)據(jù)進行運算，得到新的Column的數(shù)值。33Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Anal

17、yze/ Average Files對幾個文件進行平均。例如在進行相同的實驗時，需要將幾個采樣文件相應(yīng)的每一個Trace進行平均。平均后的文件會自動生成，文件名為Average000-999.abf。僅適用于Episodic Stimulation、High-speed oscilloscope模式的數(shù)據(jù)；Protocol設(shè)置必須一致。同樣具有降低噪聲的作用。34Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示演示Average Files功能功能35Patch clamp training classApr. 23-25, 2014

18、l Analyze/ Subtract Control兩個文件中所有相應(yīng)的Trace進行相減，可用于去除漏電流或分離某種通道電流。要求兩個文件要采用相同的Protocol來采集（信號數(shù)目、Sweep數(shù)目與長短、信號單位、采樣頻率）。Test file為“大”文件“被減數(shù)”，Control File為“小”文件“減數(shù)”。 Multiply control traces by: 將Control File中的Trace乘以該倍數(shù)，然后再從Test file中減除。36Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示演示Subtract C

19、ontrol功能功能37Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 注：注：如需要，可用Analyze/Data Reduction或Interpolation功能使采樣頻率變?yōu)橐恢隆Ｈ鬞est file中的Signal或Sweep數(shù)少于Control file，后者多余的Signal或Sweep將不被使用。反之，若Test file中的Signal或Sweep數(shù)大于Control file，后者最后一個Signal或Sweep將被反復(fù)使用。若Test file中的Sweep長度小于Control file，后者Sweep中多余的點將不被使用。反之，

20、若Test file中的Sweep長度大于Control file，后者Sweep中最后一個點將被反復(fù)使用。以Test file為準(zhǔn)38Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Analyze/Concatenate Files 將在同一條件下獲得的數(shù)據(jù)文件并成一個文件。同一條件是指相同的采集模式/采樣頻率/采樣時間/信號個數(shù) 連接后的文件會自動生成: Concatenate000-999.abf。39Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示演示Concatenate Files功

21、能功能40Patch clamp training classApr. 23-25, 201441Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l膜兩側(cè)電壓差Vm改變，激活離子通道，用激活曲線描述。 反映通道開啟的速度速度及難易程度難易程度。一一、離子通道的激活曲線離子通道的激活曲線42Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l給予細(xì)胞一系列脈沖電壓來記錄全細(xì)胞電流，作通道的激活曲線： X軸脈沖電壓Vm Y軸全細(xì)胞通道電導(dǎo)g/gmax Boltzmann方程擬合43Patch clamp training cla

22、ssApr. 23-25, 2014g：全細(xì)胞通道激活電導(dǎo)gmax：全細(xì)胞通道最大激活電導(dǎo)Vm：不同的去極化（或超極化）脈沖電壓V1/2：通道激活50%時的脈沖電壓k：斜率因子（反映激活速度快慢，k越大，激活速度越慢）lBoltzmann方程44Patch clamp training classApr. 23-25, 2014設(shè)：f(V) = gImax=gmax=1Vmid=V1/2V=VmVc=kC=0則即為前述的激活曲線方程：lClampfit中的Boltzmann方程：Boltzmann, charge-voltage方程45Patch clamp training classApr

23、. 23-25, 2014 先對數(shù)據(jù)進行處理（如基線調(diào)零、濾波、選擇用于分析的Sweep數(shù)目等）。 測量不同去極化脈沖電壓下全細(xì)胞電流的峰值I（pA）。 計算全細(xì)胞電導(dǎo)。gI / (VmVrev) 對全細(xì)胞電導(dǎo)g進行標(biāo)化：g / gmax，gmax=Imax / (Vm-Vrev)。 作點圖 最后用激活曲線方程對散點圖進行擬合l 離子通道激活曲線制作步驟離子通道激活曲線制作步驟46Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示激活曲線的制作演示激活曲線的制作47Patch clamp training classApr. 23-25

24、, 2014l 幾點說明幾點說明（1）通過激活曲線的左移或右移以及半失活電壓的變化等指標(biāo)可以判斷藥物對通道開啟過程的影響。（2）若要反映一類通道的激活特點或?qū)Σ煌M數(shù)據(jù)進行比較，需要有細(xì)胞例數(shù)上的要求，要求出平均g/gmax值與標(biāo)準(zhǔn)差，再作激活曲線。（3）通道反轉(zhuǎn)電位可通過Nernst方程計算出來，也可直接測試出來，后者更準(zhǔn)確。48Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l離子通道電流-電壓關(guān)系曲線（I-V曲線）： 反映通道：激活過程、閾電位、反轉(zhuǎn)電位、整流特性l給予連續(xù)變化的步階/斜坡脈沖電壓Vm（范圍大，最好跨越反轉(zhuǎn)電位），測通道電流大小I，作I

25、-V曲線： X軸Vm Y軸Il藥物可影響通道激活或衰減，使 I-V曲線形狀發(fā)生改變。二二、離子通道的離子通道的I-VI-V曲線曲線49Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 用用Analyze/Quick Graph/I-V作作I-V曲線曲線適用于脈沖電壓為歩階（方波）形式的記錄數(shù)據(jù)。50Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示演示用用Quick Graph/I-V作作I-V曲線曲線51Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 注意事

26、項注意事項（1）通道未開放時，電流應(yīng)該為零。因此要對基線進行細(xì)致的調(diào)零，可能要對每個Trace都進行基線調(diào)零。52Patch clamp training classApr. 23-25, 2014（2）若要在一個細(xì)胞上測量多次，可選擇Clampex中Edit Protocol的Run功能，也可用Analyze/Average Files功能進行文件間的平均，得到某一個細(xì)胞的電流平均幅度值。53Patch clamp training classApr. 23-25, 2014（3）測量同一種類多個細(xì)胞的I-V曲線，需要對電流幅度標(biāo)化。原因：細(xì)胞大小不同，通道電流幅度不同。對于一個球形細(xì)胞，膜

27、電容Cmd2 / 100 (pF) （d為細(xì)胞直徑(m)） 例子：若細(xì)胞直徑d=20 m，其膜電容Cm=12 pF。電流密度：I/ Cm ，I/ Cm -V曲線Cm值的獲得：（a）封接過程直接獲得（b）Online Statistics窗口采集Cm ，最后獲得平均Cm值I/Imax-V曲線。54Patch clamp training classApr. 23-25, 2014（4）如果從鉗制電位開始去極化（或超極化），在I-V曲線上應(yīng)不包含鉗制電位這個數(shù)據(jù)點。 Vhold = -60 mV55Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 用用Anal

28、yze/Quick Graph/Trace vs. Trace作作I-V曲線曲線適用于脈沖電壓為斜坡（Ramp）形式的記錄數(shù)據(jù)。56Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示演示用用Quick Graph/Trace vs. Trace作作I-V曲線曲線57Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 注意事項注意事項用用（1）Cursor 1、2的位置要放置準(zhǔn)確，不要由于放置的誤差導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤。為了更好、更準(zhǔn)確地放置Cursor，應(yīng)該：（a）在采集時設(shè)計好Protocol。不好好58P

29、atch clamp training classApr. 23-25, 2014（b）應(yīng)該以電流線（而不是Waveform電壓線）為準(zhǔn)設(shè)置Cursor。因為電流線滯后1電流線Waveform22159Patch clamp training classApr. 23-25, 2014（2）可通過選擇對話框中的Append，將兩條I-V曲線作在一個圖中。60Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 通道在激活因素（一般為去極化）持續(xù)存在條件下的失活衰減（Decay） 衰減的指標(biāo)：（1）時間常數(shù)；（2）10-90%衰減時間。三三、離子通道的衰減離子通

30、道的衰減CurrentWaveform61Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l衰減的時間常數(shù)衰減的時間常數(shù)通道電流的衰減過程可用單指數(shù)方程或者雙指數(shù)方程擬合，獲得衰減的時間常數(shù)。Clampfit軟件中“Exponential, standurd”指數(shù)擬合方程：衰減的時間常數(shù)i=2時，為雙指數(shù)方程，擬合后獲得1和2兩個時間常數(shù)值。62Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示演示衰減的擬合衰減的擬合63Patch clamp training classApr. 23-25, 20

31、14l 10-90%衰減時間衰減時間打開Analyze/Statistics窗口，除設(shè)置其他選項外，要在Measurement中勾上Rise time, From 10 To 90%。OK后，在Window/Results窗口中可查看到結(jié)果。64Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 給予細(xì)胞膜一個電壓刺激，持續(xù)一段時間后，開放了的通道會逐漸失活，再給予電壓刺激時，失活的通道將不再開放穩(wěn)態(tài)失活（Steady-state inactivation）。用失活曲線反映。四、離子通道的失活曲線四、離子通道的失活曲線-90-80-70-60-500.00.

32、20.40.60.81.01.22nA10ms-50mVConditioning pulsesTesting pulsesVh= -90mV65Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l失活曲線采用雙脈沖設(shè)置的Protocol來獲得數(shù)據(jù)條件脈沖將膜鉗制在不同的電位水平，使相應(yīng)部分通道處于完全失活狀態(tài)。測試脈沖檢測未失活通道的電流大小。 X軸條件脈沖的電壓數(shù)值 Y軸測試脈沖的電流大小 用Boltzmann方程擬合-90-80-70-60-500.00.20.40.60.81.01.22nA10ms-50mVConditioning pulsesTest

33、ing pulsesVh= -90mV66Patch clamp training classApr. 23-25, 2014I：不同條件脈沖電壓下測試脈沖誘發(fā)的電流大小Imax：不同條件脈沖電壓下測試脈沖誘發(fā)的最大電流Vm：不同條件脈沖電壓V1/2：通道失活50%時的條件脈沖電壓k：斜率因子（反映失活速度快慢，k越大，失活速度越慢）lBoltzmann方程VmImax /2V1/20Imax67Patch clamp training classApr. 23-25, 2014lClampfit中的Boltzmann方程：Boltzmann, charge-voltage方程設(shè)：f(V) =

34、 IImax=1Vmid=V1/2V=VmVc=kC=1則即為前述的失活曲線方程：68Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 失活曲線制作步驟失活曲線制作步驟（1）對數(shù)據(jù)進行分析前的處理：基線調(diào)零、濾波等。（2）測量不同條件脈沖下的測試脈沖誘發(fā)的全細(xì)胞電流峰值（I）。以測試脈沖的全細(xì)胞最大電流峰值Imax為1，對其它電流標(biāo)化，計算出I/Imax。（3）以Vm為x軸，I/Imax為y軸，作點圖。（4）最后用失活曲線方程對散點圖進行擬合。打開Clampfit中的Fit窗口，選擇Boltzmann, charge-voltage方程。69Patch c

35、lamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示失活曲線的制作演示失活曲線的制作70Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 幾點說明幾點說明（1）通過失活曲線的左移或右移以及半失活電壓的變化等指標(biāo)可以判斷藥物對通道失活過程的影響。（2）同通道激活曲線一樣，若要比較不同組之間的差異，作失活曲線也需要有細(xì)胞例數(shù)（n）上的要求，要求出平均I/Imax值與標(biāo)準(zhǔn)差，再作失活曲線。（3）在作失活曲線時，脈沖電壓的設(shè)定要注意：條件脈沖時間要設(shè)定得足夠長，以使通道在某一去極化水平的失活達到完全，這需要根據(jù)通道的失活特

36、點來設(shè)定。 Na+離子通道：衰減快，條件脈沖20 ms寬 L型Ca 2+離子通道：衰減緩慢，條件脈沖的寬度十幾秒條件脈沖與測試脈沖的間隔不能設(shè)定得過長，以防止失活的通道恢復(fù)，影響測試脈沖的測量。條件脈沖測試脈沖71Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 概念概念量效曲線：X軸藥物劑量/濃度大小Y軸藥理效應(yīng)強弱 閾濃度 半效濃度EC50 最大效能 效價強度五、五、量效曲線量效曲線72Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit中的中的Hill方程：方程：Hill (4 parameter

37、logistic)方程方程（1）觀察藥物對某種受體/通道電流的誘發(fā)/增強作用時：Imax：藥物作用后通道的最大電流幅度Imin：藥物作用前的電流幅度C50：半效濃度EC50X：所施加的藥物濃度h：Hill系數(shù)設(shè)通道電流的幅度為I，將Y軸設(shè)為I/Imax，擬合時，設(shè)Imax=1。若觀察配體對受體通道誘發(fā)電流的情況，則擬合后，Imin接近0。l Clampfit中的中的Hill方程：方程：Hill (4 parameter logistic)方程方程（1）觀察藥物對某種受體/通道電流的誘發(fā)/增強作用時：Imax：藥物作用后通道的最大電流幅度Imin：藥物作用前的電流幅度C50：半效濃度EC50X：

38、所施加的藥物濃度h：Hill系數(shù)設(shè)通道電流的幅度為I，將Y軸設(shè)為I/Imax，擬合時，設(shè)Imax=1。若觀察配體對受體通道誘發(fā)電流的情況，則擬合后，Imin接近0。73Patch clamp training classApr. 23-25, 2014（2）觀察藥物對某種受體/通道電流的阻斷作用時：Imax：最大濃度藥物作用后的電流幅度Imin：藥物作用前的電流幅度C50：半抑制濃度IC50X：所施加的藥物濃度h：Hill系數(shù)設(shè)通道電流的幅度為I，將Y軸設(shè)為I/Imin。擬合時，設(shè)Imin=1。若藥物對通道電流完全阻斷，擬合后，Imax接近0。74Patch clamp training cl

39、assApr. 23-25, 2014（3）觀察配體誘發(fā)受體通道的電流時，因配體施加前通道不開放，可以采用Clampfit中的Hill, Langmuir方程對量效曲線進行擬合：設(shè)：i=1C=0C50：半效濃度EC50X：所施加的藥物濃度h：Hill系數(shù)75Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 例例1. GABA誘發(fā)的誘發(fā)的GABA-A受體電流的量效曲線制作受體電流的量效曲線制作GABA : 0.5、1、5、10、50、100 mol/L76Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit

40、演示演示GABA電流的量效曲線電流的量效曲線77Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 例例2. 荷包牡丹堿荷包牡丹堿Bicuculline對對GABA-A受體電流抑制作用的量效曲線制作受體電流抑制作用的量效曲線制作Bicuculline:0, 0.1, 1, 10, 100 mol/LGABA : 10 mol/L78Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示演示Bicuculline的量效曲線的量效曲線79Patch clamp training classApr. 23-25

41、, 2014l 幾點說明幾點說明藥物濃度的選擇：（1）要含有閾濃度和最大效能濃度。（2）按一定倍比關(guān)系：如1、2、5、10、20、50、100等。（3）至少4個濃度。80Patch clamp training classApr. 23-25, 2014藥物施加原則：（1）按照從低到高濃度的順序施加。在用浴槽灌流給藥時要將前次藥物沖洗掉，然后再給下一個濃度；在用培養(yǎng)皿時（難以灌流）每次施加的藥量要少，防藥物累加。（2）為獲得穩(wěn)定的量效曲線，藥物從低到高的幾個濃度最好在同一個細(xì)胞上施加。因此要求有合適的給藥裝置和高質(zhì)穩(wěn)定的全細(xì)胞記錄。（3）正式實驗前，需要先期做預(yù)實驗來確定每個藥物濃度的給藥間隔

42、時間，確保藥物作用不受受體失敏的影響。81Patch clamp training classApr. 23-25, 2014依據(jù)實驗要求和藥物特點選擇給藥方法：（1）配體或通道的激動劑的施加要求快速、微量的給藥裝置；（2）昂貴的藥物一般不采用灌流給藥，而采用壓力噴射給藥；（3）受體拮抗劑可與配體一起施加，也可預(yù)先加入拮抗劑；（4）用培養(yǎng)皿時，因灌流置換液體困難，要采用壓力噴射給藥方法；（5）直接用加樣槍向培養(yǎng)皿或浴槽內(nèi)滴加藥物的方法，只用于簡單的藥物定性；（6）離子電泳的給藥方法適合于能夠離子化的藥物。82Patch clamp training classApr. 23-25, 2014C

43、lampfit的作圖效果不理想，不適合正式發(fā)表文章。采用作圖軟件Origin制作量效曲線：選擇Analysis/Non-linear Curve Fit中的Logistic方程。83Patch clamp training classApr. 23-25, 2014實驗一般要求有細(xì)胞的個數(shù)（n），獲得平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。 標(biāo)準(zhǔn)差可用作圖軟件Origin顯示出來：在數(shù)據(jù)表窗口，選擇Column/Set as Y Error。84Patch clamp training classApr. 23-25, 2014不同藥物量效曲線的比較要求： 選擇相同的濃度 兼顧閾濃度與最大效能濃度。 將兩個量效曲線作

44、在一起的方法： Clampfit在制作第2個量效曲線時選擇Analyze/Append to Graph功能來制作。 Origin采用在數(shù)據(jù)表直接輸入數(shù)據(jù)的方法將幾條量效曲線作在一個圖中。 以某藥物最大誘發(fā)電流來標(biāo)化其他藥物例子： Nic誘發(fā)最大電流=100% ACh誘發(fā)電流與之比較85Patch clamp training classApr. 23-25, 201486Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 單通道電導(dǎo)單通道電導(dǎo)概念概念單通道電導(dǎo)（G）指通道完全開放（Full opening）時，流經(jīng)單通道的電流（i）與通道兩側(cè)電壓差（鉗制電

45、位與通道反轉(zhuǎn)電位的差值V）的比值，即：Gi /V電導(dǎo)的單位是西門子（Siemens, S），一般通道電導(dǎo)多為pS級，少數(shù)通道電導(dǎo)較大，可達nS級（1 nS1 pA/mV）。一、單通道電導(dǎo)的測算一、單通道電導(dǎo)的測算i(pA)V(mV)87Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 亞開放狀態(tài)（亞開放狀態(tài)（Substate）不完全開放狀態(tài)，電流幅度小。 NMDA受體：兩個開放狀態(tài)（50 pS主開放、40 pS亞開放） 人工純化通道蛋白突變體：常有亞開放狀態(tài)UnitarycurrentClosingDwell timeOpeningDwell timeSu

46、bstate *88Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l閃爍現(xiàn)象（閃爍現(xiàn)象（Flicking）。通道的高速開放與關(guān)閉導(dǎo)致通道開放或關(guān)閉持續(xù)時間太短的現(xiàn)象。包括：（1）通道高速短時開放；（2）通道在開放時高速短時關(guān)閉。*89Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 單通道電導(dǎo)的測算方法單通道電導(dǎo)的測算方法（1）簡單粗略的方法：找到基線，觀測單通道電流幅度峰值，并除以膜片兩側(cè)的電壓差與反轉(zhuǎn)電位的差值，就得到單通道電導(dǎo)G。例：膜兩側(cè)電壓差（鉗制電位）Vm=30 mV反轉(zhuǎn)電位Vrev=0 mV測得電流幅度i

47、=100 pA則單通道電導(dǎo)G=100 pA/(30-0) mV=3.33 nS該方法相對粗糙，但可快速觀察電導(dǎo)的大致變化。90Patch clamp training classApr. 23-25, 2014（2）斜率電導(dǎo)(Slope conductance)：通過單通道I-V曲線求得（見后）。91Patch clamp training classApr. 23-25, 2014（3）直方圖擬合法：擬合電流幅度分布，計算出單通道平均電導(dǎo)。 高斯（Gaussian）方程對單通道電流幅度直方圖進行擬合。 Clampfit中的高斯方程：橫軸x：電流幅度的bin值縱軸f(x)：檢測的事件數(shù)目：單通

48、道電流幅度的平均值：單通道電流幅度的標(biāo)準(zhǔn)差A(yù)、C：系數(shù)i1時，一極高斯方程 G /V92Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示用演示用Histogram功能和高斯擬合測算單通道電導(dǎo)功能和高斯擬合測算單通道電導(dǎo)93Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 注意事項注意事項 如果通道開放概率太低（只有很少的幾個開放事件），則擬合會失真，此時需要延長采樣記錄時間以獲得更多的開放事件。 測算單通道電導(dǎo)時應(yīng)選擇單通道開放的峰值（Level 1的峰值）。 亞開放狀態(tài)多時，會在單通道電流幅度峰

49、值與基線峰值之間形成亞開放狀態(tài)的峰值，據(jù)此可測算出亞開放電導(dǎo)。 閃爍現(xiàn)象多會使單通道電流幅度曲線峰值的左右不對稱，影響電導(dǎo)的測算。升高檢測事件的閾值或限制事件持續(xù)時間，可去除閃爍現(xiàn)象。 如果記錄的數(shù)據(jù)中都是閃爍現(xiàn)象，沒有完全開放事件，則無法測算電導(dǎo)。在人工質(zhì)膜實驗中，這種情況多表明通道蛋白純化過程有問題。 無論上述哪種方法，都需要先確定正確的基線，并對膜片漏電流進行去除，同時還要有一定的例數(shù)（膜片數(shù)）要求。94Patch clamp training classApr. 23-25, 2014二、單通道開放概率的分析二、單通道開放概率的分析分析開放概率之前，要先對開放事件進行檢測。l 單通道事

50、件的檢測單通道事件的檢測（1）事件檢測前的準(zhǔn)備工作 基線調(diào)零、壞點去除、濾波等。（2）對檢測參數(shù)進行設(shè)定（右圖）（3）進行事件檢測95Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示單通道開放事件的檢測演示單通道開放事件的檢測96Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 單通道開放概率分析實例單通道開放概率分析實例以機械敏感性MscL通道為例，單通道開放概率Po的計算過程如下：（1）打開單通道數(shù)據(jù)文件，進行數(shù)據(jù)處理（2）進行事件檢測（3）計算Po（4）作壓力-單通道開放概率關(guān)系曲線（5）對

51、壓力-單通道開放概率關(guān)系曲線進行擬合Major TitlePressure (mmHg)60708090100110P (o)00.20.40.60.81Pressure-Po關(guān)系曲線關(guān)系曲線97Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit中的擬合方程：Boltzmann, charge-voltage設(shè)：f(V)=Po，單通道開放概率Vc=1/，通道對負(fù)壓的敏感度（mmHg），擬合獲得的重要指標(biāo)V=P，施加的負(fù)壓值Vmid= P1/2，通道50%開放時的壓力值，擬合獲得的重要指標(biāo)Imax=1，以通道100%開放為1C=0，Po的位移

52、設(shè)為0則上述方程可以寫成右側(cè)的Boltzmann方程：98Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示單通道開放概率演示單通道開放概率Po的計算的計算99Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 注意：注意：單通道概率分析的前提是：能觀察到膜片上全部通道開放的情況，進而知道膜片上通道的最大數(shù)目。100Patch clamp training classApr. 23-25, 2014三、多通道開放概率三、多通道開放概率l NPo的概念的概念 膜片上通道沒有全部開放，通道總數(shù)N未知，Po

53、無法計算，只能計算NPo多通道開放概率。 單通道開放概率Po=NPo/N。 壓力Npo曲線用Boltzmann方程擬合。101Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 擬合擬合壓力壓力NPo曲線的曲線的Boltzmann方程：方程： NPo：多通道開放概率NPomax：觀察到的所有開啟通道的最大開放概率 = 觀察到的通道數(shù)：其倒數(shù)為通道對負(fù)壓的敏感度（mmHg）P：施加的負(fù)壓值。P1/2：通道50%開放時的壓力值。 擬合后，獲得P1/2和1/。102Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 不同組不同組

54、NPo的比較的比較不同膜片NPo的平均 不同膜片通道數(shù)不同，NPo和NPomax都不會相同。 求NPo / NPomax（NPomax：給藥前后兩次記錄中最大的NPo）。不同組比較方法：以壓力-NPo曲線為例。 （1）獲得一個膜片給藥前后不同負(fù)壓條件下的NPo，求出 NPo / NPomax。 （2）求出所有膜片上的 NPo / NPomax，得到藥物施加前、后的兩條壓力-NPo曲線。 （3）對曲線進行Boltzmann擬合，比較兩組的P1/2和1/。103Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 例子例子鉗制電位 = 10 mV，施加壓力 = -

55、68 mmHg，獲得NPocontrol，然后給予糜蛋白酶(Chymotrypsin,300 g/ml)，獲得NPochymotrypsin。本例NPomax=4。求出該膜片的NPocontrol / NPomax和（NPochymotrypsin / NPomax）。求出不同膜片上的NPocontrol / NPomax和NPochymotrypsin / NPomax，進行統(tǒng)計學(xué)處理。Vm=-10 mVPressure= 0 mmHg4321Level104Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 單通道單通道I-V曲線的曲線的概念與概念與意義

56、意義通單道電流I大小與膜片兩側(cè)電壓差大?。ㄣQ制電位Vm）之間的關(guān)系曲線。X軸：膜鉗制電位Vm（mV）Y軸：單通道電流I（pA）意義： 反轉(zhuǎn)電位（Vrev）、斜率電導(dǎo)（Gs）。 藥物會影響通道性質(zhì)，改變I-V曲線的形狀和位置。四、單通道四、單通道I-VI-V曲線曲線-6 0-4 0-2 02 04 06 0-2 0 0-1 0 01 0 02 0 00 I(pA)Vm(mV)105Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l I-V曲線的制作曲線的制作在Clampex中獲得不同歩階電壓（Vm）下通道電流I，保存為數(shù)據(jù)文件（.abf）。在Clampfit中

57、打開該文件，開始制作I-V曲線：（1）對數(shù)據(jù)基線調(diào)零、壞點去除、濾波。（2）用Histogram功能和高斯擬合測算每個Sweep的單通道平均電流值I。（3）將平均電流值I與相應(yīng)的歩階電壓Vm輸入到Results窗口空白表格中。（4）用Create Graph作圖。（5）作回歸曲線：選擇“Straight line, standard ”作為回歸方程。（6）擬合結(jié)果：斜率電導(dǎo)m。Straight line, standard方程：單通道單通道 I-V曲線的制作曲線的制作A, 顯示膜片在不同歩階電壓下通道電流的變化. 膜片兩側(cè)液體相同.B, I-V曲線，反轉(zhuǎn)電位為0 mV，回歸后單通道斜率電導(dǎo)Gs

58、 = 3.34 nS.數(shù)據(jù)來自脂質(zhì)體上構(gòu)建的細(xì)菌機械敏感性MscL通道，施加的負(fù)壓穩(wěn)定在-70 mmHg.106Patch clamp training classApr. 23-25, 2014A 100 pA250 ms60 mV50 mV40 mV30 mV20 mV10 mV0 mV10 mV20 mV30 mV40 mV50 mV60 mVBG3.34 nS-60-40-20204060-200-1001002000 (pA)(mV)107Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 注意如下幾點：注意如下幾點： 如果膜片上含有不止 1 個通

59、道，且通道的開放概率太高，沒有單個通道開放的情況出現(xiàn)，則無法進行回歸。解決辦法： （1）如果標(biāo)本是人工質(zhì)膜，應(yīng)降低通道蛋白嵌入量，進而降低膜片上通道數(shù)目； （2）如果觀察的是配體門控性離子通道，應(yīng)該降低配體的使用濃度。108Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 避免亞開放事件、閃爍事件被計入內(nèi)。 測量多個膜片，獲得樣本量n，求出平均的I-V曲線。 由于膜片上單通道電流幅度的大小不受細(xì)胞大小的影響，故不用標(biāo)化即可進行平均。 109Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 單通道開放時間的分析首先要作出通道

60、開放時間的事件頻數(shù)直方圖，然后選擇合適的指數(shù)方程對其擬合，求出開放時間分布的時間常數(shù)值（平均開放持續(xù)時間）。五、單通道開放時間分布的直方圖五、單通道開放時間分布的直方圖110Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 普通直方圖X軸：通道開放時間Dwell time(ms)，bin值Y軸：檢測的事件數(shù)目，可寫成：Event NumberCount NumberEvents/BinEvents/x ms 對數(shù)直方圖可見通道較快速的時間常數(shù)X軸：Log dwell time(ms)，bin值Y軸：事件數(shù)目的平方根。可寫成：Square root count