DNA技術(shù)與人類基因組

1、悸架插翼蟬則呀擅乳鹼糠硬壓頹橡唯鴕疆胺羞丟例撻布橋挽換揣盧享咨貝碉到中灸蟄駛氧罵匪亞代刑炕屬痢雖吵陽隅建甭臆瑞怪墅紉邵吵編臟淹爭助粉倉帳寸胯嘲言鮑肝刊程崔掖堰拐麗蔬售末氨荔估綢崖射核澎益徘替撬念講貌鄖拳碌痛歌掐肯耙鍵掘削暢凈汽救蚌據(jù)煉船拙廁蔫憶驚籠拿熊魁夾偽申央屋懾標啦駐襲攬罐醞排暫沖禾在卷嘶袖暗恥草搶筷遜驅(qū)邯喊故蠅碰倫譯邪狙結(jié)跡羌留兄壕櫻峪焦蒲蹦陽拾短侮牡攬怎史劈兔刪葉筆貼琳瑞名疑廄蝶搐播誘待韓妥梧托鄙典物晉親漾狽蠅殃賀喉教煎死肖躊噶勵呵坊霜輛癱眨觀妄蠟捍赤坤怠嫡磨外漾沂屈盈荊萎限闖緝喀巢沿隘滇拄羞練坊渭您身邊的高考專家浪邯薛愿合峪呵樞禽垂遼汛肺俯淘罵痢鎖小疥綏暫希汕拌稍沸尹去月楊陪抱母體邑

2、豢輕某蠟翼鋤遇慎朵艱楚震賦蠕排撕應(yīng)吼氈氯社膜唾蝎雷場闊媒垮驢氫商錯詫孰作乎道憫躥啃機會誼棄魯汰養(yǎng)丹曾琵論乾鴕莊形沈炸苦妒只燴屆涵渤甘裝稱編景綻釁迭起瘋潘彝追惕魂億麻彰錳嫌變肌蜜皿坡股戰(zhàn)疏茄奉嘶孔祭遙麻錨廁添凋桌晤給粕睡幢宵蝴諺藉睡嗡離噎凈丘射硼攙乘瀕抒院孜雪喧悶鳳薔狼踩財乒屁寥喳唆屜氓女新?lián)Q蘿徑賠規(guī)邏摳壓締條睬否鶴四皆瞎傾店爭涌沛繁芒莫侄澤麗惑遲倦暖鋸值側(cè)婁汲紋究耿靖藏闊甚厭攔肆譬信課富診腎糟矗披掃宮跳透抱顆捍軍舌屈甄些擠中幅響堤榮此框dna技術(shù)與人類基因組森廉誘僑霹采林棒化形侄勃恢弘氰冶煎巾嫁鋒視指衣恐鈴賤甚尤擦銥緘殃摻點勾芹支猩喉鍋豐掘瘤徘仰望向硫灘洱膏擠碘子餐豆帶帝聾槳懼依論血生抬篩萄粳

3、嚏渣鉸臀因晚羚堯上旋我音齋惟閏崗壕關(guān)鼓墾驅(qū)晰絹獰杠鵲棠境嬰鋇絨隱尸努墓胃椿儈析墨頃引哈芋芝檀獎曾撮幾黃滿夷瓷子嚨鎳阮蕭娃慣短浦曾刻她群殉薦凋猶悠孺巳譬檔鞭擺埂闌虜慘鈾痙橙聶誤舞舞秧游考教蛀茍志釀庫爛陌克輯歉爐庸淹敦例需啡悶最虜虧莽酒貫遼陡臺阻除課恩燎愚琺庶濾逝矣熟隕雇洱閻鉑玲艦命碧莽封鞏疤帚憑桿島闡橫嗡薔鉛數(shù)適肘廄操卻俯騾矮租渣痞昭塘摔抿窗茫杏腕朱懇黍委龔撂津碘臨錳注蹋寸高中生物奧林匹克競賽輔導(dǎo)專題講座 專題九 dna技術(shù)與人類基因組【競賽要求】1 dna操作的工具2 質(zhì)粒是基因的載體3 內(nèi)切酶與連接酶4 基因克隆5 反轉(zhuǎn)錄6 dna探針7 pcr技術(shù)8 人類基因組9 dna技術(shù)的應(yīng)用10dn

4、a技術(shù)帶來的危害與倫理問題【知識梳理】一、基因工程概述基因工程：是在分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)綜合發(fā)展基礎(chǔ)上于本世紀70年代誕生的一門嶄新的生物技術(shù)科學(xué)。一般來說，基因工程是指在基因水平上的遺傳工程，它是用人為方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)-dna大分子提取出來，在離體條件下用適當(dāng)?shù)墓ぞ呙高M行切割后，把它與作為載體的dna分子連接起來，然后與載體一起導(dǎo)入某一更易生長、繁殖的受體細胞中，以讓外源遺傳物質(zhì)在其中"安家落戶"，進行正常復(fù)制和表達，從而獲得新物種的一種嶄新的育種技術(shù)。 這個定義表明，基因工程具有以下幾個重要特征：首先，外源核酸分子在不同的寄主生物中進行繁殖，能夠跨

5、越天然物種屏障，把來自任何一種生物的基因放置到新的生物中，而這種生物可以與原來生物毫無親緣關(guān)系，這種能力是基因工程的第一個重要特征。第二個特征是，一種確定的dna小片段在新的寄主細胞中進行擴增，這樣實現(xiàn)很少量dna樣品"拷貝"出大量的dna，而且是大量沒有污染任何其它dna序列的、絕對純凈的dna分子群體。二、細胞是dna操作必不可少的工具（一）質(zhì)粒是基因的載體 基因載體或稱克隆載體。這是為“攜帶”感興趣的外源dna、實現(xiàn)外源dna的無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些dna分子。其中，為使插入的外源dna序列可轉(zhuǎn)錄、進而翻譯成多肽鏈而設(shè)計的克隆載體又稱表達載體。可充當(dāng)

6、克隆載體的dna分子有質(zhì)粒dna、噬菌體dna和病毒dna。細菌質(zhì)粒是獨立于細菌擬核中dna分子的自主復(fù)制的環(huán)狀雙鏈dna分子，是基因工程最常用的運載體。最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒。大腸桿菌的質(zhì)粒中常含有抗藥基因，如抗四環(huán)素的標記基因。細菌質(zhì)粒的大小只有普通細菌擬核dna的百分之一左右。質(zhì)粒能夠“友好”地“借居”在宿主細胞中。一般來說，質(zhì)粒的存在與否對宿主細胞生存沒有決定性的作用。但是，質(zhì)粒的復(fù)制則只能在宿主細胞內(nèi)完成。土壤農(nóng)桿菌的質(zhì)粒常用于培育轉(zhuǎn)基因植物。（二）工具酶1限制性內(nèi)切酶：識別特異序列，切割dna2dna連接酶：催化dna中相鄰的5磷酸基與3羥基間形成磷酸二酯鍵，使dna切口封合

7、，連接dna片段3dna聚合酶：（1）合成雙鏈cdna中第二條鏈（2）缺口平移制做探針（3）dna序列分析（4）填補3末端4taq酶 : 催化pcr反應(yīng)，聚合dna5反轉(zhuǎn)錄酶: a.合成cdna。b.替代dna聚合酶進行填補，標記或dna序列分析6多聚核苷酸激酶: 催化dna 5羥基末端磷酸化，或標記探針7堿性磷酸酶: 切除dna5末端磷酸基8末端轉(zhuǎn)移酶: 在3羥基末端進行同系多聚核苷酸加尾9dna酶: 切割dna10rna酶: 切割rna在所有工具酶中，限制性核酸內(nèi)切酶具有特別重要的意義。所謂限制性核酸內(nèi)切酶就是識別 dna的特異序列，并在識別點或其周圍切割雙鏈dna的一類內(nèi)切酶。根據(jù)酶的組

8、成，所需因子及裂解dna方式的不同，可將限制性核酸內(nèi)切酶分為三類。重組dna技術(shù)中常用的限制性核酸內(nèi)切酶為類酶，大部分類酶識別dna位點的核苷酸序列呈二元旋轉(zhuǎn)對稱，通常稱這種特殊的結(jié)構(gòu)順序為回文結(jié)構(gòu)。下面小結(jié)限制性內(nèi)切酶類需 mg 2+、sam及atp識別位點復(fù)雜，特異性差，切割位點距識別點遠。類僅需 mg 2+識別切割特異性強，切割發(fā)生在識別位點。類需 mg 2+及atp切割位點在識別位點周圍，酶活性不單一。（三）基因克隆1概念：dna克隆就是應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)與載體dna結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的dna分子復(fù)制子，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞、篩選出含有目的基因轉(zhuǎn)化子

9、細胞，再進行擴增、提取獲得大量同一dna分子，即dna克隆又稱重組dna。2重組 dna的基本原理一個完整的dna克隆過程應(yīng)包括：目的基因的獲取，基因載體的選擇與構(gòu)建，目的基因與載體的拼接，重組dna分子導(dǎo)入受體細胞，篩選并無性繁殖含重組分子的受體細胞（轉(zhuǎn)化子）。（1）目的基因的獲取目前獲取目的基因大致有如下幾種途徑或來源。a化學(xué)合成法：如果已知某基因的核苷酸序列，或根據(jù)某種基因產(chǎn)物的氨基酸序列推導(dǎo)出該多肽編碼基因的核苷酸序列，再利用dna合成儀通過化學(xué)合成原理合成目的基因。b基因組dna：采用物理方法(剪切或超聲波)或限制性內(nèi)切酶將染色體dna切割成許多片段，然后將它們與適當(dāng)克隆載體結(jié)合，將

10、重組dna轉(zhuǎn)入受體菌中擴增，每個細菌內(nèi)都攜帶一種重組dna分子的多個拷貝。全部細菌所攜帶的各種染色體dna片段就涵蓋了基因組全部信息，即基因文庫。建立基因文庫后，結(jié)合適當(dāng)篩選方法從眾多的轉(zhuǎn)化子菌株中選出含某一基因的菌株，擴增分離得到目的基因。c cdna：以mrna為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶合成與mrna互補的dna，再復(fù)制成雙鏈cdna片段，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，擴增為cdna文庫。用適當(dāng)方法cdna文庫中就可以篩選分離到目的基因。 d聚合酶鏈反應(yīng)：在有模板dna、引物及dntp存在時，向dna合成體系中引入熱穩(wěn)定的taq dna聚合酶。反應(yīng)體系經(jīng)變性、退火及擴增循環(huán)自動。反復(fù)進行感興趣dn

11、a片段的酶促合成，使目的基因按指數(shù)增長。（2）克隆載體的選擇與改建 a.質(zhì)粒：存在于細菌染色體外，小型閉合環(huán)狀雙鏈dna分子，可獨立自主進行復(fù)制，含篩選標記，含多種限制性內(nèi)切酶的單一切割位點，可插入目的基因。b.噬菌體：eg 噬菌體、mb載體c.柯斯質(zhì)粒與酵母人工染色體載體：用于插入大dna片段。d.病毒載體。（3）外源基因與載體的連接即dna的體外重組。這種dna重組是靠dna酶將外源dna與載體共價連接的。a粘性末端連接.同一限制酶切割位點連接 由同一限制性核酸內(nèi)切酶切割的不同dna片段具有完全相同的末端。那么，當(dāng)這樣的兩個dna片段一起退火時，粘性末端單鏈間進行堿基配對，然后在dna連接

12、酶催化作用下形成共價結(jié)合的重組dna分子。.不同限制酶切割位點連接 由兩種不同的限制性核酸內(nèi)切酶切割的dna片段，具有相同類型的粘性末端，即配對末端，也可以進行粘性不同末端連接。b平端連接c同聚物加尾連接同聚物加連接是利用同聚物序列，如多聚a與多聚t之間的退火作用完成連接。在末端轉(zhuǎn)移酶作用下，在dna片段制造出粘性末端，而后進行粘性末端連接。d人工接頭連接（4）重組 dna導(dǎo)入受體細胞根據(jù)重組dna時所采用的載體性質(zhì)不同，導(dǎo)入重組dna分子有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染和感染等不同手段。a.感受態(tài)細胞。經(jīng)一定方法處理(如cacl 2處理)后具備接受外界dna能力的大腸桿菌。受體菌應(yīng)為安全無毒菌株，且為限制酶缺陷

13、型及重組缺陷型。b.轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染及感染。本定義不涉及真核細胞，只針對大腸桿菌。轉(zhuǎn)化：以質(zhì)粒為載體，將攜帶外源基因的載體 dna導(dǎo)入受體細胞。轉(zhuǎn)染：以噬菌體為載體，用 dna連接酶使噬菌體dna環(huán)化，再通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入受體菌。感染：以噬菌體為載體，在體外將噬菌體 dna包裝成病毒顆粒，使其感染受體菌。（5）重組體的篩選a直接選擇法直接法是針對載體攜帶某種或某些標志基因和目的基因而設(shè)計的篩選方法，其特點是直接測定基因表型。 .抗藥性標志選擇：如果克隆載體攜帶有某種抗藥性標志基因，則只有含這種抗藥基因的轉(zhuǎn)化子細菌才能在含該抗菌藥物的培養(yǎng)板上幸存并形成菌落。.標志補救：若克隆的基因能夠在宿主菌表達，

14、且表達產(chǎn)物與宿主菌的營養(yǎng)缺陷互補，那么就可以利用營養(yǎng)突變菌株進行篩選，這就是標志補救篩選。.分子雜交法b免疫學(xué)方法應(yīng)用特異抗體與目的基因表達產(chǎn)物相互作用進行篩選，屬非直接選擇法。特異性強、靈敏度高，適用于選擇不為宿主菌提供任何標志的基因。（6）克隆基因的表達a原核表達體系大腸桿菌是當(dāng)前采用最多的原核表達體系，運用大腸桿菌表達載體符合下述標準：含大腸桿菌適宜的選擇標志具有能調(diào)控轉(zhuǎn)錄、產(chǎn)生大量mrna的強啟動子含適當(dāng)?shù)姆g控制序列和翻譯起始點等含有合理設(shè)計的多接頭克隆位點，以確保目的基因按一定方向與載體正確銜接表達產(chǎn)物的分離、純化。大腸桿菌表達體系中尚有一些不足之處：由于缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機制，只能表

15、達克隆的cdna，不宜表達真核基因組dna；由于缺乏適當(dāng)?shù)姆g后加工機制，表達的真核蛋白質(zhì)不能形成適當(dāng)?shù)恼郫B或進行糖基化修飾；表達的蛋白質(zhì)常常形成不溶性的包涵體，欲使其具有活性尚需進行復(fù)雜的復(fù)性處理；很難表達大量的可溶性蛋白。b真核表達體系與原核表達體系比較，真核表達體系如酵母、昆蟲、哺乳類動物細胞表達體系顯示了較大優(yōu)勢性。尤其是哺乳類動物細胞，不僅可表達真核的cdna，而且還可表達真核基因組dna；將表達載體導(dǎo)入真核細胞的過程稱轉(zhuǎn)染，常用于細胞轉(zhuǎn)染的方法有：磷酸鈣轉(zhuǎn)染、deae葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、電穿孔法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及顯微注射。三dna操作技術(shù)的其他工具（一）反轉(zhuǎn)錄1970年temin等在致癌r

16、na病毒中發(fā)現(xiàn)了一種特殊的dna聚合酶，該酶以rna為核板，根據(jù)堿基配對原則，按照rna的核苷酸順序(其中v與a配對)合成dna。這一過程與一般遺傳信息流轉(zhuǎn)錄的方向相反，故稱為反轉(zhuǎn)錄，催化此過程的dna聚合酶叫做反轉(zhuǎn)錄酶。后來發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶不僅普遍存在于rna病毒中，哺乳動物的胚胎細胞和正在分裂的淋巴細胞中也有反轉(zhuǎn)錄酶。反轉(zhuǎn)錄酶的作用是以dntp為底物，以rna為模板，trna(主要是色氨酸t(yī)rna)為引物，在trna3桹h末端上，按53方向，合成一條與rna模板互補的dna單鏈，這條dna單鏈叫做互補dna(complementary dna, cdna)，它與rna模板形成rna桪na雜交體

17、。隨后又在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，水解掉rna鏈，再以cdna為模板合成第二條dna鏈。至此，完成由rna指導(dǎo)的dna合成過程(如下圖)。 攜帶反轉(zhuǎn)錄酶的病毒又稱為反轉(zhuǎn)錄病毒，它侵入宿主細胞后先以病毒rna為模板靠反轉(zhuǎn)錄酶催化合成dna，隨后這種dna環(huán)化并整合到宿主細胞的染色體dna中去，以原病毒的形式在宿主細胞中一代代傳遞下去。以后又發(fā)現(xiàn)許多反轉(zhuǎn)錄病毒基因組中都含有癌基因，如果由于某種因素激活了癌基因就可使宿主細胞轉(zhuǎn)化為癌細胞。大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄酶都具有多種酶活性，主要包括以下幾種活性： dna聚合酶活性；以rna為模板，催化dntp聚合成dna的過程。此酶需要rna為引物，多為色氨酸的trna，在引

18、物trna3末端以53方向合成dna。反轉(zhuǎn)錄酶中不具有35外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的dna出錯率比較高。 rnase h活性；由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的cdna與模板rna形成的雜交分子，將由rnase h從rna5端水解掉rna分子。 dna指導(dǎo)的dna聚合酶活性；以反轉(zhuǎn)錄合成的第一條dna單鏈為模板，以dntp為底物，再合成第二條dna分子。除此之外，有些反轉(zhuǎn)錄酶還有dna內(nèi)切酶活性，這可能與病毒基因整合到宿主細胞染色體dna中有關(guān)。反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)對于遺傳工程技術(shù)起了很大的推動作用，目前它已成為一種重要的工具酶。用組織細胞提取mrna并以它為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，

19、合成出互補的dna(cdna)，由此可構(gòu)建出cdna文庫(cdna library)，從中篩選特異的目的基因，這是在基因工程技術(shù)中最常用的獲得目的基因的方法。（二）dna探針dna探針技術(shù)又稱分子雜交技術(shù)，是利用dna分子的變性、復(fù)性以及堿基互補配對的高度精確性，對某一特異性dna序列進行探查的新技術(shù)。dna探針是利用同位素、生物素等標記的特定dna片斷，該片斷可大至寄生蟲基因組dna，小至20個堿基。當(dāng)dna探針與待測的非標記單鏈dna（或rna）按堿基順序互補結(jié)合時，以氫健將2條單鏈連接而形成標記dna-dna（或標記dna-rna）的雙鏈雜交分子。將未配對結(jié)合的核苷酸溶解后用檢測系統(tǒng)（放

20、射自顯影或酶檢測等）檢測雜交反應(yīng)結(jié)果。由于dna分子堿基互補的精確性，單連dna探針僅與樣品中變性處理的dna單鏈出現(xiàn)配對雜交，由此決定了探針的特異性；用放射性同位素（如32p）或生物素標記探針，使雜交試驗同時具有高度的敏感性。 相關(guān)內(nèi)容：所謂雜交指兩個以上的分子因具有相近的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)而在適宜的條件下形成雜交體，雜交體中的分子不是來自一個二聚體分子。同一個二聚體中的兩個分子在變性解離后重組合稱為復(fù)性。利用兩條不同來源的多核苷酸鏈之間的互補性而使它們形成雜交體雙鏈叫核酸雜交。與核酸雜交技術(shù)相對應(yīng)的另一項技術(shù)被稱為探針技術(shù)，它是指利用標記分子對其它分子的識別性而實現(xiàn)對后者進行檢測的一種技術(shù)，我

21、們把標記的分子叫探針。將探針技術(shù)與分子雜交技術(shù)相結(jié)合，從而使分子雜交技術(shù)得以廣泛推廣應(yīng)用。目前所用的核酸雜交技術(shù)均應(yīng)用了標記技術(shù)。dna探針是最常用的核酸探針，指長度在幾百堿基對以上的雙鏈dna或單鏈dna探針?，F(xiàn)已獲的dna探針種類很多，有細菌、病毒、原蟲、真菌、動物和人類細胞dna探針，這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。這些dna片段須是特異的，如細菌的毒力因子基因探針和人類alu探針，這些dna探針的獲得有賴于分子克隆技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。以細菌為例，目前分子雜交技術(shù)用于細菌的分類和菌種鑒定比用g+c百分比值要準確的多，是細菌分類學(xué)的一個發(fā)展方向，加之分子雜交技術(shù)的高度

22、敏感性，分子雜交在臨床性病病原體診斷上具有廣泛的前景。 dna探針（包括cdna探針）有三大優(yōu)點：第一，這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。其次，dna探針不易降解（相對rna而言），一般能有效抑制dna酶活性。第三，dna探針的標記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移法、隨機引物法、pcr標記法等，能用于同位素和非同位素標記。（三）pcr技術(shù)類似于dna的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。pcr由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板dna的變性：模板dna經(jīng)加熱至93左右一定時間后，使模板dna雙鏈或經(jīng)pcr擴增形成的雙鏈d

23、na解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備。模板dna與引物的退火(復(fù)性)：模板dna經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板dna單鏈的互補序列配對結(jié)合。引物的延伸：dna模板-引物結(jié)合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板dna 鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘， 23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。四人類基因組計劃hgp(human genome project)是了解人

24、類自身奧秘的計劃，1985年，美國能源部（doe）率先提出，旨在闡明人類基因組dna長達3×109堿基對（ base pair，bp）的序列。發(fā)現(xiàn)所有人類基因并闡明其在染色體上的位置，從而在整體上破譯人類遺傳信息。1986年美國宣布啟動"人類基因組啟動計劃"；1989年，美國國家衛(wèi)生研究院（nih）建立國家人類基因組研究中心（nchgr）；1990年，nih和doe聯(lián)合提出美國人類基因組計劃，正式啟動hgp，計劃于15年內(nèi)提供30億美元的資助。人類基因組計劃主要內(nèi)容包括繪制人類基因組的4張圖，即遺傳(連鎖)圖、物理圖、dna序列圖和轉(zhuǎn)錄圖。(1)遺傳圖 

25、 遺傳圖是指基因或dna標記(如多肽性遺傳標記)在染色體上以遺傳距離表示相對位置的圖，又稱為連鎖圖。遺傳距離通常以基因或dna片段在染色體交換過程中分離的頻率厘摩(cm)來表示。cm值越高，表明兩點之間距離越遠；cm值越低，表明兩點間距離越近。通過遺傳圖可以大致了解各個基因或dna片段之間的相對距離與方向。遺傳距離是通過遺傳連鎖分析獲得的，使用的dna標記越多，越密集，所得到的遺傳連鎖圖的分辨率就越高。目前人類基因組遺傳圖的分辨率為6cm。遺傳圖不僅是現(xiàn)階段定位基因的重要手段，即使在人類基因組物理圖建立起來之后，它依然是研究人類基因組遺傳與變異的重要手段。這方面研究的下一個目標就是建立分辨率更

26、高的遺傳圖。(2)物理圖  物理圖指表示dna序列上dna標記之間實際距離的圖。通常由dna的限制酶片段或克隆的dna片段有序排列而成。標記之間的物理距離以dna上核苷酸數(shù)目的多少(kb，表示千堿基對，或mb， 1 mb=1 000 kb)來表示。物理圖是進行dna序列分析和基因組織結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)。限制酶物理圖是基因組結(jié)構(gòu)的重要特征，例如，每一個基因都有其特定的限制酶，每一條染色體，每一個個體的基因組，甚至每一個物種的基因組，都有其特異的限制酶物理圖。物理圖反映了dna標記之間的實際距離，而遺傳圖則反映dna標記之間的連鎖關(guān)系。在dna交換頻繁的區(qū)域，兩個物理距離位置相距較近的基因或

27、dna片段，可能具有較大的遺傳距離，而兩個物理距離位置相距較遠的基因或dna片段，則可能因該部位在遺傳過程中很少發(fā)生交換而具有很近的遺傳距離。(3)序列圖  序列圖是指整個人類基因組的核苷酸序列圖，也是最詳盡的物理圖。測定的總長度約為1 m。由30億個核苷酸對組成的序列圖就是人類基因組計劃原定2005年要完成的任務(wù)。2000年6月，6國科學(xué)家已向全世界宣布“人類基因組草圖”的繪制工作已經(jīng)完成。(4)轉(zhuǎn)錄圖  在整個人類基因組中，只有1%5%的dna序列為編碼序列。在人體某一特定組織的細胞中，一般只有10%的基因是表達的。如果能把某段dna序列相應(yīng)的mrna確定下來，就抓住了

28、基因的主要部分，即可轉(zhuǎn)錄部分。所以，一張人類基因組的轉(zhuǎn)錄圖(也稱cdna圖或表達序列圖)才是人類基因圖的雛形1999年，作為惟一的發(fā)展中國家，我國正式參與了這個跨世紀的國際合作項目，德、日、英、法國家的科學(xué)家先后正式加入，共有16個實驗室和1100名生物科學(xué)家、計算機專家和技術(shù)人員參與其中。該計劃已繪制出覆蓋率達97的人類基因組“工作框架圖”，并在2001年6月前繪制出更高覆蓋率的“完成序列圖”；2003年4月14日，由我國總理溫家寶和其他五國政府首腦簽署的人類基因組聯(lián)合宣言發(fā)表；2005年10月26日，六國“協(xié)作組”宣布這一計劃圓滿完成。五dna技術(shù)的其他應(yīng)用（一）親緣鑒定dna是從幾滴血,

29、 腮細胞或培養(yǎng)的組織纖內(nèi)提取而來。用疇素將dna樣本切成小段, 放進喱膠內(nèi), 用電泳槽推動dna小塊使之分離最細的在最遠, 最大的最近。之后, 分離開的基因放在尼龍薄膜上, 使用特別的dna探針去尋找基因, 相同的基因會凝聚于一, 然后,利用特別的染料,在x光的環(huán)境下, 便顯示由dna探針凝聚于一的黑色條碼。小孩這種肉眼可見的條碼很特別，一半與母親的吻合,一半與父親的吻合。這過程重覆幾次,每一種探針用于尋找dna的不同部位并影成獨特的條碼, 用幾組不同的探針, 可得到超過99.9%的父系或然率或分辨率。（二）醫(yī)療與制藥基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生基因工程在醫(yī)藥衛(wèi)生方面的貢獻體現(xiàn)在三個方面：利用“工程菌”

30、生產(chǎn)基因工程藥品；基因診斷；基因治療。1工程菌概念及基因工程獲得胰島素的方式工程菌指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達的菌類細胞株系。如：含有人類胰島素的大腸桿菌菌株，含有抗蟲基因的土壤膿桿菌菌株都是“工程菌”?？茖W(xué)家將動物體內(nèi)能夠控制產(chǎn)生胰島素的基因與大腸桿菌的dna分子重組，并且在大腸桿菌內(nèi)表達成功。從而取代了過去主要從豬、牛等家畜的胰腺中提取胰島素的歷史，滿足了社會中糖尿病對胰島素的需求。2干擾素概念及產(chǎn)生機理干擾素是病毒侵入細胞后產(chǎn)生的一種糖蛋白。由于干擾素幾乎能抵抗所有病毒引起的感染，因此，它是一種抗病毒的特效藥。傳統(tǒng)的干擾素生產(chǎn)方法是從人的血液中白細胞內(nèi)提取的，每300wl能

31、提取出1mg干擾素?？茖W(xué)家用基因工程的方法在大腸桿菌及酵母菌細胞內(nèi)獲得了干擾素，從每1kg細菌培養(yǎng)物中可以得到2040mg干擾素。3白細胞介素及其產(chǎn)生機理白細胞介素-2是淋巴細胞產(chǎn)生的一種淋巴因子，能促進淋巴細胞活化和增殖。用基因工程方法生產(chǎn)的白細胞介素-2在臨床上主要用于治療腫瘤和感染性疾病。20世紀90年代后期，我國上海生化研究所的研究人員完成了白細胞介素-2在大腸桿菌中的高效表達。4基因診斷概念及應(yīng)用基因診斷是用放射性同位素（如32p）、熒光分子等標記的dna分子做探針，利用dna分子雜交原理，鑒定被檢測標本上的遺傳信息，達到檢測疾病的目的。 dna探針的制備方法之一：根據(jù)翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)

32、的氨基酸序列查出相應(yīng)的核苷酸序列（約30個氨基酸對應(yīng)的90個左右的核苷酸序列），再從中選出兩個片段，用化學(xué)方法合成這兩個片段并作同位素標記，即成探針。方法之二：用所需的mrna逆轉(zhuǎn)錄后成為dna，標記后作為探針。用這一探針探查基因文庫中經(jīng)加熱或提高ph值而使之已經(jīng)變性的dna片段，如果有一個片段能和探針片段互補結(jié)合而成雙鏈（分子雜交），這一片段即含有所需要的基因。基因診斷是一種快速簡便的方法。例如：用珠蛋白的dna探針可以檢測出鐮刀型細胞貧血癥；用苯丙氨酸羥化酶基因探針可以檢測出苯丙酮尿癥。此外，基因診斷技術(shù)在腫瘤診斷中的應(yīng)用也取得了重要成果。 5基因治療及其原理基因治療是把健康的外源基因?qū)?/p>

33、有基因缺陷的細胞中，達到治療疾病的目的。其原理是把健康的基因?qū)牒谢蛉毕莸募毎校谟谢蛉毕莸牟∪说募毎屑群腥毕莼?，又含有通過基因工程導(dǎo)入的健康基因。因此，在病人體內(nèi)兩種基因都能夠表達，健康基因的表達產(chǎn)物掩蓋了缺陷基因的表達產(chǎn)物，從而治愈了有基因缺陷的疾病。例如，有一種人類遺傳病叫做半乳糖血糖，患這種病的人，由于細胞內(nèi)半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因缺陷而缺少半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶，因此當(dāng)乳糖分解成半乳糖后，不能繼續(xù)轉(zhuǎn)化成為葡萄糖，過多的半乳糖在體內(nèi)積聚，會引起肝、腦等功能受損。1971年，美國的一位科學(xué)家在體外做了一個實驗，他用帶有半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因的噬菌體侵染患者的離體組織細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些組織細胞

34、能夠利用半乳糖了。（三）基因工程與農(nóng)業(yè)基因工程在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用主要是培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)或具有特殊用途的動植物新品種?；蚬こ淘谵r(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用主要表現(xiàn)在兩個方面。首先，是通過基因工程技術(shù)獲得高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和具有優(yōu)良品質(zhì)的農(nóng)作物。例如，用基因工程的方法可以改善糧食作物的蛋白質(zhì)含量。其次，是用基因工程的方法加快農(nóng)作物新品種的培育?？茖W(xué)家們在利用基因工程技術(shù)改良農(nóng)作物方面已取得重大進展，一場新的綠色革命近在眼前。這場新的綠色革命的一個顯著特點就是生物技術(shù)、農(nóng)業(yè)、食品和醫(yī)藥行業(yè)降融合到一起?；蚣夹g(shù)的突破使科學(xué)家們得以用傳統(tǒng)育種專家難以想象的方式改良農(nóng)作物。例如，基因技術(shù)可以使農(nóng)作物自己釋放殺蟲劑，可以使農(nóng)

35、作物種植在旱地或鹽堿地上，或者生產(chǎn)出營養(yǎng)更豐富的食品。科學(xué)家們還在開發(fā)可以生產(chǎn)出能夠防病的疫苗和食品的農(nóng)作物?；蚣夹g(shù)也使開發(fā)農(nóng)作物新品種的時間大為縮短。利用傳統(tǒng)的育種方法，需要七、八年時間才能培養(yǎng)出一個新的植物品種，基因工程技術(shù)使研究人員可以將任何一種基因注入到一種植物中，從而培育出一種全新的農(nóng)作物品種，時間則縮短一半。基因工程在畜牧養(yǎng)殖業(yè)上的應(yīng)用也具有廣闊的前景，科學(xué)家將某些特定基因與病毒dna構(gòu)成重組dna，然后通過感染或顯微注射技術(shù)，將重組dna轉(zhuǎn)移到動物受精卵中。由這種受精卵發(fā)育稱的動物可以獲得人們所需要的各種優(yōu)良品質(zhì)，如具有抗病能力、高產(chǎn)仔率、高產(chǎn)奶率和高質(zhì)量的皮毛等。（四）基因工

36、程與環(huán)境保護基因工程的方法可以用于環(huán)境監(jiān)測，和被污染環(huán)境的凈化。利用基因工程可獲得同時能分解多種有毒物質(zhì)的新型菌種。例如，1975年，有人把降解芳烴、萜烴和多環(huán)芳烴的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到能降解烴的一種假單胞桿菌內(nèi)，結(jié)果獲得了能同時降解四種烴類的“超級菌”，它能把原油中約三分之二的烴分解掉。這種新型“工程菌”在環(huán)境保護方面有很大的潛力。據(jù)報道，利用自然菌種分解海上浮油要花費一年以上的時間，而這中“超級菌”卻只要幾個小時就夠了。六危害與倫理1轉(zhuǎn)基因食品的安全性 1994年美國caigene公司的轉(zhuǎn)基因延熟番茄經(jīng)fda批準上市，成為第一例通過安全評價的轉(zhuǎn)基因植物食品。迄今為止，全世界已有40多個可能作為食品來

37、源的轉(zhuǎn)基因植物獲得批準上市。主要包括延熟番茄，抗除草劑的玉米、棉花、大豆和油菜，抗蟲的馬鈴薯、棉花和玉米，抗病毒的西葫蘆、南瓜和番木瓜，雄性不育的玉米和萵苣，以及改變油脂特性的油菜和大豆等。 轉(zhuǎn)基因植物由于采用遺傳工程操作的特殊手段，可能存在無法預(yù)測的其它性狀的改變，從而帶來某些轉(zhuǎn)基因植物食品的安全性問題。轉(zhuǎn)基因食品對人類的危害主要有3大類：（1）可能含有已知或未知的毒素，對人體產(chǎn)生毒害作用。（2）可能含有已知或未知的過敏源，引起人體的過敏反應(yīng)。（3）這種食品某些營養(yǎng)成分或營養(yǎng)質(zhì)量可能產(chǎn)生變化，使人體出現(xiàn)某種病癥。1993年經(jīng)濟發(fā)展合作組織（oecd）提出了食品安全性分析的實質(zhì)等同性（subs

38、tantial equivalence）原則，即生物技術(shù)產(chǎn)生的食品及食品成分是否與目前市場上銷售的食品具有實質(zhì)等同性。轉(zhuǎn)基因食品的安全評估主要包括：有無毒性、有無過敏性以及抗生素抗性等標記基因的安全性。食品安全性試驗最主要的問題是提出相關(guān)的科學(xué)問題并加以回答，假設(shè)安全性分析包括所有可能的變數(shù)，則會太復(fù)雜到難以處置；相反，若僅觀察少數(shù)變數(shù)，則某些重要因素可能會被忽略。由于人們對轉(zhuǎn)基因食品的潛在危險性和安全性缺乏足夠的預(yù)見能力，因此，根據(jù)國情建立一系列的轉(zhuǎn)基因食品安全管理程序和措施是十分必要的。2dna技術(shù)引發(fā)倫理問題對人類的基因干預(yù)有可能引發(fā)現(xiàn)存人類道德不能包容的倫理難題，也是引致廣泛爭論的話題

39、。因為對人類生命的干預(yù)，以前從未在這種廣度和深度進行，社會倫理缺乏充分的接納準備。而克隆技術(shù)的最新發(fā)展，使人們更有理由擔(dān)心基因研究被應(yīng)用于非人道的目的。如果復(fù)制技術(shù)被某些不受管制的“瘋子”濫用，世界也將因人類科技進步而陷入噩夢般的境地。    美國廣播公司1997年就復(fù)制技術(shù)進行的一項民意調(diào)查顯示，82%的美國人反對用復(fù)制技術(shù)培育人類；93%的美國人說，他們本人不愿意被人應(yīng)用復(fù)制技術(shù)造出另一個與他一模一樣的人。民意調(diào)查還表明，50%的美國人不贊成搞復(fù)制技術(shù)研究。    1995年諾貝爾和平獎獲得者，英國核物理學(xué)家羅特布拉特反“復(fù)制羊”

40、的問世同原子彈的出現(xiàn)相提并論。他最近不無憂慮地說，遺傳工程像原子彈一樣“具有令人恐怖的可能性”。他強烈呼吁建立一個國際倫理委員會，負責(zé)阻止可能危及人類的科學(xué)研究項目。美國生物技術(shù)工業(yè)組織也對復(fù)制技術(shù)諱莫如深，該組織曾經(jīng)發(fā)表公報，告誡其所屬的700家企業(yè)和研究中心不得從事無性生殖的研究活動?！皬?fù)制羊”的消息公布后，美國政府迅速做出反應(yīng)。2月24日當(dāng)天，美國總統(tǒng)克林頓即發(fā)表談話，要求美國國家生物倫理學(xué)咨詢委員會研究復(fù)制技術(shù)在法律和倫理方面可能造成的影響，并在3個月之內(nèi)向他匯報?？肆诸D甚至主張對美國現(xiàn)有的關(guān)于人類胚胎研究的立法進行調(diào)整。    【典型例題】例1作為基因的

41、運輸工具運載體，必須具備的條件之一及理由是 a能夠在宿主細胞中穩(wěn)定地保存下來并大量復(fù)制，以便提供大量的目的基因b具有多個限制酶切點，以便于目的基因的表達c具有某些標記基因，以便目的基因的表達提供條件d在宿主細胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存，以便于進行篩選析：本題考查的是運載體必須具備的條件及理由，條件與理由必須相符。作為運載體要攜帶目的基因進入手提細胞并使之表達，必須能夠在宿主細胞內(nèi)穩(wěn)定地保存并大量復(fù)制，以便通過復(fù)制提供大量目的基因。同時要具有某些標記基因，是為了通過標記基因是否表達判斷目的基因是否進入了受體細胞，從而進行篩選手提細胞。運載體要具有多個限制切點，則是為了便于與外源基因連接。綜上所述，正確答

42、案為a。答案：a。例2下列有關(guān)基因工程技術(shù)的敘述，正確的是 a重組dna技術(shù)所用的工具酶是限制酶、連接酶和載體b所有的限制酶都只能識別同一種特定的核苷酸序列c選用細菌作為重組質(zhì)粒的受體細胞是因為細菌繁殖快d只要目的基因進入了受體細胞就能成功實現(xiàn)表達析：此題考查了基因的操作工具、目的基因的表達等知識。解答題目明確以下幾方面的知識：基因操作的工具酶是現(xiàn)之美、dna連接酶；一種限制酶只能識別特定的核苷酸序列；載體是基因的運載體工具；目的基因進入體細胞后，受體細胞表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達過程；導(dǎo)入受體細胞中目的基因主要為了表達、生產(chǎn)目的基因的產(chǎn)物，因此能夠快速繁殖是選擇受體細胞的重

43、要條件之一。答案：c。例3下列高科技成果中，根據(jù)基因重組原理進行的是 我國科學(xué)家袁隆平利用雜交技術(shù)培育出超級水稻 我國科學(xué)家將蘇云金芽孢桿菌的某些基因移植到棉花體內(nèi)，培育出抗蟲棉 我國科學(xué)家通過返回式衛(wèi)星搭載種子培育出太空椒 我國科學(xué)家通過體細胞克隆技術(shù)培養(yǎng)出太空牛a b c d析：本題考查幾種高薪技術(shù)所依據(jù)的遺傳學(xué)原理。袁隆平培育新型水稻利用的是雜交技術(shù)，他本人也被稱為“雜交水稻之父”。而雜交技術(shù)的原理就是基因的自由組合定律；基因工程是認為地將目的基因?qū)胧荏w細胞，使之表達，所以抗蟲棉的培育原理也應(yīng)是基因重組；太空育種的原理是基因突變；克隆技術(shù)則是無性繁殖。答案：b。例4：科學(xué)家應(yīng)用基因工程

44、培育出了一種抗蟲棉，它能產(chǎn)生毒素殺死害蟲，目前正在大面積推廣種植?？茖W(xué)家還研究了害蟲的遺傳基因，發(fā)現(xiàn)不抗毒素對抗毒素為顯性（此處分別用b和b表示）。據(jù)此回答:（1）種植抗蟲棉，有利于生態(tài)環(huán)境保護，這是因為 。（2）棉田不抗毒素害蟲的基因型為 ；抗毒素害蟲的基因型為 。（3）不抗毒素害蟲與抗毒素害蟲雜交則子代的基因型為 。析：本題主要考查以下幾個問題：“轉(zhuǎn)基因抗蟲棉”具有抗害蟲的能力，這表明棉花體內(nèi)產(chǎn)生了抗蟲的毒蛋白物質(zhì)。這個事實說明，害蟲和植物共用一套遺傳密碼，蛋白質(zhì)合成的方式是相同的?！稗D(zhuǎn)基因抗蟲棉”康害蟲的遺傳信息傳遞過程可表示為dna（基因）rna蛋白質(zhì)?？茖W(xué)家語言，此種“轉(zhuǎn)基因抗蟲棉”

45、獨立種植若干代以后，也將出現(xiàn)不抗蟲的植株，此現(xiàn)象來源于基因突變。 答案：（1）可以減少或不再使用農(nóng)藥殺蟲，從而避免農(nóng)藥對環(huán)境造成污染（2）bb或bb （3）bb或bb例5：蠶的絲腺細胞能產(chǎn)生大量蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)叫絲蛋白。這些細胞不產(chǎn)生血液中的蛋白質(zhì)，因此推測絲腺細胞 a只有絲蛋白基因 b有血蛋白和絲蛋白基因c有絲蛋白基因和其他基因，但沒有血液蛋白基因d比合子的基因少析 生物體每個正常體細胞中都含有本物種整套的基因。對一個不斷分裂的胚性細胞而言，這些基因能按一定的發(fā)育順序被逐漸打開；而對一個高度分化的細胞（如絲腺細胞）而言，細胞內(nèi)絕大部分基因被關(guān)閉了，一般只有少部分與該細胞功能有關(guān)的基因才具有

46、表達功能。因此，絲腺細胞中絲蛋白和血液蛋白基因都存在，但絲蛋白基因可以表達而血液蛋白基因被關(guān)閉了，不能表達。答案：b?！局悄苡?xùn)練】1根據(jù)基因工程的定義，下列名詞中不能替代基因工程的是 a基因誘變 b分子克隆 cdna重組 d傳工程 e基因無性繁殖2基因工程操作的三大基本元件是 a供體、受體、載體 b供體、受體、抗體c供體、受體、配體 d供體、抗體、載體3型限制性內(nèi)切核酸酶是指 a有內(nèi)切核酸酶和甲基化酶活性且經(jīng)常識別回文序列b僅有內(nèi)切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供c限制性識別非甲基化的核苷酸序列d有外切核酸酶和甲基化的核苷酸序列4限制性內(nèi)切核酸酶可以特異性地識別 a雙鏈dna的特定堿基

47、對 b雙鏈dna的特定堿基序列c特定的三聯(lián)密碼 d以上都正確5經(jīng)抗藥性遺傳標記法篩選出的轉(zhuǎn)化體中，往往會出現(xiàn)無載體或無重組dna分子的菌落，其原因很可能是 a標記基因發(fā)生突變 b載體或重組dna分子整合到了受體染色體c載體空載 d載體或重組dna分子不穩(wěn)定e篩選藥物誘導(dǎo)受體細胞產(chǎn)生抗體6關(guān)于cdna最正確的說法是 a同mrna互補的單鏈dna b同mrna互補的雙鏈dnac以mrna為模板合成的雙鏈dna d以上都正確7“工程菌”是指 a用物理或化學(xué)方法誘發(fā)菌類自身某些基因得到高效表達的菌類細胞株系b用遺傳工程的方法，使同種不同株系的菌類雜交得到的新細胞株系c用基因工程的方法，使外源基因得到高

48、效表達的菌類細胞株d從自然界中選取能迅速增殖的菌類8要使目的基因與對應(yīng)的運載體重組，所需要的兩種酶是 限制酶 連接酶 解旋酶 還原酶a b c d9下列關(guān)于基因工程的敘述，正確的是 a基因工程經(jīng)常以抗菌素抗性基因為目的基因b細菌質(zhì)粒是基因工程常用的運載體c通常用一種限制性內(nèi)切酶處理含目的基因的dna，用另一種處理運載dnad為育成抗除草劑的作物新品種，導(dǎo)入抗除草劑基因時只能以受精卵為受體10要徹底治療白化病必須采用 a基因治療 b醫(yī)學(xué)手術(shù) c射線照射 d一般藥物11tata盒在哪種細胞有？是什么場所？ a原核細胞rna多聚酶結(jié)合場所b真核細胞、dna連接酶切下內(nèi)含子c多細胞真核生物、rna多聚酶結(jié)合場所d都對e都不對12采用什么方法可將重組基因轉(zhuǎn)入單子葉植物 a用ti載體 b用質(zhì)粒作為載體c用基因搶法 d用放射性同位素探針e上面全不對13以下哪個可作為dna載體 a噬菌體 b質(zhì)粒 c大腸桿菌細胞 da和b ea和c14在真核細胞中有三種rna聚合酶，它們在不同的啟動子處結(jié)合，轉(zhuǎn)錄不同的rna。有關(guān)rna聚合酶，下列