天然產(chǎn)物分析實(shí)驗(yàn)

1、天然產(chǎn)物活性成分檢測實(shí)驗(yàn)報告 姓名：李雪怡 學(xué)號：2012332870009 年級班級：12生物制藥（1）班實(shí)驗(yàn)一：茶葉中茶多酚的粗提取與含量測定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、了解并熟悉茶多酚的元素組成、結(jié)構(gòu)構(gòu)成、理化性質(zhì)。2、掌握溶劑萃取法粗提取茶多酚的原理與操作。3、掌握酒石酸鐵比色法測定茶多酚的含量的原理及操作。4、了解分光光度計的使用方法和注意事項。二、實(shí)驗(yàn)原理和應(yīng)用：茶多酚（Tea Polyphenols）是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，包括黃烷醇類、花色苷類、黃酮類、黃酮醇類和酚酸類等。其中以黃烷醇類物質(zhì)（兒茶素）最為重要。 茶多酚又稱茶鞣或茶單寧，是形成茶葉色香味的主要成份之一，也是茶葉中有保健功

2、能的主要成份之一。研究表明，茶多酚等活性物質(zhì)具解毒和抗輻射作用，能有效地阻止放射性物質(zhì)侵入骨髓，并可使鍶90和鈷60迅速排出體外，被健康及醫(yī)學(xué)界譽(yù)為“輻射克星”。目前國內(nèi)外茶多酚粗品的提取的方法主要有：溶劑萃取法、離子沉淀法、樹脂吸附分離法、超臨界流體萃取法、超聲波浸提方法、微波浸提法等等。在這些提取茶多酚的方法中 ，每種方法都有它各自的針對性和使用范圍 ，使用時要根據(jù)各自的情況而定。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的條件及實(shí)驗(yàn)要求，本實(shí)驗(yàn)采用溶劑萃取法對干茶葉中的茶多酚進(jìn)行粗提取，即利用茶多酚易溶于乙酸乙酯等有機(jī)溶劑的原理進(jìn)行液-液萃取。茶多酚的測定方法有高錳酸鉀直接滴定法和酒石酸鐵比色法，由于高錳酸鉀直接滴定法

3、操作比較復(fù)雜，且靠肉眼觀察顏色判斷終點(diǎn)，如果樣品溶液顏色較深時，可能影響測定結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)將應(yīng)用酒石酸鐵比色法測定茶多酚的含量。酒石酸鐵能與茶多酚生成紫褐色絡(luò)合物，絡(luò)合物溶液顏色的深淺與茶多酚的含量成正比。因此可以用比色方法測定。該法可避免高錳酸鉀滴定法所產(chǎn)生的人為視覺誤差。三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑實(shí)驗(yàn)儀器：分光光度計、干燥箱、電子天平 、pH計、真空泵、紗布、漏斗、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、250ml 容量瓶、50ml 容量瓶、分液漏斗實(shí)驗(yàn)材料：干茶葉（市售散裝茶即可）實(shí)驗(yàn)試劑：硫酸亞鐵 (FeSO4·7H2O) ，酒石酸鉀鈉 (KNaC4H4O6·4H2O) ，磷酸氫二鈉 (Na2HP

4、O4·12H2O) ，磷酸二氫鈉 (NaH2PO4·2H2O) ，乙酸乙酯。四、實(shí)驗(yàn)操作1、溶液的配制酒石酸亞鐵溶液制備：稱取0.25 g （準(zhǔn)確至0.0001）硫酸亞鐵，1.25 g酒石酸鉀鈉（準(zhǔn)確至0.0001），用水溶解并定容至250 ml（低溫保存，有效期10天）。2、干茶葉的預(yù)處理將干茶葉洗凈、晾干，烘干，最后粉碎。粉碎的目的是與液體的接觸面增大使提取率增高。由于試驗(yàn)條件的限制，用剪刀代替粉碎機(jī)將干茶葉剪碎，并且用研缽研細(xì)，干茶葉量為50. 00g。3、茶多酚的粗提取與定性檢測稱取經(jīng)過預(yù)處理的干茶葉末30. 00g，加入250mL 90接近沸水中攪拌浸提、過濾，先

5、后用 250mL的乙酸乙酯萃取兩次。合并兩次有機(jī)相。減壓蒸餾除去乙酸乙酯溶劑得黃色粉末狀茶多酚。從外觀上看，為黃色粉末狀。物理性能為，易溶于水及乙醇，味苦澀。圖 1 高濃度茶多酚樣品（98%）4、茶多酚溶液的配置與含量的測定稱取步驟3中提取的茶多酚粉末0.2500g，加水溶解定容至 250mL，混勻 ，即為每毫升含 1mg步驟3中提取的茶多酚粉末的溶液。分別取茶多酚溶液1. 0mL、2. 0mL、3. 0mL、4. 0mL于 4個 50mL容量瓶中，各加水至10mL，再加酒石酸亞鐵溶液 10mL，加入 pH為 7. 5的磷酸緩沖液至刻度，混勻后用1cm比色皿，以空白試劑作參比，于波長 540n

6、m處測定吸光度 A，計算實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并繪制實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表格。茶多酚的含量(%)，A樣品溶液的吸光度值，T樣品溶液的總體積（mL）V測定用樣品溶液的量(mL)，m樣品質(zhì)量（g) 3.913用1cm比色杯，當(dāng)吸光度為1.0時，試液中茶多酚的濃度為3.913(mg/mL)表 1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)匯總實(shí)驗(yàn)次數(shù)AT (mL)V (mL)m (g)（%）（mg/g)10.10425010.250040.7026.6120.22325020.250043.6338.5430.36225030.250047.2247.2240.46325040.250045.2945.295、實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢驗(yàn)繪制茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)步驟4中所得

7、的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，繪制茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，斜率R處于0.95-1.05之間方可達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。表 2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線所需數(shù)據(jù)V(mL)1.02.03.04.0A0.1040.2230.3630.463 (mg/g)40.7043.6347.2245.29圖 2 茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線（例）試驗(yàn)中，第四組偏差較大舍去。得到R2介于0.951.05，符合要求。5、 注意事項1、 磷酸鹽緩沖液在常溫下容易生長霉菌，放冰箱中保存或臨用時現(xiàn)配。2、 茶多酚溶液應(yīng)保持澄清，若溶解后溶液渾濁應(yīng)先過濾。3、 實(shí)驗(yàn)前需仔細(xì)閱讀分光光度計使用說明書及注意事項。4、 若茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率R不介于0.95-1.05之間，則實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)無效。6

8、、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析本次實(shí)驗(yàn)，所采用的測定方法主要為酒石酸亞鐵比色法。茶葉中多酚類物質(zhì)能與亞鐵離子形成紫藍(lán)色絡(luò)合物，用分光光度法測定其含量。利用比色法進(jìn)行測定，可以有效地避免由視覺產(chǎn)生的誤差，加以檢驗(yàn)后可以得到較為準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。但經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，酒石酸亞鐵比色法測定的茶多酚含量明顯偏高。下表為杭州茶葉研究院用兩種比色法測定茶葉中茶多酚含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。表 3 兩種測定方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較名稱干物率茶多酚含量（%）Folin試劑比色法酒石酸亞鐵比色法龍井95.218.933.3碧螺春92.920.626.9特級滇紅90.212.416.8凍頂烏龍96.914.419.8鐵觀音95.614.121.0普洱熟餅

9、90.36.18.8造成以上差異的原因有以下三點(diǎn)：第一，酒石酸亞鐵比色法測得的是茶葉中多酚類物質(zhì)的總含量，是亞鐵離子與多酚類物質(zhì)絡(luò)合形成藍(lán)紫色物質(zhì)，在540nm處有最大吸收。而Folin比色法測得的結(jié)果是茶葉中酚羥基被高價鎢氧化后形成藍(lán)色物質(zhì)在765nm處有最大吸收。第二，酒石酸亞鐵比色法在提取時采用沸水提取，而Folin比色法采用70%甲醇提取。第三，酒石酸亞鐵比色法采用經(jīng)驗(yàn)系數(shù)測算茶多酚的含量，而Folin比色法通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算茶多酚的含量。因此，可以得出Folin比色法在測定茶多酚含量的實(shí)驗(yàn)中測算更為準(zhǔn)確。實(shí)驗(yàn)分析1.不能用每次取等量的V(mL)所得結(jié)果求平均值的方法計算茶多酚的含量，每

10、次取等量V會有偶然性和不可控的操作失誤對實(shí)驗(yàn)的結(jié)果影響較大。相對而言等量遞加做出線性曲線的話結(jié)果的誤差要小一些。2.酒石酸亞鐵相比于其它亞鐵離子化合物而言，具有快速，簡便，重現(xiàn)性好，但結(jié)果往往偏高，真實(shí)性較低。酒石酸亞鐵絡(luò)合物相對較穩(wěn)定，也不易被氧化，酒石酸的酸性比較小，比醋酸小，所以廢液處理起來比較方便。3.茶葉研磨要充分，可以提高茶多酚的溶出速度。4.分液漏斗裝置需檢驗(yàn)氣密性后才可使用，若氣密性不好，可以涂黃凡士林。5.用乙酸乙酯萃取的時候，要進(jìn)行放氣操作，放氣不能對著人也不能對著火源。6.加入酒石酸亞鐵溶液后，容量瓶中溶液變色，由無色變?yōu)樽霞t色，說明發(fā)生了絡(luò)合反應(yīng)，形成絡(luò)合物顯色。 實(shí)驗(yàn)

11、二：茶葉中黃酮類化合物的提取和測定1、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、 了解黃酮類化合物對人體的藥理和保健作用。2、掌握茶葉中提取黃酮類化合物的方法。3、掌握測定黃酮類化合物含量的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理和應(yīng)用：黃酮類化合物泛指兩個具有酚羥基的苯環(huán)（A-與B-環(huán)）通過中央三碳原子相互連結(jié)而成的一系列化合物，其基本母核為2-苯基色原酮。黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中常連接有酚羥基、甲氧基、甲基、異戊烯基等官能團(tuán)。蘆丁是黃酮類化合物之一，且對于紫外光具有極強(qiáng)的吸收作用。天然黃酮類化合物多以苷類形式存在，一般易溶于水、乙醇、甲醇等極性強(qiáng)的溶劑中；但難溶于或不溶于苯、氯仿等有機(jī)溶劑中。實(shí)驗(yàn)首先用紫外分光光度法，利用蘆丁溶液在波長510

12、nm處具有最大吸收的特點(diǎn)，測定標(biāo)準(zhǔn)蘆丁溶液的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用無水乙醇提取茶葉中的黃酮類化合物，得到茶葉提取液。取一定量的茶葉提取液，用紫外分光光度法測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定提取液中總黃酮的含量。絕大多數(shù)的植物中都含有黃酮類化合物，掌握對茶葉中黃酮類化合物的提取和測定方法，有利于對茶葉資源的綜合利用。對茶葉中黃酮類物質(zhì)的提取、測定和純化除以上方法外，還有其他幾種常用方法：1） 大孔樹脂吸附法因?yàn)椴枞~黃酮具有糖苷鏈和多酚結(jié)構(gòu)，有一定的親水性和極性，利于弱極性和極性樹脂對其吸附。而非極性樹脂吸附黃酮的量偏小。2）微波提取法微波具有試劑用量少、加熱均勻、提取批量大、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)。以微波輻

13、射的方式可加快反應(yīng)速度。在提取黃酮類化合物上取得很好的效果。3）超聲波輔助提取法是利用超聲波具有的機(jī)械效應(yīng)，空化效應(yīng)和熱效應(yīng)，通過增大介質(zhì)分子的運(yùn)動速度、增大介質(zhì)的穿透力來提取生物有效成分。近年來越來越受到廣泛重視。超聲波提取具有節(jié)時、節(jié)能、節(jié)料、提取率高的特點(diǎn)。三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑儀器：分光光度計，電子天平，恒溫水浴鍋，真空泵，布氏漏斗，250ml容量瓶，試管。材料：茶葉粉末。試劑：無水乙醇，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，亞硝酸鈉，氫氧化鈉，硝酸鋁試劑（以上均為分析純）。4、 實(shí)驗(yàn)操作1） 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線總黃酮含量測定采用Al(NO3)3NaNO2分光光度方法，黃酮與鋁離子在堿性條件下與亞硝酸鈉形成黃酮的鋁

14、絡(luò)合物，生成穩(wěn)定的黃色。黃色的深淺與黃酮含量呈一定的比例關(guān)系，可與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品作對照，于510 nm 波長處比色定量測定。本實(shí)驗(yàn)中茶葉總黃酮含量測定的標(biāo)準(zhǔn)品為蘆丁。準(zhǔn)確稱取于115烘干至恒重的蘆丁25 mg，用70的乙醇溶解并定容至250 mL，使其濃度為100 g/mL。用70乙醇將蘆丁溶液稀釋成10種不同濃度(0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 g/mL)的溶液5 ml。分別量取不同濃度的蘆丁溶液1mL，同時加人70乙醇1 mL、5NaNO2溶液0.3 mL，混勻后靜置6 min，加入10Al(NO3)3溶液0.3 mL，混勻，靜置6 min，再加入4NaOH溶

15、液2 mL，混勻，靜置20 min，于510 nm波長處測定吸光度(A)。測得線性回歸方程。2） 提取茶葉中的黃酮類化合物稱取1g茶葉粉末于燒杯中，加入20mL70%乙醇，用保鮮膜封口，置于80恒溫水浴鍋內(nèi)1h，抽濾后得濾液。3） 量取1mL濾液，加人70乙醇1 mL、5NaNO2溶液0.3 mL，混勻后靜置6 min，加入10Al(NO3)3溶液0.3 mL，混勻，靜置6 min，再加入4 NaOH溶液2 mL，混勻，靜置20 min，于510 nm波長處測定吸光度。根據(jù)黃酮溶液的濃度與吸光度值成正比，吸光度值越大，黃酮溶液濃度越大，可測定茶葉提取液中黃酮類物質(zhì)的含量。5、 注意事項乙醇濃度

16、，樣品和乙醇溶液的固液比（g/mL），水浴溫度和水浴時間均對總黃酮的提取率和測定濃度產(chǎn)生影響。各個因素對茶葉黃酮提取得率的影響順序是：乙醇濃度>固液比>溫度>時間。所以實(shí)驗(yàn)中要嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣品準(zhǔn)確量取，以減小實(shí)驗(yàn)誤差。實(shí)驗(yàn)用到的乙醇溶液濃度較高，實(shí)驗(yàn)時間較長，乙醇溶液要注意密封保存，防止乙醇溶液揮發(fā)，濃度減小，導(dǎo)致的對實(shí)驗(yàn)的影響。6、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象：1. 蘆丁呈黃色粉末，按梯度稀釋以后加入乙醇，亞硝酸鈉，硝酸鋁并未發(fā)生變化，加入氫氧化鈉以后，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品變?yōu)槌赛S色生成了黃酮的鋁絡(luò)合物。2. 靜置20min，到510nm下測吸光度。3. 將茶葉粉加入到70

17、%乙醇，水浴1h得到草綠色溶液，內(nèi)有部分未溶物，抽濾得到墨綠色茶葉溶液。4. 得到的茶葉溶液梯度稀釋，顏色變淺得到無色或淡黃色，加入氫氧化鈉以后變?yōu)槌赛S色。本實(shí)驗(yàn)以已知的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為標(biāo)準(zhǔn)，與茶葉提取液中的黃酮含量相比較，相對測定出茶葉提取液中的黃酮含量。這需要確保蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度盡量準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)所需試劑的濃度要達(dá)到分析純，才能減小實(shí)驗(yàn)誤差。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液算得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，繪于圖1中，可利用excel得出線性方程并計算R值。試驗(yàn)次數(shù)蘆丁含量（mg/mL)吸光度A10.01-0.04020.02-0.03230.030.01640.040.05750.050.07460.060.13870.070.11380.080.14190.090.145100.100.217茶葉提取液吸光度為0.243，帶入上式：y = 2.6721x-0.0641，求得黃酮類物質(zhì)含量為0.1148* 50 = 5.75mg/mL茶葉提取液中黃酮類化合物的測定含量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，填于表1中表1 茶葉提取液中總黃酮的含量編號乙醇濃度固液