淺議甜菜堿與植物耐鹽基因工程

1、淺議甜菜堿與植物耐鹽基因工程論文導(dǎo)讀：目前影響植物生長和產(chǎn)量的最主要環(huán)境脅迫因素是鹽堿和干旱。較重要的、研究最多的是甜菜堿。基因工程，淺議甜菜堿與植物耐鹽基因工程。關(guān)鍵詞：甜菜堿，鹽，基因工程 生長在自然界中的植物在長期的進(jìn)化過程中形成了適應(yīng)環(huán)境的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能及生態(tài)特征，使植物本身與環(huán)境形成了一個相對和諧的統(tǒng)一體；另一方面，環(huán)境的變化又使植物受到逆境的影響，給植物的生長及經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量造成一定的損失。目前影響植物生長和產(chǎn)量的最主要環(huán)境脅迫因素是鹽堿和干旱。一、鹽分對植物細(xì)胞的傷害和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)鹽分對植物細(xì)胞的傷害主要是生理干旱和離子毒害。植物細(xì)胞中的原生質(zhì)膜，是一個半透性膜，它允許水

2、分自由透過，而其它物質(zhì)只能有選擇地通過。這樣就使膜內(nèi)存在的有機(jī)分子、無機(jī)離子等形成一定的滲透勢。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的滲透勢大于土壤溶液的滲透勢時植物就能吸水；如果小于土壤溶液的滲透壓時，植物就不能吸水，結(jié)果植物缺水干死。免費論文，基因工程。另一方面外界鹽離子的大量進(jìn)入，破壞了細(xì)胞中原有的離子平衡，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常代謝。過量的鹽離子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，會使原生質(zhì)凝聚、葉綠素破壞、蛋白質(zhì)合成受到抑制、蛋白質(zhì)水解作用加強，造成體內(nèi)氨基酸積累。這些氨基酸有一部分會轉(zhuǎn)化為丁二胺、戊二胺及游離氨，當(dāng)它們達(dá)到一定濃度時細(xì)胞就會中毒死亡。與此同時，植物在長期的進(jìn)化過程中也形成了一系列的適應(yīng)機(jī)制來抵御鹽脅迫的傷害，其中合成并

3、積累高濃度平衡滲透物質(zhì)以調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透勢就是一重要策略。在正常情況下，這些滲透物質(zhì)是細(xì)胞代謝的一般組成物，它們具備以下特點：分子量小，水溶性好；在生理pH范圍內(nèi)呈電中性；本身不改變酶結(jié)構(gòu)，且能維持酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定；合成酶系統(tǒng)對鹽脅迫敏感，且能在很短時間內(nèi)積累到足以降低滲透勢的水平。在這些有機(jī)溶質(zhì)中，較重要的、研究最多的是甜菜堿。二、鹽脅迫下甜菜堿對植物的保護(hù)作用甜菜堿對植物細(xì)胞的保護(hù)主要集中在滲透調(diào)節(jié)和保護(hù)酶活性方面。植物受鹽堿或水分脅迫時，為了生長和生存必須保持其膨壓。細(xì)胞質(zhì)中積累大旱有機(jī)滲透調(diào)節(jié)劑如甜菜堿，而將細(xì)胞質(zhì)中的無機(jī)滲透調(diào)節(jié)劑（主要是K離子）擠向液泡，使胞質(zhì)與細(xì)胞內(nèi)（液泡）外環(huán)境維持滲

4、透平衡，這樣就避免了細(xì)胞質(zhì)高濃度無機(jī)離子對酶和代謝的傷害。甜菜堿絕大部分存在于細(xì)胞質(zhì)中，在占植物細(xì)胞體積90%的液泡中，卻很難找到它的蹤跡。因此甜菜堿隨著鹽脅迫強度的增加在細(xì)胞質(zhì)中逐漸積累直到很高水平，從而調(diào)節(jié)滲透壓，維持細(xì)胞的水分平衡，并且對細(xì)胞沒有毒害作用。除此之外，甜菜堿還起到保護(hù)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和代謝酶類的活性，穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)的功能。對小麥?zhǔn)┯猛庠刺鸩藟A和轉(zhuǎn)BADH基因煙草的研究發(fā)現(xiàn)，甜菜堿能保護(hù)抗氧化酶系統(tǒng)如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、抗壞血酸氧化酶（AsAPOD）和谷胱甘肽還原酶（GR）等的活性，增強細(xì)胞有效排除活性氧和氧自由基的能力，保證細(xì)胞質(zhì)膜

5、和葉綠體膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和完整性。同時它還能提高呼吸過程中的酶如異檸檬酸脫氫酶（IDH）、蘋果酸脫氫酶（MDH）、琥珀酸脫氫酶（SDH）、細(xì)胞色素氧化酶（CO）和光呼吸途徑中的羥基丙酮酸還原酶（HPR）、乙醇酸氧化酶（GO）等的活性，明顯增強光呼吸過程，使植物減少或免受光抑制的破壞。免費論文，基因工程。保護(hù)葉綠體PSII顆粒，防止高鹽濃度造成的外周蛋白脫落。三、甜菜堿的生物合成途徑1、植物中的甜菜堿合成途徑植物體內(nèi)甜菜堿是在葉綠體內(nèi)通過光或激素（如ABA）誘導(dǎo)合成的。一般認(rèn)為甜菜堿的合成是以絲氨酸為原料，經(jīng)過一系列的反應(yīng)生成膽堿，再由膽堿經(jīng)甜菜堿醛通過兩步不可逆的氧化反應(yīng)生成甜菜堿。這兩步氧化反

6、應(yīng)需要兩個酶的催化：第一個是膽堿單氧化酶（choline monooxygenase，CMO），它催化膽堿氧化成甜菜堿醛(betaine aldehyde)。第二個是甜菜堿醛脫氫酶（betaine aldehydedehydrogenase，BADH，），它催化甜菜堿醛形成甜菜堿（betaine）。（1）膽堿單加氧酶（CMO）CMO是由核基因編碼并定位于葉綠體基質(zhì)中一種特殊的酶。其活性受鹽或干旱脅迫的誘導(dǎo)。由CMO催化的氧化反應(yīng)在葉綠體中進(jìn)行。Rathinasabapathi等（1997）用RT-PCR的方法從菠菜的葉片中分離出了CMO的完整cDNA。開放讀碼框（ORF）（1320bp）編碼一

7、個440個氨基酸的多肽，其中有一個60殘基的轉(zhuǎn)運肽（信號肽）。轉(zhuǎn)運肽的大小和組成是一個典型的葉綠體基質(zhì)靶向的信號肽，這與CMO定位于時綠體基質(zhì)的意見完全一致。CMO基因中包含一個很大的啟動子，重組實驗表明CMO是單拷貝基因。菠菜中的CMO基因同BADH基因類似，都有一個脅迫應(yīng)答的順式調(diào)節(jié)組件，其表達(dá)可能受到鹽脅迫的調(diào)控。（2）甜菜堿醛脫氫酶（BADH）與CMO基因的研究相比，BADH基因的研究則要深入得多。從不同植物中克隆出來的BADH基因全長稍有差異，其長度一般為1.51.8kb，包含一個1.5kb開放閱讀框。BADH基因在整個植物基因組中一般至少有兩個拷貝。目前為止,BADH基因已從大腸桿

8、菌、菠菜、山菠菜、大麥、高粱、水稻、等中得到克隆和鑒定,不同生物的BADH基因有較高的同源性。BADH是由單一核基因編碼的多肽二聚體（Mr6064kD），幾乎所有植物的BADH酶中都有一個高度保守的十肽區(qū)域，即VTLELGGKSP，這段序列可能與NAD的結(jié)合并與催化反應(yīng)的位點有關(guān)（Ishitani等，1995）。免費論文，基因工程。但是不同物種間BADH的氨基酸序列差異很大。免費論文，基因工程。免費論文，基因工程。2、微生物中的甜菜堿合成途徑（1）單酶催化合成途徑在原核生物土壤細(xì)菌(Arthrobacterglobiformis)中甜菜堿合成關(guān)鍵基因是CodA，該基因編碼膽堿氧化酶（COD）。

9、這個酶能獨立催化膽堿生成甘氨酸甜菜堿的兩步反應(yīng)，即兼具膽堿單氧化酶和甜菜堿醛脫氫酶的催化功能。（2）雙酶催化合成途徑大腸桿菌中甜菜堿合成途徑膽堿脫氫酶（CDH），在氧的參與下催化膽堿生成甜菜堿醛。而催化甜菜堿醛生成甜菜堿的酶同植物中一樣，均為BADH。3、甜菜堿的甘氨酸合成途徑通過甘氨酸合成甜菜堿的途徑只是在最近才被發(fā)現(xiàn)。到目前為止，只在兩個極端耐鹽的海洋微生物中Ectothiorhodospirahalochloris 和 Actinopolysporahalophilia存在。在這些微生物中，甜菜堿由甘氨酸通過由S-腺苷四甲硫氨酸依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶GSMT和SDMT的三次N-甲基化作用催化合

10、成。從目前已轉(zhuǎn)化成功的甜菜堿基因工程植株來看，盡管在它們體內(nèi)都檢測到了甜菜堿的積累并在脅迫下具有顯著的保護(hù)作用，但沒有一種轉(zhuǎn)基因植物的甜菜堿含量能超過1mol/g FW ，這個水平比起許多能夠自身合成并積累甜菜堿的物種來要低10100倍（Rhodes和Hanson，1993）。通過對轉(zhuǎn)CMO基因煙草仔細(xì)研究后發(fā)現(xiàn)，無論是導(dǎo)入的甜菜堿代謝途徑還是甜菜堿醛的毒性，均未對甜菜堿在轉(zhuǎn)基因植株中的最終積累造成影響，而在施加外源膽堿后，卻發(fā)現(xiàn)甜菜堿的含量大幅度增加。免費論文，基因工程。由此可知，是內(nèi)源膽堿這一原料的供應(yīng)不足限制了轉(zhuǎn)基因植株中甜菜堿的最終含量。因此，通過甜菜堿基因工程來改善植物的耐鹽性是有一定限度的，總之，