ELISA原理方法及操作細(xì)節(jié)

1、elisaelisa酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)導(dǎo)導(dǎo) 師：馬學(xué)恩師：馬學(xué)恩 教教 授授elisaelisa（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）enzymes linked immunosorbent assay簡(jiǎn)簡(jiǎn) 介介19711971年，瑞典學(xué)者年，瑞典學(xué)者engvailengvail和和perlmannperlmann、荷蘭學(xué)者、荷蘭學(xué)者van schuursvan schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。附試驗(yàn)。elisa elisa 就是將抗原和

2、抗體的免疫反應(yīng)和酶的催化反就是將抗原和抗體的免疫反應(yīng)和酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新技術(shù)。應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新技術(shù)。該技術(shù)應(yīng)用非常廣泛，幾乎所有的可溶性抗原該技術(shù)應(yīng)用非常廣泛，幾乎所有的可溶性抗原- -抗抗體系統(tǒng)均可用以檢測(cè)。體系統(tǒng)均可用以檢測(cè)。酶和抗體或抗原結(jié)合后，既不改變抗體與抗原酶和抗體或抗原結(jié)合后，既不改變抗體與抗原免疫學(xué)反應(yīng)的特異性，也不影響酶本身的酶學(xué)免疫學(xué)反應(yīng)的特異性，也不影響酶本身的酶學(xué)活性，即在相應(yīng)而合適的作用底物參與下，使活性，即在相應(yīng)而合適的作用底物參與下，使基質(zhì)水解而呈色，或使供氫體由無色的還原型基質(zhì)水解而呈色，或使供氫體由無色的還原型變?yōu)橛猩难趸?。這種有色產(chǎn)物

3、可用肉眼、變?yōu)橛猩难趸?。這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察，也可用分光光光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察，也可用分光光度計(jì)加以測(cè)定。呈色反應(yīng)顯示了酶的存在，從度計(jì)加以測(cè)定。呈色反應(yīng)顯示了酶的存在，從而證明發(fā)生了相應(yīng)的免疫反應(yīng)。而證明發(fā)生了相應(yīng)的免疫反應(yīng)。所以，這是一種特異而敏感的技術(shù)，可以在細(xì)所以，這是一種特異而敏感的技術(shù)，可以在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克，甚至納米水平上對(duì)其進(jìn)行定量?；蛟谖⒖耍踔良{米水平上對(duì)其進(jìn)行定量。基基 本本 原原 理理l先將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相載體上，先將已知的抗體或抗原結(jié)合在某

4、種固相載體上，并保持其免疫活性并保持其免疫活性。l測(cè)定時(shí)，將待檢樣本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步測(cè)定時(shí)，將待檢樣本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)。驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)。l用洗滌的方法分離抗原用洗滌的方法分離抗原-抗體復(fù)合物和游離成分?？贵w復(fù)合物和游離成分。l 然后加入酶的作用底物催化顯色，進(jìn)行定性或定然后加入酶的作用底物催化顯色，進(jìn)行定性或定量。量。方方 法法 類類 型型酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的主要技術(shù)類酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的主要技術(shù)類型有雙抗體夾心法、間接法、競(jìng)型有雙抗體夾心法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法、捕獲法等。爭(zhēng)法、捕獲法等。1 1，雙抗體夾心法：，雙抗體夾

5、心法：此法常用于檢測(cè)抗原此法常用于檢測(cè)抗原它是利用待測(cè)抗原上的兩個(gè)抗原決定簇它是利用待測(cè)抗原上的兩個(gè)抗原決定簇a和和b分別與固相載體上的抗體分別與固相載體上的抗體a和酶標(biāo)記抗體和酶標(biāo)記抗體b結(jié)結(jié)合，形成合，形成抗體抗體a-待測(cè)抗原待測(cè)抗原-酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體b復(fù)合物復(fù)合物，復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗原含量成正比，屬非復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗原含量成正比，屬非競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)類型。競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)類型?？箍?體體 a a待測(cè)抗原待測(cè)抗原酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體包被物包被物2 2，間接法測(cè)定抗體，間接法測(cè)定抗體此法常用于測(cè)定抗體此法常用于測(cè)定抗體將已知抗原連接在固相載體上，待測(cè)抗體與將已知抗原連接在固相載體上，待測(cè)抗體與抗原

6、結(jié)合后再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，形成抗原結(jié)合后再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，形成抗原抗原-待待測(cè)抗體測(cè)抗體-酶標(biāo)二抗的復(fù)合物酶標(biāo)二抗的復(fù)合物，復(fù)合物的形成量，復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗體量成正比，屬非競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)類型。與待測(cè)抗體量成正比，屬非競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)類型?？箍?原原待測(cè)抗體待測(cè)抗體酶標(biāo)二抗酶標(biāo)二抗包被物包被物3 3，競(jìng)，競(jìng) 爭(zhēng)爭(zhēng) 法法此法既可用于檢測(cè)抗原和半抗原，此法既可用于檢測(cè)抗原和半抗原，也可以用于檢測(cè)抗體也可以用于檢測(cè)抗體用酶標(biāo)抗原（抗體）與待測(cè)的非標(biāo)記抗原用酶標(biāo)抗原（抗體）與待測(cè)的非標(biāo)記抗原（抗體）競(jìng)爭(zhēng)性的與固相載體上的限量抗體（抗體）競(jìng)爭(zhēng)性的與固相載體上的限量抗體（抗原）結(jié)合，待測(cè)抗原（抗體）多，則形（抗原

7、）結(jié)合，待測(cè)抗原（抗體）多，則形成非標(biāo)記復(fù)合物多，酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合就成非標(biāo)記復(fù)合物多，酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合就少，也就是酶標(biāo)記復(fù)合物少，因此，顯色程少，也就是酶標(biāo)記復(fù)合物少，因此，顯色程度與待測(cè)物含量成反比。度與待測(cè)物含量成反比。限量的的抗體限量的的抗體酶標(biāo)抗原酶標(biāo)抗原 樣品抗原樣品抗原酶標(biāo)多于樣品酶標(biāo)多于樣品顯色程度深顯色程度深樣品多于酶標(biāo)樣品多于酶標(biāo)顯色程度淺顯色程度淺顯色程度與待測(cè)物含量成反比顯色程度與待測(cè)物含量成反比包被物包被物4 4，捕獲法（反向間接法），捕獲法（反向間接法）主要用于測(cè)定血清中某種抗體亞成分主要用于測(cè)定血清中某種抗體亞成分以目前最常用的以目前最常用的igm測(cè)定為例，因血

8、清中針對(duì)測(cè)定為例，因血清中針對(duì)某種抗原的特異性某種抗原的特異性igm和和igg同時(shí)存在，而后者同時(shí)存在，而后者可干擾可干擾igm的測(cè)定。因此，先針對(duì)的測(cè)定。因此，先針對(duì)igm的第二抗的第二抗體體(如羊抗人如羊抗人igm鏈抗體）連接于固相載體，用鏈抗體）連接于固相載體，用以以“捕獲捕獲”樣品中所有樣品中所有igm；洗滌除去；洗滌除去igg等無等無關(guān)物質(zhì)，然后加入特異性抗原與待測(cè)關(guān)物質(zhì)，然后加入特異性抗原與待測(cè)igm結(jié)合；結(jié)合；再次加入抗原特異的酶標(biāo)抗體；最后形成固相再次加入抗原特異的酶標(biāo)抗體；最后形成固相二抗二抗-igm-抗原抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加酶底物顯酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加酶底物顯色后，即可對(duì)

9、待色后，即可對(duì)待igm進(jìn)行定性和定量測(cè)定。進(jìn)行定性和定量測(cè)定。針對(duì)針對(duì)igm的第二抗體的第二抗體待測(cè)物待測(cè)物 其中含有其中含有igm和和igg特異性抗原與特異性抗原與igm結(jié)合結(jié)合酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體包被物包被物iggigg等無關(guān)物質(zhì)等無關(guān)物質(zhì)被洗脫被洗脫具具 體體 步步 驟驟l 包被包被l 封閉封閉l 加待測(cè)物加待測(cè)物l 加一抗，二抗加一抗，二抗 ，或抗原等，或抗原等l 顯色顯色包包 被被l 用包被液稀釋包被抗體至合適濃度，包被酶用包被液稀釋包被抗體至合適濃度，包被酶聯(lián)板（聚乙烯微量反應(yīng)板），每孔聯(lián)板（聚乙烯微量反應(yīng)板），每孔100。l用保鮮膜包好用保鮮膜包好 ，4過夜。過夜。 如急用，包被如急

10、用，包被2h后，清洗也可用，但最好后，清洗也可用，但最好 過夜。過夜。l 次日棄去孔內(nèi)溶液，并在面巾紙上拍干。次日棄去孔內(nèi)溶液，并在面巾紙上拍干。l 用用pbst洗液，洗洗液，洗45次。次。 每次在洗板機(jī)清洗酶聯(lián)板上震蕩每次在洗板機(jī)清洗酶聯(lián)板上震蕩23min后，后，在面巾紙上拍干后進(jìn)行下一次清洗或下一步。在面巾紙上拍干后進(jìn)行下一次清洗或下一步。包包 被被 液液0.05m ph 9.6 磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液na2 2co3 3 1.59 g ；nahco3 3 2.93g ； 加蒸餾水至加蒸餾水至1000mlpbst 洗洗 液液2000ml pbs + 1ml tween-20pbs：nac

11、l 8g ； kcl 0.2g ；na2 2hpo4 4 1.42g；kh2 2po4 4 0.27g；加加1000ml蒸餾水定容，調(diào)蒸餾水定容，調(diào)ph至至7.4洗洗 板板 機(jī)機(jī)封封 閉閉l用封閉液封閉，每孔用封閉液封閉，每孔100。 室溫下，在微量振蕩器上，封閉室溫下，在微量振蕩器上，封閉2h。l棄去孔內(nèi)溶液，并在面巾紙上拍干。棄去孔內(nèi)溶液，并在面巾紙上拍干。l 用用pbst洗液，洗洗液，洗45次。（同包被）次。（同包被）l 用保鮮膜包好，用保鮮膜包好，4可保存一個(gè)月?？杀４嬉粋€(gè)月。封封 閉閉 液液l 10 % 10 % 小牛血清小牛血清 （1ml1ml小牛血清加到小牛血清加到9ml 19m

12、l 1pbspbs中混勻）。中混勻）。l 5%5%脫脂奶粉（用洗液稀釋）脫脂奶粉（用洗液稀釋）加標(biāo)準(zhǔn)樣及樣品加標(biāo)準(zhǔn)樣及樣品l 待測(cè)樣或標(biāo)準(zhǔn)一抗：待測(cè)樣或標(biāo)準(zhǔn)一抗： 用用pbst洗液進(jìn)行稀釋到適合濃度，每孔洗液進(jìn)行稀釋到適合濃度，每孔100l，包好保鮮膜。室溫下，在微量振蕩器，包好保鮮膜。室溫下，在微量振蕩器上孵育上孵育2小時(shí)。清洗。小時(shí)。清洗。l 二抗：二抗： 用用pbst洗液進(jìn)行稀釋到適合濃度，每孔洗液進(jìn)行稀釋到適合濃度，每孔100l，包好保鮮膜。室溫下，在微量振蕩器，包好保鮮膜。室溫下，在微量振蕩器上孵育上孵育1小時(shí)。清洗。小時(shí)。清洗。注注 意意l 抗體抗原反應(yīng)比較快，一般抗體抗原反應(yīng)比較

13、快，一般1212個(gè)小時(shí)就個(gè)小時(shí)就達(dá)到峰值。延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間容易出現(xiàn)非特異達(dá)到峰值。延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間容易出現(xiàn)非特異結(jié)合，但反應(yīng)時(shí)間不能少于結(jié)合，但反應(yīng)時(shí)間不能少于1.51.5小時(shí)。小時(shí)。l 二抗的使用濃度（一般，二抗的使用濃度（一般，1 1：1000010000稀釋）稀釋）應(yīng)當(dāng)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，二抗的反應(yīng)時(shí)間不應(yīng)當(dāng)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，二抗的反應(yīng)時(shí)間不能過長(zhǎng)，容易出現(xiàn)非特異反應(yīng)。一般，反能過長(zhǎng)，容易出現(xiàn)非特異反應(yīng)。一般，反應(yīng)應(yīng)40604060分即可。分即可。opd opd 顯顯 色色l臨用前取臨用前取a a液液5.14ml5.14ml，b b液液 4.86ml4.86ml加入加入opd (opd (鄰苯二胺，在

14、鄰苯二胺，在-20-20中保存）中保存）0.0040g0.0040g（約（約4 4小片），溶解后加入小片），溶解后加入50l50l的的30%h30%h2 2oo2 2，配成顯色液。（，配成顯色液。（opdopd要充分混要充分混勻，否則容易出現(xiàn)個(gè)別孔顏色太深）勻，否則容易出現(xiàn)個(gè)別孔顏色太深）l 顯色液每孔顯色液每孔100l100l。避光顯色。避光顯色1520min1520min。l 用用2mol2moll hl h2 2soso4 4終止反應(yīng)，每孔終止反應(yīng)，每孔50l50l顯顯 色色 液液l a液：液：0.2mol l na2hpo4 na2hpo412h2o 71.7g加水至加水至1000ml

15、l b液：液：0.1 mol l 檸檬酸檸檬酸 檸檬酸檸檬酸 19.2g 檸檬酸，加水至檸檬酸，加水至1000ml結(jié)結(jié) 果果 判判 定定酶標(biāo)測(cè)定儀檢測(cè)（酶標(biāo)測(cè)定儀檢測(cè)（429nm429nm），），測(cè)定測(cè)定odod值：值：待測(cè)孔（待測(cè)孔（p p）與對(duì)照孔（）與對(duì)照孔（nn）的比值（）的比值（p p：nn）大于）大于1.51.5或或2 2者為陽性者為陽性注意：要有陰性，陽性對(duì)照注意：要有陰性，陽性對(duì)照。應(yīng)應(yīng) 用用elisa elisa 法由于測(cè)定靈敏、特異、操作簡(jiǎn)便、法由于測(cè)定靈敏、特異、操作簡(jiǎn)便、酶標(biāo)記試劑比較穩(wěn)定、易于自動(dòng)化、無反酶標(biāo)記試劑比較穩(wěn)定、易于自動(dòng)化、無反射性污染，且易與其他相關(guān)技術(shù)偶聯(lián)，使射性污染，且易與其他相關(guān)技術(shù)偶聯(lián)，使其成為目前應(yīng)用最廣泛而且發(fā)展最快的一其成為目前應(yīng)用最廣泛而且發(fā)展最快的一種免疫測(cè)定技術(shù)。市場(chǎng)上符合質(zhì)量要求的種免疫測(cè)定技術(shù)。市場(chǎng)上符合質(zhì)量要求的商品試劑盒（提供有包裝好的固相載體、商品試劑盒（提供有包裝好的固相載體、酶標(biāo)記物及其底物和洗滌液等全套試劑成酶標(biāo)記物及其底物和洗滌液等全套試劑成分）和自動(dòng)或半自動(dòng)檢測(cè)儀不斷研究發(fā)明分）和自動(dòng)或半自動(dòng)檢測(cè)儀不斷研