植病研究法---植物線蟲病害研究技術(shù)

1、植物線蟲病害研究技術(shù) 主講人：主講人：吳彩蘭吳彩蘭植物線蟲病害研究技術(shù)v第一節(jié) 植物寄生線蟲的采集v第二節(jié) 線蟲的分離v第三節(jié) 線蟲玻片標(biāo)本的制作v第四節(jié) 線蟲的培養(yǎng)v第五節(jié) 線蟲的接種第一節(jié) 植物寄生線蟲的采集 1.1.線蟲病的癥狀線蟲病的癥狀 植物受到線蟲為害后，可以表現(xiàn)各種癥狀。有的表現(xiàn)為癭瘤、葉斑、植物受到線蟲為害后，可以表現(xiàn)各種癥狀。有的表現(xiàn)為癭瘤、葉斑、壞死或整株枯死等，通?？梢栽诓∽儾课徽业讲≡€蟲。但是多數(shù)線蟲壞死或整株枯死等，通常可以在病變部位找到病原線蟲。但是多數(shù)線蟲病表現(xiàn)為變色、褪綠、黃化、矮縮和蔫萎等癥狀，這多半是根部受害造病表現(xiàn)為變色、褪綠、黃化、矮縮和蔫萎等癥狀，這

2、多半是根部受害造成的。成的。大多數(shù)病原線蟲并不在地上部，往往在根部或根際的土壤中可以大多數(shù)病原線蟲并不在地上部，往往在根部或根際的土壤中可以找到。找到。后一種類型的線蟲病，在施肥或采取其他措施以后，植株的長勢后一種類型的線蟲病，在施肥或采取其他措施以后，植株的長勢可以暫時(shí)恢復(fù)，但不久又表現(xiàn)出原來的受害狀。這類線蟲病的危害性往可以暫時(shí)恢復(fù)，但不久又表現(xiàn)出原來的受害狀。這類線蟲病的危害性往往容易忽視。往容易忽視。v植物的腐爛組織中，尤其是地下部分的器官，也常常發(fā)現(xiàn)有線蟲，這就要注意區(qū)別是腐生線蟲還是寄生線蟲。腐生性線蟲的主要特征是在水中十分活躍，口腔內(nèi)沒有吻針，食道多為雙胃型或小桿型，尾部很長，多

3、為絲狀。植物寄生線蟲通常都有發(fā)達(dá)的口針，尾部較短、尖削或鈍圓。v各屬線蟲的為害狀不同：（1）莖線蟲（Ditylenchus）主要為害植物的地下莖，如塊莖、鱗莖和塊根等；（2）胞囊線蟲（Heterodera）多寄生在植物根部支根或須根的側(cè)面，蟲體裸露；（3）根結(jié)線蟲（Meloidogyne）在新生的支根或側(cè)根上寄生后引起根結(jié)，蟲體在瘤狀組織中；粒線蟲(Anguina）和滑刃線蟲（Aphelenchoides）主要為害植物的地上部分，蟲體則常在莖桿的生長點(diǎn)或穗部；可以傳染植物病毒病的長針線蟲（Longidorus )、劍線蟲（Xiphinema)和毛刺線蟲（Trichodorus）等，在根部外寄生

4、，在土中十分活躍，蟲體較大，而且都有發(fā)達(dá)的口針。傘滑刃線蟲（Bursapheleuchus）中的松材線蟲主要為害松樹枝干的木質(zhì)部。 2. 2. 標(biāo)本的采集標(biāo)本的采集 （1）病變組織的采集 植物受線蟲為害后，發(fā)生明顯病變的部位，往往也是病原線蟲存在的部位。例如，小麥粒線蟲（Anguina tritici）在籽粒蟲癭中，水稻干尖線蟲（Aphelenchoides besseyi ）在穗部籽粒穎殼的內(nèi)側(cè)，根結(jié)線蟲和胞囊線蟲等都在根部，莖線蟲則多在地下莖部。只要采集病變的組織器官，就能得到病原線蟲。 （2 2）病根、根際土壤和大田土樣的采集）病根、根際土壤和大田土樣的采集 對于在根部內(nèi)寄生的線蟲，采取

5、根樣是很重要的；而對于在根部外營寄生生活的線蟲，則土樣尤為重要。由于線蟲世代的交替與重疊，內(nèi)寄生線蟲也有一段時(shí)期生活在土壤中，外寄生線蟲在某一時(shí)期則在根部取食寄生，因此取樣時(shí)應(yīng)把根系和根際土壤一起采集。 絕大多數(shù)線蟲分布在耕作層中，所以都是在0-20cm的土層中采集土樣。采集土樣最好在濕潤的土壤中采，過于干燥和潮濕的土壤，其中線蟲的存活率低。因此，土樣的采集最好是用特殊的采樣器，有的是半筒狀的，長20- 30cm，寬20-25mm。 （3）樣本的保存 采到的標(biāo)本或土樣要防止干燥，寫好標(biāo)簽后隨即放在聚乙采到的標(biāo)本或土樣要防止干燥，寫好標(biāo)簽后隨即放在聚乙烯薄膜袋中。不要用有色的或有氣味的薄膜口袋，

6、袋口要用烯薄膜袋中。不要用有色的或有氣味的薄膜口袋，袋口要用橡皮筋扎緊。橡皮筋扎緊。根系或土壤樣本，放在冰箱中（根系或土壤樣本，放在冰箱中（4)4)，可保存，可保存一定時(shí)期而不致?lián)p壞。一定時(shí)期而不致?lián)p壞。一般都在一般都在5-105-10溫度下貯存。貯藏最溫度下貯存。貯藏最適宜的溫度對各種線蟲是不同的，在適宜的溫度對各種線蟲是不同的，在5-205-20之間，但之間，但1313時(shí)時(shí)多數(shù)線蟲都是能活動的。多數(shù)線蟲都是能活動的。第二節(jié) 線蟲的分離 1 1植物材料中線蟲的分離植物材料中線蟲的分離 （1）直接觀察分離法）直接觀察分離法 胞囊線蟲、根結(jié)線蟲等根部寄生的線蟲，可在解剖鏡下用挑針直接挑取蟲體觀察

7、。對于一些蟲體較大的線蟲，如莖線蟲和粒線蟲等，可在解剖鏡下用尖細(xì)的竹針或毛針將線蟲從病組織中挑出，放在凹穴玻片上的水滴中，作進(jìn)一步的觀察和處理。 （2）漏斗分離法 漏斗分離（Baermann）操作簡便，是目前從植物材料中分離線蟲比較好的方法。將帶有線蟲的植物組織浸在水中，短時(shí)間內(nèi)在水中檢查不到線蟲；必須經(jīng)過較長的時(shí)間，線蟲離開組織而游離到水中，才能從水中收集到線蟲。漏斗分離法是使游離到水中的線蟲，沉集在漏斗的底部。它的裝置是將玻璃漏斗（直徑為10-15cm），架在鐵架上，下面接一段（10cm左右）橡皮管，橡皮管上裝一個(gè)彈簧夾。v植物材料切碎后用紗布包好，放在盛滿清水的漏斗中。經(jīng)過4-24h，由

8、于趨水性和本身的重量，線蟲就離開植物組織，并在水中游動，最后都沉降到漏斗底部的橡皮管中。打開彈簧夾，取底部約5ml的水樣，其中含有樣本中大部分活動的線蟲。 v漏斗分離法也適用于分離土壤中的線蟲。方法是在漏斗的篩網(wǎng)上放一層細(xì)紗布或多孔疏松的紙（如市售雪花牌衛(wèi)生紙），上面加一薄層土壤樣本，加水后放置過夜。這種方法適用于分離活動性較大的線蟲，如莖線蟲、短體線蟲（Pratylenchus）以及根結(jié)線蟲和胞囊線蟲的2齡幼蟲。如果溫度和時(shí)間控制得好，線蟲的回收率比較穩(wěn)定。（3）培育分離法 直接用漏斗分離法不容易分離到的線蟲，可先將根部的土粒輕輕洗去，立即放在螺旋蓋的玻瓶中，加清水幾毫升，蓋不要旋緊，在室溫

9、下（20-25）放3-5d，再加50m1的清水，蓋緊并輕輕振蕩，順序用20-40目、200-250目、325目的網(wǎng)篩，輕輕地用清水沖洗，直接觀察后兩個(gè)篩上殘留物中的線蟲。或者將殘留物取出，再經(jīng)過漏斗法分離。瓶內(nèi)的根還可加水繼續(xù)培育，根據(jù)不同植物材料在5d到4周內(nèi)可不斷分離到線蟲。細(xì)菌和真菌的污染，是長期培育中存在的問題。 （4）組織搗碎分離法 取根組織約5g左右，切成1-2cm長的小段，加水80-100ml，用組織搗碎機(jī)高速處理20s。處理的時(shí)間和速度，根據(jù)不同的材料，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)決定。將搗碎液順序通過20-40目、200-250目、325目的網(wǎng)篩，用清水輕輕沖洗，直接觀察后兩個(gè)篩上殘留物中的線蟲

10、，或者將殘留物取出，再用漏斗法分離。短體線蟲和穿刺線蟲的幼蟲和成蟲，用這種方法分離不致被損傷，但根結(jié)線蟲的雌蟲則大都被搗碎。 2. 土樣中線蟲的分離 土壤線蟲的分離，除去漏斗分離法外，一般都是用不同孔徑的網(wǎng)篩，將線蟲篩選出來。土壤線蟲的各種分離法的設(shè)計(jì)，是根據(jù)線蟲的體形細(xì)長、有活動能力、趨水性和蟲體有一定的重量等性狀，但幾乎所有的方法都要經(jīng)過過篩這一步。 (1) 直接過篩法 過篩線蟲的篩子一套有7個(gè)，其網(wǎng)目數(shù)分別為16 (20)，25，50，100，160 (200)，250和325 (400)。過篩時(shí)不是每次都要用整套的篩子，最常用的是20目、100目、200目和325目的4個(gè)。 篩網(wǎng)多為黃

11、銅絲或磷青銅絲的，也可以用尼龍絲網(wǎng)。篩子的直徑是10-28cm。分離時(shí)先將土樣充分混和均勻，取250g放在小鋁桶或塑料桶內(nèi)。加水約700-1000ml,用力攪動使土塊分散，沉降10s后，將上面的懸浮液通過20網(wǎng)目的篩子倒在第二個(gè)小桶內(nèi)。網(wǎng)篩上的殘余物和第一個(gè)桶底的泥砂用水沖洗后棄去。 按照上述步驟，順序用100，200和325網(wǎng)目的網(wǎng)篩處理后，3個(gè)篩上的殘余物分別洗在3個(gè)容量約250m1的燒杯中，然后取樣檢查和記數(shù)。用325網(wǎng)目篩子過篩時(shí)，要盡量洗去細(xì)小的粘土顆粒，但注意不要把線蟲沖掉。（2）線蟲濾紙分離法 這種方法適用于分離土樣中活動能力強(qiáng)和趨水性強(qiáng)的線蟲，尤其是一些大型的線蟲，如劍線蟲、毛

12、刺線蟲和長針線蟲等；對活動能力很差的或不活動的線蟲是不適用的。線蟲濾紙是特制的，其成分是棉花和人造纖維的混合物，浸水后膨脹，質(zhì)地疏松并有較大的孔隙，線蟲可以穿過濾紙，而泥砂顆粒則阻留在紙上。 取土樣約50g，放在第一個(gè)搪瓷杯中，加水500m1浸泡，攪拌15min，靜置l0s，將上層懸浮液倒在第二個(gè)搪瓷杯中。土樣中再加水500ml，再次攪拌并靜置后，將上層懸浮液也倒在第二個(gè)杯中。將鋪有線蟲濾紙的小篩放在淺盤中，然后將攪拌并靜置10s后的懸浮液倒在小篩中。為了防止倒懸浮液時(shí)沖破濾紙，濾紙上可放表面皿，使水向四周慢慢溢出流到濾紙上。懸浮液倒完后，用清水仔細(xì)沖洗濾紙，待渾水全部濾出后，取出小篩，放在稍

13、大一些的篩中，然后放在盛有清水的淺盤中，水的深度以剛好浸沒濾紙為度。淺盤放在冷涼處過夜，第二天取出篩子，線蟲則留在水中，將水用吸管吸在培養(yǎng)皿或計(jì)數(shù)皿中觀察。為了防止細(xì)菌或霉菌的生長，水中可加少量的殺菌劑，如0.05的鏈霉素或乙氧基乙基氯化汞溶液。 （3）沉降分離法 沉降分離法（Seinhorst方法）的設(shè)備很簡單，只要容量1L的三角瓶和燒杯各2個(gè)。這種方法回收線蟲的效率較高，一般可達(dá)75以上。 （4）漂浮淘析法 （5）漂浮分離法 v3分離到的線蟲的活體檢查v一般光學(xué)顯微鏡可以觀察線蟲的一般形態(tài)和結(jié)構(gòu)，但是為了檢查較微細(xì)的結(jié)構(gòu)特征，可以用相差顯微鏡和干涉顯微鏡，使結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出明顯的差別，可以看得更

14、清楚一些。v活體鏡檢有其優(yōu)點(diǎn)，容易看清線蟲中某些結(jié)構(gòu)。若用麻醉劑處理使其停止活動，更有利于觀察。疊氮化鈉（(sodium azide)的0.01mol/L溶液對許多線蟲是非常有效的，處理后幾分鐘內(nèi)即停止活動，用清水洗后1h左右即恢復(fù)活動。二氧化碳是麻醉蚜蟲常用的方法，也適用于線蟲。方法是將線蟲放在玻片的水滴中，邊上放一些干冰，再用燒杯覆蓋。比較簡單的方法是在50ml水中加2滴二氯乙醚，也有加氯仿的。為了使線蟲的口針伸出便于觀察，可用稀釋的氨水（0.30.4mol /L )，二三滴加在有凹陷的載玻片上，將要觀察的線蟲挑入水滴中，1-2min后，口針即伸出，必要時(shí)還可加滴氨水。但口針的伸出是暫時(shí)的

15、，為便于進(jìn)一步制片或進(jìn)行掃描電鏡觀察，可以立即用碘液殺死線蟲。第五節(jié) 線蟲的接種v為了證明一種線蟲的致病性，必須通過接種實(shí)驗(yàn)。各種類型線蟲病的接種方法不同，同時(shí)如要證明線蟲能傳染其他病害，還要與其他病原生物混合接種。v1、線蟲的單獨(dú)接種v（1） 帶蟲材料的混播混栽法v由種苗傳播的線蟲病，一般可采用帶蟲材料混播混栽的方法接種。如小麥粒線蟲的接種，是將蟲癭與麥種混播；甘薯或馬鈴薯莖線蟲，可用混插混栽接種。v胞囊或根結(jié)線蟲的接種，可采用大田混播法，也可在溫室或溫床中接種。方法是先在床底鋪好濕砂，厚約20cm，砂中混有20的線蟲胞囊；在播種溝內(nèi)也填上線蟲和濕砂的混合物，厚約lcm。播種后蓋以細(xì)砂或木屑，保溫保濕，植株生長過程中就被胞囊或根結(jié)線蟲侵染。（2）噴霧接種法 為害幼芽或葉片的線蟲，可以將線蟲懸浮液用滴注或噴霧的方法接種。（3）傷口接種法 在健組織上鉆幾個(gè)小孔，將帶有線蟲的材料埋在孔中，或者用培養(yǎng)的線蟲懸浮液灌注或注射到孔內(nèi)。傷口用脫脂棉保濕，也可用熔化的蠟或原來鉆