實(shí)驗(yàn)四酶聯(lián)免疫法測(cè)定食品中黃曲霉毒素

1、實(shí)驗(yàn)四 酶聯(lián)免疫法測(cè)定食品中黃曲霉毒素一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私鈋lisa的基本原理，及其優(yōu)缺點(diǎn)； 掌握間接elisa法的試驗(yàn)操作過程。二、實(shí)驗(yàn)原理酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，簡(jiǎn)稱elisa）是免疫酶技術(shù)的一種。本方法測(cè)定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)，微孔板包被有針對(duì)黃曲霉毒素b1（aflatoxin b1，afb1）的特異性單克隆抗體，加入黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品溶液）及黃曲霉毒素b1 酶標(biāo)記物，標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品溶液）中的游離黃曲霉毒素b1 與黃曲霉毒素b1酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)黃曲霉毒素b1 抗體，沒有連接抗體的酶標(biāo)記物在洗滌步驟中被除去。將基質(zhì)/發(fā)色劑加入到孔

2、中并且孵育，結(jié)合的酶標(biāo)記物將基質(zhì)/發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物，加入反應(yīng)停止液后使顏色由藍(lán)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，在450nm 處測(cè)量，吸收光強(qiáng)度與樣品中黃曲霉毒素b1的濃度呈負(fù)相關(guān)。三、實(shí)驗(yàn)器材1、elisa試劑盒其組成如下：1.1 包被抗體的反應(yīng)板 48孔1.2 a試劑：樣品稀釋液 l瓶1.3 b試劑：afb1標(biāo)準(zhǔn)溶液 l套(0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2 ng/ml)1.4 c試劑：酶標(biāo)抗原 l瓶1.5 d試劑：酶標(biāo)抗原稀釋液 l瓶1.6 e試劑：濃縮洗滌液 l瓶1.7 f試劑：顯色底物液a l瓶1.8 g試劑：顯色底物液b l瓶1.9 h試劑：終止液 l瓶1.10 反應(yīng)板框架 l塊2、儀

3、器1.1 酶標(biāo)儀(內(nèi)置450nm濾光片)1.2 50µl微量移液器及配套吸頭1.3 恒溫培養(yǎng)箱(0-50)1.4 冰箱(4-8)1.5 感量0.0lg的天平1.6 調(diào)速振蕩器或超聲波清洗器1.7 離心機(jī)5000r/min1.7 玻璃器皿：具塞錐形瓶，燒杯，分液漏斗，普通漏斗，量筒，具塞試管，滴管，移液管等1.8 小型粉碎機(jī)或碾缽1.9 其它：濾紙，吸水紙等四、實(shí)驗(yàn)步驟1、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備1.1 樣品處理：詳見試劑盒說明書所列“樣品處理方法”及“黃曲霉毒素國(guó)家允許量標(biāo)準(zhǔn)及樣品稀釋表” 1.1.1 脂肪含量小的固體樣品(如大米、玉米、小米等) 稱取5.0g樣品(已粉碎)于100ml具塞三角瓶中，

4、準(zhǔn)確加入25.00ml甲醇水(1+1)溶液，于振蕩器上劇烈震蕩15min，過濾，棄去l/4初濾液，收集試樣濾液，此液為樣品提取液。根據(jù)樣品的國(guó)家允許量標(biāo)準(zhǔn)，用a試劑(樣品稀釋液)將樣品提取液進(jìn)行適當(dāng)稀釋（如100µl樣品提取液+100µl樣品稀釋液，總稀釋10倍），即為待測(cè)樣液。1.1.2 花生 樣品去皮粉碎(刀切或剪切)，稱取5.0g于100ml具塞三角瓶中。加入25.0ml甲醇水(1+1)溶液和20ml正已烷(或石油醚)，于振蕩器上劇烈震蕩l0min，過濾于分液漏斗中，靜置分層，放出下層甲醇水提取液，此液為樣品提取液，根據(jù)樣品的國(guó)家允許量標(biāo)準(zhǔn)，用a試劑(樣品稀釋液)將提

5、取液進(jìn)行適當(dāng)稀釋（如100µl樣品提取液+300µl樣品稀釋液，總稀釋20倍），即為待測(cè)樣液。1.1.3 一般飼料及原料 稱取5.0g樣品于100ml具塞三角瓶中，準(zhǔn)確加入25.0ml甲醇水(1+1)溶液，于振蕩器上劇烈震蕩15min，過濾，棄去1/4初濾液后收集濾液，此液為樣品提取液。根據(jù)樣品的國(guó)家允許量標(biāo)準(zhǔn)，用a試劑(樣品稀釋液)將樣品提取液進(jìn)行適當(dāng)稀釋（如100µl樣品提取液+900µl樣品稀釋液，總稀釋50倍），即為待測(cè)樣液。1.2 試劑的配制1.2.1每瓶c試劑（酶標(biāo)抗原）中準(zhǔn)確加入1.5ml d試劑(酶標(biāo)抗原稀釋液)，充分溶解，配成實(shí)驗(yàn)用酶標(biāo)

6、抗原溶液，28保存。1.2.2 取適量e試劑(濃縮洗滌液)用超純水稀釋20倍待用。例如：取3ml e試劑(濃縮洗滌液)，加57ml超純水，混勻后制成實(shí)驗(yàn)用洗滌液，足夠24孔使用。2、操作步驟2.1 試劑平衡：將測(cè)試盒于室溫中放置15min以上，平衡至室溫。2.2 小孔編號(hào)：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要截取相應(yīng)孔數(shù)放置反應(yīng)板框架上。設(shè)定l號(hào)孔為儀器調(diào)零孔，2-7號(hào)孔為afb1標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照孔，其余孔為樣品孔。2.3 洗滌：每孔加入250µl左右洗滌液，洗滌液不得溢出，放置1min后，甩掉洗滌液，在吸水紙上拍干，重復(fù)洗板一次。2.4 反應(yīng)組成：按下列步驟所示（見表1），依次加入配制好的溶液及待測(cè)樣液。 第一步

7、：l號(hào)孔加入50µl a試劑(樣品稀釋液)，2-7號(hào)孔分別加入系列的b試劑(afb1標(biāo)準(zhǔn)溶液：0，0.1，0.25，0.5，1，2ng/ml) 50µl，其余孔加入相應(yīng)的待測(cè)樣液。 第二步：l號(hào)孔加入50µl d試劑(酶標(biāo)抗原稀釋液)，其余各孔均加入50µl c試劑（酶標(biāo)抗原溶液）。 第三步：輕輕地振搖，使各孔中的反應(yīng)物混合均勻。 表1 反應(yīng)物組成操作次序加入量孔 號(hào)123456789101112150 µla00.10.250.512待測(cè)樣液250 µldccccccccccc3混 勻2.5 反應(yīng)：將反應(yīng)板放入37恒溫培養(yǎng)箱中孵育3

8、0min。2.6 洗滌：取出反應(yīng)板，用力甩掉反應(yīng)液，拍干。每孔加入250µl左右洗滌液，洗滌液不得溢出，放置2min后，甩掉洗滌液，在吸水紙上拍干，重復(fù)洗板4次。2.7 顯色：每孔分別加入f試劑(顯色底物液a)和g試劑(顯色底物液b)各50µl，搖勻，將反應(yīng)板放入37恒溫培養(yǎng)箱中顯色15min。2.8 終止與儀器測(cè)定：每孔分別加入h試劑（終止液)50µl，搖勻后用酶標(biāo)測(cè)定儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度a值。3、試樣測(cè)定與結(jié)果計(jì)算將系列afb1標(biāo)準(zhǔn)溶液(0，0.1，0.25，0.5，1，2ng/ml)測(cè)得的吸光度a值，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線(見示意圖)。橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)液濃度的常用對(duì)數(shù)值(1gc)，縱坐標(biāo)為各標(biāo)準(zhǔn)液孔a值與0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)液孔的a值的比值(a（標(biāo)準(zhǔn)液）a（0ng/ml）（若同時(shí)有平行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，則a及a0分別取其平均值，下同）。黃曲霉毒素b 1標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖(注：僅供參考)計(jì)算待測(cè)樣品孔a值與a(0ng/ml)的比值(a樣品/a（0ng/ml）)，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得到相應(yīng)待測(cè)樣液濃度(c)的常用對(duì)數(shù)值lgc，對(duì)其求反對(duì)數(shù)，可求得待測(cè)樣液的af