PCR擴(kuò)增原理及操作.doc

1、PCR擴(kuò)增反應(yīng)的操作第一節(jié)PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的基本原理一、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR ）的基本構(gòu)成PCR 是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的簡(jiǎn)稱(chēng)，指在引物指導(dǎo)下由酶催化的對(duì)特定模板（克隆或基因組DNA ）的擴(kuò)增反應(yīng)，是模擬體內(nèi)DNA 復(fù)制過(guò)程，在體外特異性擴(kuò)增DNA 片段的一種技術(shù)，在分子生物學(xué)中有廣泛的應(yīng)用，包括用于DNA 作圖、 DNA 測(cè)序、分子系統(tǒng)遺傳學(xué)等。PCR 基本原理是以單鏈DNA 為模板， 4 種 dNTP 為底物，在模板3末端有引物存在的情況下，用酶進(jìn)行互補(bǔ)鏈的延伸，多次反復(fù)的循環(huán)能使微量的模板DNA 得到極大程度的擴(kuò)增。在微量離心管中，加入與待擴(kuò)增的 DNA 片段兩端已知序列分別互補(bǔ)的兩個(gè)引物、

2、適量的緩沖液、微量的DNA 膜板、四種dNTP 溶液、耐熱 Taq DNA聚合酶、 Mg 2+等。反應(yīng)時(shí)先將上述溶液加熱，使模板DNA 在高溫下變性，雙鏈解開(kāi)為單鏈狀態(tài)；然后降低溶液溫度，使合成引物在低溫下與其靶序列配對(duì)，形成部分雙鏈，稱(chēng)為退火；再將溫度升至合適溫度，在 Taq DNA 聚合酶的催化下， 以 dNTP 為原料， 引物沿 5 3方向延伸，形成新的 DNA 片段，該片段又可作為下一輪反應(yīng)的模板，如此重復(fù)改變溫度，由高溫變性、低溫復(fù)性和適溫延伸組成一個(gè)周期，反復(fù)循環(huán)，使目的基因得以迅速擴(kuò)增。因此PCR 循環(huán)過(guò)程為三部分構(gòu)成：模板變性、引物退火、熱穩(wěn)定DNA 聚合酶在適當(dāng)溫度下催化DN

3、A 鏈延伸合成（見(jiàn)圖）。1模板 DNA 的變性模板 DNA 加熱到 9095 時(shí)，雙螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵斷裂，雙鏈解開(kāi)成為單鏈，稱(chēng)為DNA 的變性，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。變性溫度與DNA 中 G-C 含量有關(guān)， G-C 間由三個(gè)氫鍵連接，而A-T 間只有兩個(gè)氫鍵相連，所以G-C 含量較高的模板，其解鏈溫度相對(duì)要高些。故PCR 中 DNA 變性需要的溫度和時(shí)間與模板DNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、 G-C 含量高低等均有關(guān)。 對(duì)于高 G-C 含量的模板 DNA在實(shí)驗(yàn)中需添加一定量二甲基亞砜（DMSO ），并且在 PCR 循環(huán)中起始階段熱變性溫度可以采用97，時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)，即所謂的熱啟動(dòng)。2模

4、板DNA 與引物的退火將反應(yīng)混合物溫度降低至 3765 時(shí)， 寡核苷酸引物與單鏈模板雜交， 形成 DNA 模板 -引物復(fù)合物。退火所需要的溫度和時(shí)間取決于引物與靶序列的同源性程度及寡核苷酸的堿基組成。一般要求引物的濃度大大高于模板 DNA 的濃度，并由于引物的長(zhǎng)度顯著短于模板的長(zhǎng)度，因此在退火時(shí)，引物與模板中的互補(bǔ)序列的配對(duì)速度比模板之間重新配對(duì)成雙鏈的速度要快得多，退火時(shí)間一般為1 2min 。3引物的延伸DNA 模板 -引物復(fù)合物在Taq DNA配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條與模板聚合酶的作用下，以dNTP 為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基DNA 鏈互補(bǔ)的新鏈。重復(fù)循環(huán)變性-退火 -延伸三

5、過(guò)程，就可獲得更多的 “半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。延伸所需要的時(shí)間取決于模板DNA的長(zhǎng)度。在 72條件下， Taq DNA 聚合酶催化的合成速度大約為退火 -延伸”循環(huán)，模板拷貝數(shù)增加了一倍。在以后的循環(huán)中，新合成的40 60 個(gè)堿基 /秒。經(jīng)過(guò)一輪“變性DNA 都可以起模板作用，因此-每一輪循環(huán)以后，DNA拷貝數(shù)就增加一倍。每完成一個(gè)循環(huán)需2 4min ，一次PCR 經(jīng)過(guò)30 40 次循環(huán)，約 2 3h 。擴(kuò)增初期，擴(kuò)增的量呈直線(xiàn)上升，但是當(dāng)引物、模板、聚合酶達(dá)到一定比值時(shí)，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，便出現(xiàn)所謂的“平臺(tái)效應(yīng)”，即靶DNA產(chǎn)物的濃度不再增加。PCR 的三個(gè)

6、反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA 擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA X ） n 計(jì)算。 Y 代表 DNA 片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X 表示平（ Y ）均每次的擴(kuò)增效率，擴(kuò)增量可用Y （ 1n 代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為的增加呈指數(shù)形式，隨著100%，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列 DNA PCR 產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的 DNA 片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線(xiàn)性增長(zhǎng)片段期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱(chēng)平臺(tái)期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR 的種類(lèi)和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩?。大多?shù)情況下，平臺(tái)期的到來(lái)是不可避免的。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可分為長(zhǎng)產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物

7、片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度嚴(yán)格地限定在兩個(gè)引物鏈5'端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長(zhǎng)產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個(gè)原始模板為例，在第一個(gè)反應(yīng)周期中，以?xún)蓷l互補(bǔ)的DNA 為模板，引物是從3' 端開(kāi)始延伸，其5'端是固定的， 3'端則沒(méi)有固定的止點(diǎn)，長(zhǎng)短不一，這就是“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”。進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈（即“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”）結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時(shí)，由于新鏈模板的 5'端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3' 端被固定了止點(diǎn)，保證了新片段的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增序列以?xún)?nèi)、形成長(zhǎng)

8、短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計(jì)，這使得PCR 的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA 片段供分析與檢測(cè)用。變性退火延伸圖 PCR 的反應(yīng)歷程二、 PCR反應(yīng)的五個(gè)元素參與 PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要為五種：引物、酶、dNTP 、模板和Mg 2+。1引物引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板 DNA 在體外大量擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)有序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用 PCR 就可將模板3 條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)，其次

9、引物與引物之間DNA避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)（即錯(cuò)配）。引物的選擇將決定 PCR 產(chǎn)物的大小、 位置、 以及擴(kuò)增區(qū)域的理參數(shù)。好的引物設(shè)計(jì)可以避免背景和非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生，甚至在Tm 值這個(gè)和擴(kuò)增物產(chǎn)量有關(guān)的重要物RNA-PCR 中也能識(shí)別cDNA 或基因組模板。引物設(shè)計(jì)也極大的影響擴(kuò)增產(chǎn)量：若使用設(shè)計(jì)粗糙的引物，產(chǎn)物將很少甚至沒(méi)有；而使用正確設(shè)計(jì)的引物得到的產(chǎn)物量可接近于反應(yīng)指數(shù)期的產(chǎn)量理論值。當(dāng)然，即使有了好的引物，依然需要進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化，比如調(diào)整Mg 2+濃度，使用特殊的共溶劑如二甲基亞砜、甲酰胺和甘油。對(duì)引物的設(shè)計(jì)不可能有一種包

10、羅萬(wàn)象的規(guī)則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設(shè)計(jì)。（1）引物長(zhǎng)度PCR 特異性一般通過(guò)引物長(zhǎng)度和退火溫度來(lái)控制。引物的長(zhǎng)度一般為15-30bp，常用的是1827bp，但不應(yīng)大于38bp。引物過(guò)短時(shí)會(huì)造成Tm 值過(guò)低，在酶反應(yīng)溫度時(shí)不能與模板很好的配對(duì)；引物過(guò)長(zhǎng)時(shí)又會(huì)造成Tm 值過(guò)高，超過(guò)酶反應(yīng)的最適溫度，還會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74，不適于Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，而且合成長(zhǎng)引物還會(huì)大大增加合成費(fèi)用。（2）引物堿基構(gòu)成引物的 G+C 含量以 4060%為宜，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)，上下游引物的GC 含量不能相差太大。其Tm 值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，

11、50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm 值 510。若按公式Tm=4 （ G+C ） +2（ A+T ）估計(jì)引物的Tm值，則有效引物的Tm 為 55 80， 其 Tm 值最好接近72以使復(fù)性條件最佳。引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不應(yīng)超過(guò)3 個(gè)連續(xù)的G 或 C，因這樣會(huì)使引物在G+C 富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。（ 3）引物二級(jí)結(jié)構(gòu)引物二級(jí)結(jié)構(gòu)包括引物自身二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物間二聚體等。這些因素會(huì)影響引物和模板的結(jié)合從而影響引物效率。對(duì)于引物的3末端形成的二聚體，應(yīng)控制其G大于kcal/mol 或少于三個(gè)連續(xù)的堿基互補(bǔ)，因?yàn)榇朔N情形的引物二聚

12、體有進(jìn)一步形成更穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的可能性，引物中間或5端的要求可適當(dāng)放寬。引物自身形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，也以3端或近3端對(duì)引物 -模板結(jié)合影響更大；影響發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的因素除了堿基互補(bǔ)配對(duì)的鍵能之外，與莖環(huán)結(jié)構(gòu)形式亦有很大的關(guān)系。應(yīng)盡量避免 3末端有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的引物。（4）引物 3端序列引物 3末端和模板的堿基完全配對(duì)對(duì)于獲得好的結(jié)果是非常重要的，而引物3末端最后5 到 6個(gè)核苷酸的錯(cuò)配應(yīng)盡可能的少。如果3末端的錯(cuò)配過(guò)多，通過(guò)降低反應(yīng)的退火溫度來(lái)補(bǔ)償這種錯(cuò)配不會(huì)有什么效果，反應(yīng)幾乎注定要失敗。引物 3末端的另一個(gè)問(wèn)題是防止一對(duì)引物內(nèi)的同源性。應(yīng)特別注意引物不能互補(bǔ)，尤其是在3末端。引物間的互補(bǔ)將導(dǎo)致不想要的

13、引物雙鏈體的出現(xiàn)，這樣獲得的PCR 產(chǎn)物其實(shí)是引物自身的擴(kuò)增。這將會(huì)在引物雙鏈體產(chǎn)物和天然模板之間產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)PCR 狀態(tài)，從而影響擴(kuò)增成功。引物 3末端的穩(wěn)定性由引物3末端的堿基組成決定，一般考慮末端5 個(gè)堿基的G。?G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性，此值的大小對(duì)擴(kuò)增有較大的影響。應(yīng)當(dāng)選用3端 ?G 值較低（絕對(duì)值不超過(guò)9），負(fù)值大，則3末端穩(wěn)定性高，擴(kuò)增效率更高。引物的3端的 ?G 值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)。需要注意的是，如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子的第3 位，因密碼子的第3 位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增特

14、異性與效率。另外末位堿基為A 的錯(cuò)配效率明顯高于其他3 個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3端使用堿基A 。（5）引物的 5端引物的 5端限定著PCR 產(chǎn)物的長(zhǎng)度， 它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu 3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合 DNA 序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。對(duì)于引入一至兩個(gè)酶切位點(diǎn)，應(yīng)在后續(xù)方案設(shè)計(jì)完畢后確定，便于后期的克隆實(shí)驗(yàn)，特別是在用于表達(dá)研究的目的基因的克隆工作中。（ 6）引物的特異性引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過(guò) 70% 或有連續(xù) 8 個(gè)互補(bǔ)堿基同源， 特別是與

15、待擴(kuò)增的模板 DNA 之間要沒(méi)有明顯的相似序列。2酶及其濃度Taq DNA 多聚酶是耐熱DNA 聚合酶，是從水生棲熱菌 （Thermus aquaticus）中分離的。 Taq DNA聚合酶是一個(gè)單亞基，分子量為94 000 Da。具有 5->3 的聚合酶活力， 5->3 的外切核酸酶活力，無(wú) 3->5 的外切核酸酶活力，會(huì)在3末端不依賴(lài)模板加入1 個(gè)脫氧核苷酸（通常為A，故 PCR 產(chǎn)物克隆中有與之匹配的T 載體），在體外實(shí)驗(yàn)中， Taq DNA 聚合酶的出錯(cuò)率為 10-4 10-5。此酶的發(fā)現(xiàn)使 PCR 廣泛的被應(yīng)用。此酶具有以下特點(diǎn)：（ 1）耐高溫，在 70下反應(yīng)2 小

16、時(shí)后其殘留活性在90%以上，在 93下反應(yīng)2 小時(shí)后其殘留活性是仍能保持 60%，而在 95下反應(yīng) 2 小時(shí)后為原來(lái)的40%。（ 2）在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，故不必在擴(kuò)增反應(yīng)的每輪循環(huán)完成后再加新酶。（ 3）一般擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度可達(dá) kb，且特異性也較高。PCR 的廣泛應(yīng)用得益于此酶，目前各試劑公司中開(kāi)發(fā)了多種類(lèi)型的Taq 酶，有用于長(zhǎng)片段擴(kuò)增的酶，擴(kuò)增長(zhǎng)度極端可達(dá)40kb；有在常溫條件下即可應(yīng)用的常溫PCR 聚合酶；還有針對(duì)不同實(shí)驗(yàn)對(duì)象的酶等。一典型的PCR 反應(yīng)約需的酶量為（總反應(yīng)體積為50 l 時(shí)），濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。3 dNTP的質(zhì)量與濃度dN

17、TP 的質(zhì)量與濃度和PCR 擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP 粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。 dNTP 溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH 或 1M Tris 。HCl 的緩沖液將其 pH 調(diào)節(jié)到，小量分裝，-20冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP 降解。在 PCR 反應(yīng)中， dNTP應(yīng)為 50 200 mol/l ，尤其是注意4 種 dNTP 的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過(guò)低又會(huì)降低PCR 產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP 能與Mg 2+結(jié)合，使游離的Mg 2+濃度降低。4模板（靶基因）核酸模板核酸的量與純化程度，

18、是PCR 成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA 純化方法通常采用SDS 和蛋白酶 K 來(lái)消化處理標(biāo)本。SDS 的主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上的脂類(lèi)與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶 K 能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA 結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑（酚與氯仿抽）抽提除去蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸，該核酸即可作為模板用于PCR 反應(yīng)。 一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。模板 DNA 投入量對(duì)于細(xì)菌基因組 DNA 一般在 110ng/ l

19、，實(shí)驗(yàn)中模板濃度常常需要優(yōu)化，一般可選擇幾個(gè)濃度梯度 （濃度差以 10 倍為一個(gè)梯度） 。在 PCR 反應(yīng)中， 過(guò)高的模板投入量往往會(huì)導(dǎo)致 PCR 實(shí)驗(yàn)的失敗。5 Mg 2+濃度Mg 2+ 對(duì) PCR 擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的 PCR 反應(yīng)中，各種 dNTP 濃度為 200 mol/l時(shí)，Mg 2+ 濃度為 l 為宜。 Mg 2+濃度過(guò)高， 反應(yīng)特異性降低， 出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。一般廠(chǎng)商提供的Taq DNA 聚合酶均有相應(yīng)的緩沖液，而Mg 2+也已添加，如果特殊實(shí)驗(yàn)應(yīng)采用無(wú)Mg 2+的緩沖液，在PCR 反應(yīng)體系中添加一定量

20、的Mg 2+。三、 PCR 反應(yīng)特點(diǎn)PCR 反應(yīng)具有以下特點(diǎn)：1強(qiáng)特異性PCR 反應(yīng)的特異性決定因素為： （1）引物與模板 DNA 特異性的結(jié)合；（ 2）堿基配對(duì)原則；（ 3） Taq DNA 聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性； （ 4）靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵，引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及Taq DNA 聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性 )可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。2高靈敏度PCR 產(chǎn)物的生成

21、量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克（pg=10-12g）量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克（ g = 10-6 g）水平。能從100 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR 的靈敏度可達(dá)3 個(gè) RFU（空斑形成單位） ；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3 個(gè)細(xì)菌。3快速簡(jiǎn)便PCR 反應(yīng)用耐高溫的 Taq DNA 聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在PCR 儀上進(jìn)行變性退火延伸反應(yīng)，反應(yīng)一般在2 4 小時(shí)完成。擴(kuò)增產(chǎn)物常用電泳分析，操作簡(jiǎn)單易推廣，如采用特殊 PCR 儀（熒光時(shí)時(shí)定量PCR 儀）則可全程監(jiān)測(cè)PCR 反應(yīng)的結(jié)果，故耗時(shí)將更短。4低純度模板不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及總 R

22、NA 等均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的DNA 擴(kuò)增檢測(cè)。第二節(jié)PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)施一、 PCR 反應(yīng)的條件PCR 反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。1溫度與時(shí)間的設(shè)置基于 PCR 原理三步驟而設(shè)置變性-退火 -延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA 在 90 95變性，再迅速冷卻至40 60，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至7075，在 Taq DNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因（長(zhǎng)度為100 300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用右退火與延伸（此溫度

23、Taq DNA 酶仍有較高的催化活性） 。94變性，65左（1）變性溫度與時(shí)間： 變性溫度低， 解鏈不完全是導(dǎo)致PCR 失敗的最主要原因。一般情況下，93 94 lmin 足以使模板DNA 變性， 若低于 93則需延長(zhǎng)時(shí)間，但溫度不能過(guò)高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR 產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR 失敗。（2）退火（復(fù)性）溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR 特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至 40 60，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及

24、其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。對(duì)于20 個(gè)核苷酸， G+C 含量約50% 的引物， 55為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過(guò)以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm 值（解鏈溫度）=4(G+C) 2(A+T)復(fù)性溫度 =Tm 值 -(5 10 )在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR 反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為（ 3）延伸溫度與時(shí)間：30 60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。Taq DNA 聚合酶的生物學(xué)活性：70 80， 150核苷酸/S/酶分子；70， 60 核苷酸 /S/ 酶分子； 55， 24 核苷酸 /S/酶分子；高于9

25、0時(shí)， DNA 合成幾乎不能進(jìn)行。（ 4）PCR 反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70 75之間，常用溫度為72，過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR 延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般1kb 以?xún)?nèi)的 DNA 片段，延伸時(shí)間1min是足夠的。3 4kb的靶序列需3 4min ；擴(kuò)增10kb 需延伸至15min 。延伸進(jìn)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。2循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR 循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度，一般的循環(huán)次數(shù)選在30 40 次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。二、 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析PCR 產(chǎn)物是否

26、為特異性擴(kuò)增，其結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠，必須對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的分析與鑒定，才能得出正確的結(jié)論。 PCR 產(chǎn)物的分析，可依據(jù)研究對(duì)象和目的不同而采用不同的分析方法。1凝膠電泳分析：PCR 產(chǎn)物電泳，物片段的大小應(yīng)與預(yù)計(jì)的一致，特別是多重EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。PCR，應(yīng)用多對(duì)引物，其產(chǎn)物片斷都應(yīng)符合預(yù)訐的大小，這PCR 產(chǎn)是起碼條件。（ 1）瓊脂糖凝膠電泳：通常應(yīng)用1 2% 的瓊脂糖凝膠，供檢測(cè)用。（ 2）聚丙烯酰胺凝膠電泳： 6 10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測(cè)分析。2酶切分析：根據(jù) PCR 產(chǎn)物中限制性?xún)?nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶切、電

27、泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對(duì)靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研究。3分子雜交：分子雜交是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測(cè)PCR產(chǎn)物堿基突變的有效方法。4Southern 印跡雜交：在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈（內(nèi)部寡核苷酸）標(biāo)記后做探針，與CR 產(chǎn)物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測(cè)PCR 產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形P狀，主要用于科研。5斑點(diǎn)雜交：將PCR 產(chǎn)物點(diǎn)在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內(nèi)部寡核苷酸探針雜交，觀察有無(wú)著色斑點(diǎn)，主要用于PCR 產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。6核酸序列分析：是檢測(cè)PCR 產(chǎn)物特異性的最可靠方法。三、 PC

28、R結(jié)果異常分析PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間一般為48h 以?xún)?nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h 后帶型不規(guī)則甚致消失。1假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有：模板核酸的制備；引物的質(zhì)量與特異性；酶的質(zhì)量及活性；PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。（ 1）模板：模板中含有雜蛋白質(zhì)；模板中含有Taq 酶抑制劑；模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白；在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚；模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。（ 2）酶失活

29、：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq 酶或溴乙錠。（3）引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱(chēng)，是PCR 失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增，對(duì)策為： 選定一個(gè)好的引物合成單位。 引物的濃度不僅要看OD 值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR 有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡

30、其濃度。 引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。（4）Mg 2+濃度： Mg 2+ 離子濃度對(duì)PCR 擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR 擴(kuò)增的特異性，濃度過(guò)低則影響PCR 擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR 擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。（5）反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR 擴(kuò)增采用的體積為20 l、30 l、50 l 或 100 l, 用多大體積進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20 l 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。（ 6）物理原因：變性對(duì) PCR 擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性 ;退火溫度過(guò)低， 可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR 擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是 PCR 失敗的原因之一。（7）靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性