植物組織培養(yǎng)實(shí)訓(xùn)指導(dǎo)書

1、植物組織培養(yǎng)實(shí)訓(xùn)指導(dǎo)書實(shí)訓(xùn)一  植物組織培養(yǎng)室參觀與設(shè)計(jì) 一、目的要求     通過參觀，使學(xué)生掌握如何組建植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室；同時(shí)，熟悉組培中涉及的各種儀器設(shè)備和器皿用具。二、儀器與用具 1 、儀器： 超凈工作臺(tái)，空調(diào)機(jī)，蒸餾水發(fā)生器或純水發(fā)生器，高壓滅菌鍋，低溫冰箱、普通冰箱，電爐，顯微鏡，天平、恒溫培養(yǎng)箱，烘箱等設(shè)備。2 、用具： 各種培養(yǎng)皿，分注器，各種實(shí)驗(yàn)器皿和各種器械用具。 三、方法步驟 1 、先由指導(dǎo)老師集中介紹組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室守則及有關(guān)注意事項(xiàng)。2 、先由指導(dǎo)老師講解本次實(shí)驗(yàn)的目的、儀器設(shè)備和器皿用具的名稱及實(shí)驗(yàn)步驟。3 、指導(dǎo)老

2、師逐一講解組培實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建情況，包括準(zhǔn)備室（又稱化學(xué)實(shí)驗(yàn)室）、緩沖室、無菌操作室、培養(yǎng)室、馴化室、溫室等使用的各種儀器設(shè)備和器皿用具的名稱用途。1 ）準(zhǔn)備室（化學(xué)實(shí)驗(yàn)室）面積： 20m 2 左右用途：器皿洗滌、培養(yǎng)基配置、分裝、高壓滅菌，植物材料的預(yù)處理，重蒸餾水的制備以及進(jìn)行生理、生化因素的分析，試管苗出瓶，清洗及整理工作。要求：明亮、通風(fēng)設(shè)備：工作臺(tái)，櫥柜，水池，儀器，藥品等2 ）緩沖室面積：約 3-5m 2 左右用途：進(jìn)入無菌室前需在緩沖室里換上經(jīng)過滅菌的工作服、拖鞋，戴上口罩。設(shè)備： 1 盞紫外燈， 1 個(gè)配電板，石英電力時(shí)控器等3 ）無菌操作室（無菌室，接種室）面積： 10-20m

3、2 ，視生產(chǎn)規(guī)模和超凈工作臺(tái)數(shù)量而定。用途：材料的滅菌接種，無菌材料的繼代，叢生菌的增殖或切割，嫩枝扦插生根等，是關(guān)鍵的部分，關(guān)系到培養(yǎng)物的污染率、接種工作效率等重要指標(biāo)。要求：干爽安靜、清潔明亮、墻壁光滑平整不易積染灰塵，地面平坦無縫便于清洗和滅菌。門窗要密閉，一般用移動(dòng)門窗。設(shè)備：超凈工作臺(tái)、空調(diào)機(jī)，醫(yī)用小平車，操作臺(tái)、擱架等。4 ）培養(yǎng)室面積：視培養(yǎng)架多少及培養(yǎng)物數(shù)量而定。用途：將接種到培養(yǎng)瓶等器皿中的植物材料進(jìn)行培養(yǎng)的場(chǎng)所。設(shè)備： 培養(yǎng)架與燈光培養(yǎng)架數(shù)目多少視生產(chǎn)規(guī)模而定，年產(chǎn)4萬10萬苗需46個(gè)培養(yǎng)架；年產(chǎn)10萬 20萬苗約需 810個(gè)培養(yǎng)架。每個(gè)培養(yǎng)架一般 6 層，總高度

4、 2m ，每 0.3m 為一層 , 最下一層距離地面 0.2m 架寬以 0.6m 為好，架長以 40w 日光燈的長度來決定，即約 1.26m 。每層架子安裝 2 盞日光燈。 通風(fēng)設(shè)備在稍高處設(shè)置進(jìn)風(fēng)氣窗，在其對(duì)側(cè)近天花板處設(shè)置排風(fēng)窗。 邊臺(tái)、空調(diào)機(jī)、加濕器（除濕器）、各類顯微鏡、溫濕度計(jì)。5 ）馴化室面積：視生產(chǎn)規(guī)模而定。用途：組培苗（試管苗）移栽前進(jìn)行煉苗。要求：清潔無菌設(shè)備：空調(diào)機(jī)、加濕器、恒溫恒濕控制儀、噴霧器。6 ）溫室面積：視生產(chǎn)規(guī)模而定。用途：保證試管苗不分季節(jié)地常年生產(chǎn)。設(shè)備：溫度控制裝置、通風(fēng)口、噴霧裝置、光照調(diào)節(jié)裝置、殺菌殺蟲工具及相應(yīng)藥物。實(shí)訓(xùn)二

5、60;植物組織培養(yǎng)室及培養(yǎng)用具的消毒與滅菌一、目的要求 1、通過實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)學(xué)生良好的衛(wèi)生觀念，確立組織培養(yǎng)的無菌意識(shí)。2、掌握組織培養(yǎng)室的消毒及滅菌方法。 3、掌握培養(yǎng)用具的干熱滅菌的一般操作技術(shù)。 二、儀器與用具 1、用具：噴霧器、工作服、口罩、手套等。 2、藥品：2%新潔爾滅，高錳酸鉀，甲醛，70%酒精。 三、方法步驟 （一）植物組織培養(yǎng)室的滅菌 1、地面、墻壁和工作臺(tái)的滅菌：用2%新潔爾滅噴霧。 （1）配方：取新潔爾滅原液20ml，加水980ml，配成2%新潔爾滅溶液。 （2）方法：將配好的2%新潔爾滅溶液倒入噴霧器內(nèi)，進(jìn)行均勻噴霧。 （3）注意事項(xiàng)：   墻壁、角落

6、、地面噴霧要均勻，不要遺漏；   注意安全，在噴房頂時(shí)，要特別小心，防止藥液霧滴掉入眼睛。 2、無菌室和培養(yǎng)室的滅菌：用甲醛和高錳酸鉀熏蒸，1年中熏蒸1-2次。 （1）配方：每立方米空間用甲醛10ml加高錳酸鉀5g的配比液熏蒸。 （2）方法：首先房子要密封。然后在房子中間放一口缸或大燒杯，將稱好的高錳酸鉀放入缸內(nèi)，再把已稱量的甲醛溶液慢慢倒入缸內(nèi)，完畢，人迅速離開，并關(guān)上門，密封3天。（3）注意事項(xiàng)：   操作前要戴好口罩及手套；   倒入甲醛時(shí)要小心，因?yàn)榧兹┯龅礁咤i酸鉀會(huì)迅速沸騰，并產(chǎn)生大量煙霧。操作時(shí)人要迅速避開煙霧； 

7、0; 3天后，打開房間，搬走費(fèi)液缸；一周后，方可進(jìn)入操作。 3、在已經(jīng)熏蒸過的房間內(nèi)，用70%酒精紗布擦洗培養(yǎng)架、工作臺(tái)。 4、用紫外燈照射2030min。 5、使用前，再用70%酒精噴霧，使空間灰塵落下。（二）培養(yǎng)基的滅菌高壓蒸汽滅菌（濕熱滅菌法） （1）洗滌：把組織培養(yǎng)基用的培養(yǎng)皿、三角瓶、試管等玻璃器皿進(jìn)行徹底清洗。自然晾干或烘箱干燥。 （2）包扎：用牛皮紙、報(bào)紙、紗布或錫箔紙把玻璃器皿和金屬器械分別包扎好。 （3）裝水：在高壓滅菌鍋內(nèi)裝入一定量的水（水要淹沒電熱絲）。（切忌干燒?。?（4）裝物品：在滅菌鍋內(nèi)放入含培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶或三角瓶、裝蒸餾水的玻璃瓶，以及包扎好的玻璃器皿和

8、金屬器械等。 （5）滅菌：將排氣閥開著，加熱，直至鍋內(nèi)釋放出大量水蒸氣（此時(shí)水蒸氣橫向噴出），再關(guān)閉閥們；或者當(dāng)鍋內(nèi)壓力升至49.0kpa時(shí)，開啟排氣閥，將鍋內(nèi)的冷空氣全部排出。當(dāng)鍋內(nèi)壓力達(dá)到108kpa時(shí)，溫度為121時(shí)，維持15-20分鐘，即可達(dá)到滅菌的目的。（若滅菌時(shí)間過長，會(huì)使培養(yǎng)基中的某些成分變性失效。）切斷電源，讓滅菌鍋?zhàn)匀焕鋮s。注意：先打開放氣閥，再打開鍋蓋。（以免鍋內(nèi)壓力大而爆炸！）        開蓋后應(yīng)盡快轉(zhuǎn)移培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)瓶冷卻、凝固。一般應(yīng)將滅菌后的培養(yǎng)瓶?jī)?chǔ)藏于30以下的室 內(nèi)，最好儲(chǔ)藏在4-10的條

9、件下。         某些生長調(diào)節(jié)劑如iaa、zt、aba等以及某些維生素遇熱是不穩(wěn)定的，不能同培養(yǎng)基一起高壓滅菌，而需要進(jìn)行過濾滅菌。 2、培養(yǎng)用具的滅菌干熱滅菌法 （1）玻璃器皿的滅菌：濕熱滅菌法或干熱滅菌法。 （2）金屬器械的滅菌：干熱滅菌或火焰滅菌法。 （3）布質(zhì)制品的滅菌：均用濕熱滅菌法。（注意：布質(zhì)制品絕不能干熱滅菌?。?干熱滅菌方法： （1）洗滌：把組織培養(yǎng)用的培養(yǎng)皿、三角瓶、試管、移液管等玻璃器皿進(jìn)行徹底清洗。（2）包扎：玻璃器皿可放在大的玻璃容器中，金屬器械可放在金屬盒內(nèi)。 （3）滅菌：器皿在烘

10、箱中，150，干熱滅菌1小時(shí)；或120，2小時(shí)。滅菌完畢，待冷卻后取出。注意：先打開放氣閥，再打開鍋蓋。（以免鍋內(nèi)壓力大而爆炸?。?       開蓋后應(yīng)盡快轉(zhuǎn)移培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)瓶冷卻、凝固。一般應(yīng)將滅菌后的培養(yǎng)瓶?jī)?chǔ)藏于30以下的室內(nèi)，最好儲(chǔ)藏在4-10的條件下。         某些生長調(diào)節(jié)劑如iaa、zt、aba等以及某些維生素遇熱是不穩(wěn)定的，不能同培養(yǎng)基一起高壓滅菌，而需要進(jìn)行過濾滅菌。 實(shí)訓(xùn)三  ms培養(yǎng)基母液的配制與保存一、目的

11、要求 1、通過ms培養(yǎng)基母液的配制，掌握配制與保存培養(yǎng)基母液的基本技能。 |2、掌握培養(yǎng)基各種母液的保存方法。 二、儀器與用具 1、儀器：各類天平、磁力攪拌器、冰箱等。 2、用具：燒杯、容量瓶、量筒、試劑瓶、標(biāo)簽等。3、試劑：95%酒精，0.1-1 naoh，0.1-1nhcl，配制ms培養(yǎng)基所需的各種無機(jī)物、有機(jī)物，蒸餾水。 三、方法步驟 （一）母液的配制 母液是欲配制培養(yǎng)基的濃縮液，一般配成比所需濃度高10100倍的溶液。 優(yōu)點(diǎn)：（1）保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性。         （2）便于配置時(shí)快速移取。 

12、60;     （3）便于低溫保藏。1、ms大量元素母液（10x） 稱10升量溶解在1升蒸餾水中。配1升培養(yǎng)基取母液100ml。 化學(xué)藥品 1升量 10升量 nh4no31650 mg/l165g kno31900 mg/l190g cacl2·2h2o 440 mg/l44g mgso4·7h2o 370 mg/l37g kh2po4170 mg/l17g2、ms微量元素母液（100x） 稱10升量溶解在100ml蒸餾水中。配1升培養(yǎng)基取母液10ml。  化學(xué)藥品 1升量 10升量 mnso4·4h2o（ mns

13、o4·h2o） 223 mg/l（214 mg/l） 223mg znso4·7h2o 86 mg/l86mg cocl2·6h2o 0025mg/l025mg cuso4·5h2o 0025 mg/l025mg na2moo4·2h2o 025 mg/l25mg ki083 mg/l83 mg h3bo362 mg/l62 mg注意：cocl2·6h2o和cuso4·5h2o可按10倍量（025 mgx10=25 mg）或100倍量（25 mg）稱取后，定容于100ml水中，每次取10ml或1ml，（即含025 mg的量）

14、，加入到母液中。 3、ms鐵鹽母液（100x） 稱10升量溶解在100ml蒸餾水中。配1升培養(yǎng)基取母液10ml。 化學(xué)藥品 1升量 10升量 na2·edta 373 mg/l373 mgfeso4·7h2o 278 mg/l278 mg 注意配制時(shí)，應(yīng)將兩種成分分別溶解在少量蒸餾水中，其中edta鹽較難完全溶解，可適當(dāng)加熱?；旌蠒r(shí)，先取一種置容量瓶（燒杯）中，然后將另一種成分逐加逐劇烈震蕩，至產(chǎn)生深黃色溶液，最后定容，保存在棕色試劑瓶中。 4、ms有機(jī)物母液（100x） 稱10升量溶解在100ml蒸餾水中。配1升培養(yǎng)基取母液10ml。 化學(xué)藥品 1升量 10升量 煙酸 0

15、5 mg/l5mg 鹽酸吡哆素（vb6） 05 mg/l5mg 鹽酸硫胺素（vb1）    肌醇 100 mg/l1 g 甘氨酸 2 mg/l20mg5、生長調(diào)節(jié)劑 單獨(dú)配制，濃度為1-5 mg/ml（書中為05 -1mg/ml），一般配成4 mg/ml 。 配制培養(yǎng)基母液時(shí)注意事項(xiàng)：    一些離子易發(fā)生沉淀，可先用少量蒸餾水溶解，在按配方順序依次混合；    配制母液時(shí)必須用蒸餾水或重蒸餾水；    藥品應(yīng)用化學(xué)純或分析純；    溶解生長素時(shí)，可用少

16、量05 1n的naoh 或95%酒精溶解，溶解分裂素類用05 1n的hcl加熱溶解。 （二）母液的保存 1、裝瓶：將配制好的母液分別裝入試劑瓶中，貼好標(biāo)簽，注明各培養(yǎng)基母液的名稱、濃縮倍數(shù)、日期。注意將易分解、氧化的溶液，放入棕色瓶中保存。 2、貯藏：4冰箱。 實(shí)訓(xùn)四  ms培養(yǎng)基的配制與滅菌一、目的要求 通過ms固體培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的基本技能。 二、儀器與用具 1、儀器：酸度計(jì)或ph試紙、電磁攪拌器、電爐 2、用具：高壓滅菌鍋、微量移液器、移液管、量筒、容量瓶、培養(yǎng)瓶（三角瓶）、燒杯、標(biāo)簽 3、試劑：配制ms培養(yǎng)基的各種母液、生長調(diào)節(jié)劑、瓊脂、蔗糖、蒸餾水、0.1 n

17、、0.5n naoh，0.1 n 、0.5n hcl 三、方法步驟 （一）ms固體培養(yǎng)基的配制 1、將配制好的ms培養(yǎng)基母液從冰箱中取出，按順序排列，并逐一檢查是否沉淀或變色，避免使用已失效的母液。 2、取少量的蒸餾水（約為配制培養(yǎng)基量的2/3）加入燒杯中。 注意：配500ml培養(yǎng)基用1000ml燒杯。 3、按母液順序和規(guī)定量，用量筒、移液管或微量移液器取母液，依次放入燒杯中。 如配制1000ml培養(yǎng)基： 需：ms大量元素母液    100ml    ms微量元素母液    10ml 

18、   ms鐵鹽母液        10ml    ms有機(jī)物母液      10ml4、通過計(jì)算，用微量移液器取所需的各種生長調(diào)節(jié)劑母液。 5、加入蔗糖（30g/l），溶解。 6、定容：用容量瓶。 7、調(diào)ph值：一般ph=5.8。    用0.1 n 和0.5n 的naoh和hcl 將ph調(diào)至所需的數(shù)值。 注意：經(jīng)高溫高壓滅菌后，培養(yǎng)基的ph值會(huì)下降0.20.8，故調(diào)整后的ph

19、值應(yīng)高于目標(biāo)ph值0.5個(gè)單位。       ph值的大小會(huì)影響瓊脂的凝固能力，一般當(dāng)ph大于6.0時(shí)，培養(yǎng)基將會(huì)變硬；低于5.0時(shí)，瓊脂就不能很好地凝固。       如果ph值與所需的數(shù)值相差很大，可先用0.5n的naoh或hcl調(diào)節(jié)，至接近時(shí)，再用0.1n的酸、堿調(diào)節(jié)。以免加入過量的水溶液，導(dǎo)致溶液體積增大，培養(yǎng)基不能很好地凝固（因加入的瓊脂量一定）。 8、分裝到大三角瓶中（500ml、1000ml）。 9、加瓊脂（6-10g/l）。常用6.6-7 g/l10、封口：用

20、棉塞或錫箔紙、牛皮紙。注明培養(yǎng)基名稱、配制時(shí)間。 或者：上接4.5、加入蔗糖。           6、加瓊脂，煮沸1-2分鐘（熔化瓊脂）。           7、定容，ph值。            8、分注到培養(yǎng)瓶中。100-150ml培養(yǎng)瓶每瓶裝入20-35ml左右的培養(yǎng)基。二） ms固體培養(yǎng)基的滅菌

21、高壓蒸汽滅菌（濕熱滅菌法） 1、洗滌：把組織培養(yǎng)基用的培養(yǎng)皿、三角瓶、試管等玻璃器皿進(jìn)行徹底清洗。自然晾干或烘箱干燥。 2、包扎：用牛皮紙、報(bào)紙、紗布或錫箔紙把玻璃器皿和金屬器械分別包扎好。 3、裝水：在高壓滅菌鍋內(nèi)裝入一定量的水（水要淹沒電熱絲）。（切忌干燒?。?4、裝物品：在滅菌鍋內(nèi)放入含培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶或三角瓶、裝蒸餾水的玻璃瓶，以及包扎好的玻璃器皿和金屬器械等。 5、滅菌：將排氣閥開著，加熱，直至鍋內(nèi)釋放出大量水蒸氣（此時(shí)水蒸氣橫向噴出），再關(guān)閉閥們；或者當(dāng)鍋內(nèi)壓力升至49.0kpa時(shí)，開啟排氣閥，將鍋內(nèi)的冷空氣全部排出。當(dāng)鍋內(nèi)壓力達(dá)到108kpa時(shí)，溫度為121時(shí)，維持15-20分鐘，

22、即可達(dá)到滅菌的目的。（若滅菌時(shí)間過長，會(huì)使培養(yǎng)基中的某些成分變性失效。）切斷電源，讓滅菌鍋?zhàn)匀焕鋮s。 注意：先打開放氣閥，再打開鍋蓋。（以免鍋內(nèi)壓力大而爆炸?。?      開蓋后應(yīng)盡快轉(zhuǎn)移培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)瓶冷卻、凝固。一般應(yīng)將滅菌后的培養(yǎng)瓶?jī)?chǔ)藏于30以下的室內(nèi)，最好儲(chǔ)藏在4-10的條件下。       某些生長調(diào)節(jié)劑如iaa、zt、aba等以及某些維生素遇熱是不穩(wěn)定的，不能同培養(yǎng)基一起高壓滅菌，而需要進(jìn)行過濾滅菌。實(shí)訓(xùn)五 無菌操作技術(shù)-外植體的消毒與接種一、目的要求 通過在超

23、凈工作臺(tái)上進(jìn)行無菌操作訓(xùn)練，使學(xué)生初步掌握組織培養(yǎng)的無菌操作技術(shù)。 二、材料與用具 1 、材料：油菜、番茄、芝麻等種子或其他培養(yǎng)材料。 2 、儀器：超凈工作臺(tái)，含 ms 培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，鑷子，培養(yǎng)皿，酒精燈，接種器械（解剖刀、剪子、鑷子等）。 3 、試劑： 70% 酒精， 95% 酒精， 0.1% 升汞或漂白粉、無菌水等。 三、方法步驟 1 、用水和肥皂洗凈雙手，穿上滅過菌的專用實(shí)驗(yàn)服、帽子與鞋子，進(jìn)入接種室。 2 、打開超凈工作臺(tái)和無菌操作室的紫外燈，照射 20 分鐘。 3 、上工作臺(tái)后，用酒精棉球擦拭雙手，然后用 70% 酒精噴霧降塵，并擦拭工作臺(tái)面。 4 、先用酒精棉球擦拭接種工具，再將

24、鑷子和剪子蘸 95% 酒精在酒精燈火焰上灼燒，放置冷卻。 5 、修整接種材料，除去不用的部分，然后進(jìn)行外植體消毒： 1）水洗，濾紙吸干。 （2） 70% 酒精中浸泡約 30-60 秒（注意：酒精穿透力很強(qiáng)，時(shí)間不宜過長，以免損傷材料組織細(xì)胞）。 （3）在 0.1% 升汞中浸泡 10 分鐘；或在 10% 漂白粉上清夜中泡 10-15 分鐘； （4）無菌水沖洗 3-5 次。 6 、接種：將種子或其他培養(yǎng)材料放到培養(yǎng)基上。 （1）先解開包口紙，將試管或培養(yǎng)瓶拿成斜角，使瓶口在酒精燈火焰上方灼燒數(shù)秒鐘。 （2）用灼燒過的冷卻的鑷子取外植體材料轉(zhuǎn)接到試管或培養(yǎng)瓶中，輕輕插入或放在培養(yǎng)基表面。 （3）接種

25、完畢后，將瓶口在火焰上轉(zhuǎn)動(dòng)灼燒，封口。 （4）操作期間應(yīng)經(jīng)常用 70% 酒精擦拭工作臺(tái)和雙手；接種器械應(yīng)反復(fù)在 95% 酒精中浸泡和火焰上灼燒滅菌。注意：雙手不能離開工作臺(tái)，不能說話、走動(dòng)或咳嗽等。 7 、接種結(jié)束后，清理和關(guān)閉超凈工作臺(tái)，并用 70% 酒精擦拭工作臺(tái)面。 實(shí)訓(xùn)六 甘薯的脫毒與快繁一、目的要求 學(xué)習(xí)和掌握甘薯的脫毒與快繁技術(shù)。 二、材料、儀器與試劑 1、材料：甘薯（ipomoea batatas l. lam）； 2、儀器：超凈工作臺(tái)、滅菌鍋、接種器械、燒杯、培養(yǎng)皿、顯微鏡、酒精燈等； 3、試劑： (1) ms培養(yǎng)基+0.10.2mg/l iaa + 0.10.2mg/l 6-ba + 3%蔗糖+