酶的組織化學(xué)課件

1、12酶組織化學(xué)反應(yīng)主要經(jīng)過兩步：酶組織化學(xué)反應(yīng)主要經(jīng)過兩步：1.1.酶促反應(yīng)，即酶催化細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)底物，酶促反應(yīng)，即酶催化細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)底物，生成無色的初級反應(yīng)底物。生成無色的初級反應(yīng)底物。2.2.顯色反應(yīng)，捕獲和偶聯(lián)。將初級反應(yīng)產(chǎn)顯色反應(yīng)，捕獲和偶聯(lián)。將初級反應(yīng)產(chǎn)物與捕獲劑反應(yīng)，經(jīng)過一步或兩步反應(yīng)物與捕獲劑反應(yīng)，經(jīng)過一步或兩步反應(yīng)生成有色的最終反應(yīng)產(chǎn)物，或?qū)⒊跫壏瓷捎猩淖罱K反應(yīng)產(chǎn)物，或?qū)⒊跫壏磻?yīng)產(chǎn)物與一些偶聯(lián)劑發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)生成應(yīng)產(chǎn)物與一些偶聯(lián)劑發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)生成有色沉淀，顯示酶活性部位。有色沉淀，顯示酶活性部位。3遵循原則：遵循原則：1.1.盡量保持組織細(xì)胞生活時的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。盡量保持組織細(xì)胞生

2、活時的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。2.2.盡量保持組織細(xì)胞生活時酶及其他成分的盡量保持組織細(xì)胞生活時酶及其他成分的活性，不影響酶的活性和分布?；钚?，不影響酶的活性和分布。3. 3. 底物和輔助劑必須迅速而同步地滲透到組底物和輔助劑必須迅速而同步地滲透到組織和細(xì)胞中去?？椇图?xì)胞中去。4. 4. 底物最好只能被一種酶催化分解。底物最好只能被一種酶催化分解。 4 5. 5. 盡量減少初級反應(yīng)產(chǎn)物在組織細(xì)胞內(nèi)盡量減少初級反應(yīng)產(chǎn)物在組織細(xì)胞內(nèi)的彌散程度。的彌散程度。 6. 6. 反應(yīng)產(chǎn)生的最終反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)是不溶于反應(yīng)產(chǎn)生的最終反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)是不溶于水的有色而穩(wěn)定的物質(zhì)，沉積于原位，其水的有色而穩(wěn)定的物質(zhì)，沉積于原位，其顏色深

3、度與物質(zhì)含量或酶活性應(yīng)有一定量顏色深度與物質(zhì)含量或酶活性應(yīng)有一定量效關(guān)系。效關(guān)系。 5 7. 7. 由于酶的活性可受到很多因素影響，由于酶的活性可受到很多因素影響，因而在酶生化方面有許多要求，以保證因而在酶生化方面有許多要求，以保證充分顯示酶的活性：充分顯示酶的活性： 最適孵育溫度（最適孵育溫度（25-3725-37。c c） 最適最適phph值值 最適底物及輔助物濃度最適底物及輔助物濃度 激活劑與抑制劑激活劑與抑制劑 6酶的組織化學(xué)方法基本原理酶的組織化學(xué)方法基本原理l沉淀反應(yīng)法沉淀反應(yīng)法 1. 1. 金屬鹽法金屬鹽法（金屬陽離子沉淀反應(yīng)）由（金屬陽離子沉淀反應(yīng)）由于酶的活性可使孵育底物分解

4、，其生成于酶的活性可使孵育底物分解，其生成的基團(tuán)可與金屬離子結(jié)合而產(chǎn)生沉淀，的基團(tuán)可與金屬離子結(jié)合而產(chǎn)生沉淀，最后在酶的活性部位生成不溶性的有色最后在酶的活性部位生成不溶性的有色金屬鹽沉淀。如金屬鹽沉淀。如鈣鈣- -鈷法顯示堿性磷酸酶。鈷法顯示堿性磷酸酶。 7 2. 2. 偶聯(lián)偶氮色素法偶聯(lián)偶氮色素法 由于酶活性可使由于酶活性可使含萘酚的底物化合物分解，其分解產(chǎn)物含萘酚的底物化合物分解，其分解產(chǎn)物可與重氮鹽結(jié)合，引起偶聯(lián)偶氮反應(yīng)，可與重氮鹽結(jié)合，引起偶聯(lián)偶氮反應(yīng)，形成不溶性的偶氮色素，以證明酶的活形成不溶性的偶氮色素，以證明酶的活性部位。性部位。 8電子傳遞法電子傳遞法 根據(jù)氧化還原的原理顯示

5、氧化酶和根據(jù)氧化還原的原理顯示氧化酶和脫氫酶。脫氫酶的作用使底物脫氫氧化，脫氫酶。脫氫酶的作用使底物脫氫氧化，脫下的氫可與作為受氫體的無色四唑鹽脫下的氫可與作為受氫體的無色四唑鹽或雙四唑鹽結(jié)合，后者被還原成甲或雙或雙四唑鹽結(jié)合，后者被還原成甲或雙甲潛紫藍(lán)色沉淀。如甲潛紫藍(lán)色沉淀。如琥珀酸脫氫酶顯示琥珀酸脫氫酶顯示方法屬于此法。方法屬于此法。9 水解酶類水解酶類 水解酶催化下列反應(yīng)水解酶催化下列反應(yīng) ： ab+hab+h2 2o ah+boho ah+boh 包括酯酶、糖苷酶、肽酶、磷酸酶等。包括酯酶、糖苷酶、肽酶、磷酸酶等。 10 堿性磷酸酶鈣堿性磷酸酶鈣- -鈷顯示法鈷顯示法 原理：原理：a

6、kpakp在有激活劑（在有激活劑（mgmg+）存在和）存在和ph9.4ph9.4時，將磷酸鹽底物分解產(chǎn)生磷酸根時，將磷酸鹽底物分解產(chǎn)生磷酸根離子，磷酸根離子被孵育液中高濃度的離子，磷酸根離子被孵育液中高濃度的鈣鹽所捕獲，在有酶活性存在處生成磷鈣鹽所捕獲，在有酶活性存在處生成磷酸鈣沉淀，再加入硝酸鈷，用酸鈣沉淀，再加入硝酸鈷，用coco2+2+置換置換 caca2+2+ ，從而生成磷酸鈷沉淀，因其無色，從而生成磷酸鈷沉淀，因其無色需通過硫化銨處理形成黑色硫化鈷顆粒需通過硫化銨處理形成黑色硫化鈷顆粒沉淀，顯示酶活性所在部位，此沉淀與沉淀，顯示酶活性所在部位，此沉淀與akpakp含量成正比。含量成正

7、比。 11 試劑配制：試劑配制： 1. 1. 作用液作用液 2%2%巴比妥鈉巴比妥鈉 5ml5ml；3%-3%-甘甘油磷酸鈉油磷酸鈉 5 ml5 ml；2%2%無水氯化鈣無水氯化鈣 10ml10ml；0.1%0.1%硫酸鎂硫酸鎂 0.5 ml0.5 ml；蒸餾水；蒸餾水 2.5 ml2.5 ml。 此液此液phph為為9.49.4，如不到，如不到9.49.4，可用，可用0.1n 0.1n naohnaoh調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)。 2. 2% 2. 2% 硝酸鈷硝酸鈷 3. 1-2% 3. 1-2% 硫化銨硫化銨 （現(xiàn)配）（現(xiàn)配）12 操作步驟操作步驟 1. 1. 新鮮組織恒冷切片，切片直接入孵育新鮮組織恒

8、冷切片，切片直接入孵育液液3737。c 10-40 c 10-40 分鐘。分鐘。 2. 2. 流水洗流水洗2 2分鐘。分鐘。 3. 2%3. 2%硝酸鈷硝酸鈷5 5分鐘。分鐘。 4. 4. 蒸餾水洗。蒸餾水洗。 5. 5. 硫化銨硫化銨3030秒秒-1-1分鐘。分鐘。 6. 6. 蒸餾水洗。蒸餾水洗。 7. 7. 甘油明膠封固。甘油明膠封固。 13堿性磷酸酶結(jié)果：結(jié)果： akpakp所在部位呈所在部位呈黑色硫化鈷沉黑色硫化鈷沉淀。淀。 146-磷酸磷酸葡萄糖酶葡萄糖酶結(jié)果結(jié)果：酶活性處酶活性處為棕黃色為棕黃色硫化鉛沉硫化鉛沉淀，細(xì)胞淀，細(xì)胞核為陰性核為陰性反應(yīng)。反應(yīng)。15 對照對照 去底物對照

9、，作用液中以蒸餾水代去底物對照，作用液中以蒸餾水代替替-甘油磷酸鈉，其他步驟同上，酶反甘油磷酸鈉，其他步驟同上，酶反應(yīng)陰性。應(yīng)陰性。 16氧化還原酶氧化還原酶催化氧化還原反應(yīng)的酶。催化氧化還原反應(yīng)的酶。17 琥珀酸脫氫酶（琥珀酸脫氫酶（sdhsdh）硝基四唑鹽法）硝基四唑鹽法 原理：原理：琥珀酸脫氫酶琥珀酸脫氫酶（sdhsdh）作用于底作用于底物琥珀酸鈉，脫下氫，以無色的硝基四唑物琥珀酸鈉，脫下氫，以無色的硝基四唑鹽為受氫體，后者獲氫后被還原為不溶于鹽為受氫體，后者獲氫后被還原為不溶于水的有色甲潛，原位沉積于酶活性部位水的有色甲潛，原位沉積于酶活性部位。 18試劑配制試劑配制 0.2m0.2m

10、磷酸緩沖液磷酸緩沖液ph7.6 5mlph7.6 5ml1 1a a液液 0.2m0.2m琥珀酸鈉琥珀酸鈉 5ml5ml b b液液 0.1%0.1%（1mg/ml1mg/ml）硝基四唑鹽）硝基四唑鹽（nitro-btnitro-bt） 10ml10ml 臨用前將兩液等量混合，調(diào)整臨用前將兩液等量混合，調(diào)整phph至至7.67.6。19 操作步驟：操作步驟： 1. 1. 新鮮組織恒冷切片，切片直接入孵育新鮮組織恒冷切片，切片直接入孵育液液3737。c 5-40c 5-40分鐘。分鐘。 2. 2. 蒸餾水洗。蒸餾水洗。 3. 3. 甘油明膠封固。甘油明膠封固。 20 琥珀酸脫氫酶琥珀酸脫氫酶 結(jié)果：結(jié)果： 酶活性部位為紫藍(lán)色顆粒沉淀。酶活性部位為紫藍(lán)色顆粒沉淀。 21 對照對照 另配一孵育液，以等量的蒸餾水代另配一孵育液，以等量的蒸餾水代替替0.2m0.2m琥珀酸鈉液，酶活性部位呈陰性。琥珀酸鈉液，酶活性部位呈陰性。 22 注意事項：注意事項： 1. 1. 取材要迅速，立即低溫冷凍，否則容取材要迅速，立即低溫