分子生物學大綱

1、 分子生物學 目錄54第一章 緒論2l 第二章 核酸的結(jié)構及性質(zhì)4l 第三章 DNA復制4l 第四章 DNA損傷與修復2l 第五章 可轉(zhuǎn)移的遺傳因子2l 第六章 RNA的轉(zhuǎn)錄與加工5 l 第七章 蛋白質(zhì)的生物合成5l 第八章 分子生物學技術8l 第九章 原核基因表達調(diào)控4l 第十章 真核基因表達調(diào)控4第一章緒論DNA Double Helix model:1953 Watson & Crick基因的基本屬性:1.基因的自我復制2.基因控制性狀的表達3.基因的突變以DNA, protein為核心 以生物化學為基礎Crick： .我本人的思想是基于兩個基本原理，我稱之為序列假說和中心法則序

2、列假說：核酸片段的特異性完全由其堿基序列所決定，而且這種序列是某一蛋白質(zhì)的氨基酸序列的密碼。中心法則：信息一旦進入蛋白質(zhì)，它就不可能再輸出分子生物學的三大原則1.構成生物大分子的單體是相同的(共同的核酸語言 、共同的蛋白質(zhì)語言)2.生物遺傳信息的表達的中心法則相同3.生物遺傳信息的表達的中心法則相同個性 高級結(jié)構 生物大分子之間的互作農(nóng)業(yè)是現(xiàn)代生物學研究與應用最為廣闊，重要的領域 第二章 核酸與染色體的結(jié)構和性質(zhì)2.1 DNA是遺傳物質(zhì) 2.1.1  轉(zhuǎn)化實驗 2.1.1.1 Griffith的發(fā)現(xiàn) 2.1.1.2 Avery等人的實驗 2.1.2 化學實驗2.2 DNA的結(jié)構2.2

3、.1  DNA的一級結(jié)構 定義：DNA的一級結(jié)構指的是DNA分子內(nèi)堿基的排列順序。2.2.2  DNA一級結(jié)構的方向性       DNA鏈的方向總是理解為從5'P端 到3'-OH端。       DNA分子總是由脫氧核糖核苷酸組成，核糖的2'位總是H。       RNA分子的核糖的2'位總是OH基。DNA一級結(jié)構的多樣性 編碼蛋白質(zhì)的遺傳信息的多樣性 用于調(diào)控的序列具有多樣性 兩種不同遺傳信

4、息的比較 相同點：都不是簡單地以其一級結(jié)構發(fā)揮作用，而依賴于與Pro的相互作用。不同點：編碼蛋白質(zhì)氨基酸組成的信息強烈依賴酶系或蛋白質(zhì)結(jié)構來進行基因表達，而調(diào)控序列不僅依靠蛋白質(zhì)作用而且利用自身的雙螺旋空間結(jié)構的改變來負責基因活性的選擇性表達。2.2.3 DNA的二級結(jié)構 3.2.3.1 定義：DNA的二級結(jié)構指的是由兩條DNA鏈反向平行盤繞所形成的雙螺旋結(jié)構。 1 每一單鏈具有 5 3極性2 兩條單鏈間以氫鍵連接3 兩條單鏈，極性相反，反向平行4 以中心為軸，向 右盤旋 (B-form)5 雙螺旋中存在大溝 (2.2nm)，小溝 (1.2nm2.2.3.2 理化特性及維持二級結(jié)構穩(wěn)定的力 主

5、鏈 堿基對 大溝和小溝 螺距2.2.3.3 DNA二級結(jié)構的基本特點 DNA分子是由兩條反向平行的脫氧核苷酸長鏈盤繞而成的。 DNA分子中的脫氧核糖和磷酸交替連接，排在外側(cè)，構成基本骨架；堿基排列在內(nèi)側(cè)。 兩條鏈上的堿基通過氫鍵結(jié)合，形成堿基對。A總是與T配對，G總是與C配對。2.2.3.4 DNA二級結(jié)構的不均一性 DNA上的回文序列（inverted repeats） DNA上的富含AT序列 嘌呤、嘧啶的排列順序?qū)﹄p螺旋穩(wěn)定性影響 2.2.3.5 DNA二級結(jié)構的多樣性 通常情況下，DNA的二級結(jié)構分為兩大類：一類是右手螺旋的，如BDNA、ADNA、C-DNA等；另一類是局部的左手螺旋，如

6、ZDNA。 天然狀態(tài)下的DNA大多為B-DNA。 1953年，Watson和Crick首次提出了DNA的反向平行雙螺旋模型，該模型所描述的就是BDNA。 其他DNA螺旋結(jié)構三螺旋DNA 四螺旋DNA2.2.4 DNA的變性和復性 2.2.4.1 呼吸作用  雙鏈DNA中配對堿基的氫鍵總是處于不停的斷裂和再生狀態(tài)之中，特別是穩(wěn)定性較低的富含A-T的區(qū)段，氫鍵的斷裂和再生更為明顯。在微觀上常常表現(xiàn)為瞬間的泡狀結(jié)構，這種現(xiàn)象稱為DNA的呼吸作用。 2.2.4.2 甲醛試驗    把標準DNA放到含有甲醛的溶液當中，發(fā)現(xiàn)隨時間推移，吸光性出現(xiàn)變化（增加），表示D

7、NA由雙鏈變成了單鏈。這是因為DNA上的NH2在甲醛作用下發(fā)生了縮醛反應，使DNA雙鏈不可逆地解開，這個過程又稱為甲醛的變性作用。 定義：雙螺旋DNA溶解成單鏈的現(xiàn)象稱為DNA變性。 DNA分子變性( DNA denaturation ) D.S. DNA S.S. DNA 加溫, 極端pH, 尿素, 酰胺變性過程的表現(xiàn) DNA粘度降低 DNA 沉降速度加快 DNA分子的A 260 nm UV 值上升核酸在260nm具有強烈的吸收峰，結(jié)構越有序，吸收的光越少。游離核苷酸比單鏈的RNA或DNA吸收更多的光，而單鏈RNA或DNA的吸收又比雙鏈DNA分子強。 2.2.4.3 增色效應、減色效應和Tm

8、值單鏈和雙鏈DNA的A260吸收值不同。以50g/mlDNA溶液測量，分別為： 雙鏈DNA   A260=1.00 單鏈DNA   A260=1.37 雙鏈DNA緩慢加熱，其溶液對紫外光的吸收值增加，叫增色效應，而單鏈DNA緩慢降溫，其對紫外光的吸收值減少，叫減色效應。 根據(jù)DNA的變性作用，以260nm紫外光吸收值與溫度變化作圖，可得到一條S形曲線，在相當狹的一個范圍內(nèi)，增色效應出現(xiàn)一個跳躍。通常以紫外吸收值達到最大值的一半時的溫度也就是DNA的堿基有50%發(fā)生變性時的溫度稱為融點Tm(melting temperature,Tm) 2.2.4.5復性

9、變性后的DNA用某種方法處理后，使之重新形成天然DNA的過程叫做復性或退火。復性是一個比較慢的過程。      1A     1B     1C     1D' .ATGA.ATGA.CCCC.ATGA. .TACT.TACT.GGGG.TACT.      1A'    1B'    1C' &

10、#160;  1D' 2.2.5 DNA的高級結(jié)構超螺旋與拓撲異構現(xiàn)象負超螺旋-拓撲異構酶/溴乙錠->松弛DNA-拓撲異構酶/溴乙錠->正超螺旋  DNA超螺旋結(jié)構 超螺旋 超螺旋，簡單地說就是螺旋的螺旋，或者我們假定雙螺旋存在一個中心軸，這條中心軸再形成螺旋。超螺旋的形成不是一個隨機過程，而是在DNA雙螺旋存在一種結(jié)構張力時才會形成。由于DNA雙螺旋的盤繞過度或不足，使DNA分子處于一種張力狀態(tài)。在封閉環(huán)狀DNA分子中這種張力不能釋放出來，就會形成超螺旋。正、負超螺旋 正超螺旋中心軸的盤繞同雙螺旋兩條鏈盤繞的方向相同，也就是同解鏈方向相反。正超螺旋使螺

11、旋更加緊密，所以把正超螺旋叫過分盤繞DNA。 負超螺旋負超螺旋能讓DNA分子通過調(diào)整雙螺旋本身的結(jié)構來減少這種張力，一般是以減少每個堿基對旋轉(zhuǎn)，即放松兩股鏈彼此的盤繞，所以把具有負超螺旋的DNA叫盤繞不足DNA。超螺旋的生物學意義 超螺旋可能有兩方面的生物學意義：1超螺旋DNA比松弛型DNA更緊密，使DNA分子體積變得更小，得以包裝在細胞內(nèi)；2超螺旋能影響雙螺旋的解鏈程度，因而影響DNA分子與其他分子，如酶、蛋白質(zhì)分子的相互作用。 DNA拓撲異構體 具有完全相同順序，而鏈環(huán)數(shù)值不同的DNA，稱為拓撲異構體。 在封閉環(huán)狀DNA 分子中鏈環(huán)數(shù)值的改變，即拓撲異構體之間的互變，只有在一條鏈或兩條鏈有

12、了缺口時才能發(fā)生，通常要有酶來催化，此種酶叫拓撲異構酶。 I型異構酶能在一股鏈上產(chǎn)生一個缺口，而II型異構酶能在兩股鏈上產(chǎn)生缺口。 2.3  染色體2.3.1 染色體概述 染色體的結(jié)構要素 1著絲粒（centromere）：細胞分裂時染色體與紡錘絲相連結(jié)的部位，為染色體的正常分離所必需。在著絲粒附近有高度重復的衛(wèi)星DNA（長約510 bp、方向相同的高度重復序列），它們不能與組蛋白結(jié)合，形成常染色質(zhì)區(qū)域。 2端粒(telomere)：真核生物線狀染色體分子末端的DNA區(qū)域 。端粒DNA的特點與功能： 有許多短的正向重復序列。 端粒的末端都有一條12-16堿基的單鏈3端突出。 端粒DN

13、A末端不能被外切核酸酶和單鏈特異性的內(nèi)切核酸酶識別。 端粒的功能：防止DNA末端降解，保證染色體的穩(wěn)定性和功能 原核：簡單，沒有核膜包圍形成真正的細胞核，核酸分子常裸露存在整個細胞中，與少量蛋白質(zhì)結(jié)合，這些蛋白質(zhì)有些與DNA的折疊有關，另外的參與DNA復制、重組和轉(zhuǎn)錄過程。真核：染色體位于細胞核的核仁內(nèi)， DNA與Pro（組與非組蛋白）完全融合，Pro/DNA的質(zhì)量比2/1。原核與真核染色體DNA比較 原核生物中一般只有一條染色體且大都帶有單拷貝基因，只有很少數(shù)基因如rRNA基因是以多拷貝形式存在； 整個染色體DNA幾乎全部由功能基因與調(diào)控序列所組成； 幾乎每個基因序列都與它所編碼的蛋白質(zhì)序列

14、呈線性對應狀態(tài)。 2.3.2 真核生物的染色體 真核生物的染色體在細胞生活周期的大部分時間里都以染色質(zhì)的形式存在。染色質(zhì)是一種纖維狀結(jié)構，稱為染色質(zhì)絲。它是由最基本的單位-核小體串聯(lián)而成的。這里有一系列的結(jié)構等級：DNA和組蛋白構成核小體，核小體再繞成一個中空的螺線管成為染色質(zhì)絲，染色質(zhì)絲再與許多非組蛋白結(jié)合進一步螺旋化形成染色體。 組成：DNA和蛋白質(zhì)。 特征： 體細胞是二倍體，性細胞是單倍體。 結(jié)構相對穩(wěn)定。 能夠自我復制。 能夠指導蛋白質(zhì)的合成。 能夠產(chǎn)生可遺傳的變異。 2.3.2.1 蛋白質(zhì) 染色體上的蛋白質(zhì)主要包括組蛋白和非組蛋白。 組蛋白是染色體的結(jié)構蛋白，它與DNA組成核小體。

15、真核生物的染色體一般有5種主要的組蛋白，分別命名為：H1、H2A、H2B、H3和H4。 在5種組蛋白中，H1富含賴氨酸，H3、H4富含精氨酸。 鳥類、魚類和兩棲類的紅細胞染色體不含H1而代之以H5。 在某些物種的精子中，染色體的結(jié)構蛋白是魚精蛋白。 非組蛋白主要包括與復制和轉(zhuǎn)錄有關的酶類、與細胞分裂有關的蛋白等。 2.3.2.2 核小體的裝配 核小體：指的是168bp長度的DNA與一組組蛋白構成的致密結(jié)構，是構成真核生物染色質(zhì)的基本單位。 裝配過程：兩分子的H3和兩分子的H4先形成四聚體，然后由H2A和H2B形成的異二聚體在該四聚體的兩側(cè)分別結(jié)合而形成八聚體。長146bp的DNA按左手螺旋盤繞

16、在八聚體上1.8周，形成核小體的核心顆粒。核心顆粒兩端的DNA各有11bp與H1結(jié)合，形成完整的核小體。 2.3.3 真核生物的基因組 基因：是指表達一種蛋白質(zhì)或功能RNA的 遺傳物質(zhì)的基本單位。 基因組  genome原核：就是它的整個染色體。 真核：一個物種單倍體染色體數(shù)目。 2.3.3.1 C值矛盾 C值：單倍體基因組中的DNA含量。 不同物種的C值有很大差異： C值矛盾c-value paradox（定義）： 在結(jié)構和功能相似的物種中，甚至在親緣關系相近的物種中，C值差異大。 在不同進化階元中，某些低等生物的C值比高等生物的C值還大。 2.3.3.2 真核生物基因組不同拷貝的

17、序列組分 單一拷貝的非重復序列  在基因組中只存在一個拷貝。 輕度重復序列  在基因組中只有2-10個拷貝，主要是組蛋白和tRNA等基因。 中度重復序列  這類序列的重復次數(shù)在數(shù)十到數(shù)百次之間。 高度重復序列  有幾百到幾百萬個拷貝。 衛(wèi)星DNA把基因組DNA切成數(shù)千個bp的片段，進行氯化銫密度梯度離心。對一個物種來說，其浮力密度曲線是一條覆蓋一定浮力密度范圍的一條寬帶，但是有些DNA片段卻含有異常高或低的G+C含量，常會在主DNA帶的附近出現(xiàn)幾條次帶，其浮力密度曲線出現(xiàn)在主帶的前面或后面。G+C含量的變化，使它們與大多數(shù)DNA具有不同的浮力密度，浮力密

18、度略重或略輕的DNA即是所謂的衛(wèi)星DNA。 衛(wèi)星DNA是一種 高度重復序列。2.3.3.3 真核生物基因組的結(jié)構特點 基因組分子量較大。 真核生物DNA常和組蛋白結(jié)合形成染色體。 DNA集中在細胞核區(qū)，轉(zhuǎn)錄在核內(nèi)，翻譯在細胞質(zhì)中。 真核生物基因組多形成斷裂基因。 真核生物DNA序列中有很多重復序列和不編碼序列。 真核生物的編碼基因常以單拷貝存在，無操縱子形式。 2.3.4 原核生物的基因組 3.3.4.1 原核生物基因組的特點 DNA是裸露的，不形成染色體。 能夠最經(jīng)濟地利用DNA序列，除控制區(qū)域外，很少有不編碼的DNA序列。 原核生物把功能相關的一系列基因高度集中在一起，形成一個操縱子。 基

19、因組中幾乎沒有重復序列。 原核生物由于沒有細胞核，轉(zhuǎn)錄和翻譯是同步進行的。 2.3.4.2 幾種原核生物的基因組 x174 5386bp   11個基因  3個操縱子 5'.GAAGGAGUGAUGUAAUGUCUAAAG.3' x174的mRNA的一段序列 5'.GAAGGAGUGAUGUAA.3'          基因DmRNA的3'端序列 5'.AUGUCUAAA.    基因JmRNA的3

20、'端序列 5'.GAAGGAGUGA.3'       基因EmRNA的3'端序列 E.Coli 4.6*106bp 噬菌體  48502bp 基因與基因概念的發(fā)展 基因是生物體遺傳信息的基本單位，其本質(zhì)是DNA（有的生物基因組是RNA），簡單的說，基因是合成一種功能蛋白或RNA分子所必須的全部DNA（RNA）序列。原核生物和真核生物的基因有較大的不同，一個典型的真核基因包括：編碼序列外顯子；插入外顯子之間的非編碼序列內(nèi)合子；5-端和3-端非翻譯區(qū)(UTR)；調(diào)控序列（可位于上述三種

21、序列中）。原核生物與真核生物的基因比較：1.真核生物除配子外，染色體成對，所以同源DNA分子兩個；原核生物只有一個DNA（RNA）分子；2.真核生物基因轉(zhuǎn)錄為單順反子；原核生物基因具有操縱子結(jié)構，轉(zhuǎn)錄為多順反子；3.真核生物DNA重復順序較多；原核一般不具重復序列；4.真核生物基因非編碼區(qū)部分大于編碼區(qū)部分，無基因重疊現(xiàn)象；原核生物基因編碼區(qū)部分大于非編碼區(qū)部分，基因有重疊現(xiàn)象；5.真核生物有內(nèi)含子（不連續(xù)基因或者斷裂基因）；原核生物一般無；6.真核生物DNA復制多起點；原核生物DNA復制單起點。基因概念的發(fā)展 1移動基因（跳躍基因）2斷裂基因3假基因是一種核苷酸序列同其相應的正常功能基因基本

22、相同，但卻不能表達或者表達異常，不能產(chǎn)生有功能的基因產(chǎn)物的失活基因。 4重疊基因2.4 RNA核酸是生物體內(nèi)重要的高分子化合物，它儲存著生物體全部遺傳信息。除DNA外，在生物體內(nèi)還存在著另一種核酸RNA。RNA有許多種類，它們具有不同的生物功能。2.4.1 RNA分子的結(jié)構特點RNA通常是單鏈 RNA分子核苷酸中的糖是核糖而不是脫氧核糖 4種堿基中沒有胸腺嘧碇，而有尿嘧啶 2.4.2 RNA的種類 細胞含量最多的幾類RNA分子主要的生物功能是參與蛋白質(zhì)的生物合成。 第一類RNA分子叫做信使RNA（mRNA）它的生物學功能是從DNA上把遺傳密碼即蛋白質(zhì)中氨基酸排列順序的信息接受過來，并起模板作用

23、來合成蛋白質(zhì)。一般來講，一種蛋白質(zhì)就有一種與之相對應的mRNA分子，但有的mRNA分子可以翻譯出幾條蛋白質(zhì)分子。mRNA在代謝上是不穩(wěn)定的。 第二類是轉(zhuǎn)運RNA（tRNA）。生物體內(nèi)存在著與20種氨基酸對應的tRNA分子。它們在代謝上也是穩(wěn)定的，在蛋白質(zhì)的生物合成過程中起接受、轉(zhuǎn)運和摻入氨基酸的作用。 第三類是核糖體RNA（rRNA）。原核生物有三種rRNA（5srRNA16srRNA23srRNA）,真核生物有4種（5s,5.8s,18s和28srRNA）。這些RNA分子在代謝上十分穩(wěn)定，是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成的“機器”核糖體的重要成分。 上述三類RNA都存在于細胞質(zhì)中，它們行使生物學功能的主

24、要場所在核糖體上。 在真核生物的線粒體和葉綠體里存在著獨立的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，也有這幾類RNA分子，但是其大小和結(jié)構和細胞質(zhì)中的不完全相同。 此外生物體內(nèi)還存在著多種具有特定生物功能的RNA分子，例如，參與起動DNA復制的引物RNA，在某些腫瘤病毒中存在著一些類似tRNA的分子是逆轉(zhuǎn)錄酶的引物，參與DNA的合成。在某些細菌中有的tRNA分子在細胞壁合成時是甘氨酸的載體。還有一些RNA分子是一些酶活性不可缺少的組成成分，例如兔肌1，4-2-匍聚糖分枝酶含有31個核苷酸的2.8sRNA分子，特異性地作用于tRNA前體的RNAaseP中有77%的成份是核糖核酸酶。真核細胞的核內(nèi)還存在著許多小分子RNA

25、（snRNA）,其大小從4S到8S不等，大約由80260個核苷酸構成其中有些snRNA在RNA成熟過程式中起重要作用。 另外，還有一些染色質(zhì)結(jié)合的RNA（chRNA）其生物學功能尚不清。 2.4.3 前體RNA絕大多數(shù)RNA分子都是在細胞核內(nèi)合成的。 核內(nèi)存在著各種RNA的前體，例如tRNA前體、rRNA前體和mRNA。 這些前體RNA的分子量要比對應成熟的RNA的大得多。例如哺乳動物肝細胞的rRNA的前體是45s細胞核RNA（nRNA），在成熟過程中產(chǎn)生41snRNA，32snRNA和20snRNA等中間物，最后相應地成為28s、5.8s和18sRNA。前體RNA都是由細胞核DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的

26、，經(jīng)過剪切、裝配和修飾成為成熟的tRNA、rRNA和mRNA，進入細胞質(zhì)各自行使其生物功能有人把在細胸核內(nèi)合成后離開細胞核去行使生物功能的RNA分子稱作遷移性RNA（Migrating RNA）,而把始終存在于細胞核內(nèi)的稱作非遷移性RNA（Nonmigrating RNA）。 第三章 DNA的復制定義：親代雙鏈DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分別以每單鏈 DNA分子為模板，聚合與自身堿基可以互補配對的游離的dNTP, 合成出兩條與親代DNA分子完全相同的子代DNA分子的過程。3.1 DNA復制的基本機理 DNA由兩條螺旋的多核苷酸鏈組成，兩條鏈的堿基通過A:T和G:C之間的氫鍵聯(lián)結(jié)在一起。在

27、復制過程中首先兩條鏈間的氫鍵破裂并使雙鏈解旋和分開，然后以每條鏈為模板，按堿基互補配對原則(A:T，G:C)，由DNA聚合酶催化合成新的互補鏈，結(jié)果由一條鏈成為互補的兩條鏈，這樣新形成的兩個DNA分子與原來的DNA分子的堿基序列完全相同。在此過程中，每個子代DNA的一條鏈來自親代DNA，另一條鏈則是新合成的。這種復制方式稱此過程中，每個子代DNA的一條鏈來自親代的DNA，另一條鏈則是新合成的。這種復制方式稱為半保留復制(semi conservative replication)。 1958年Meselson和Stahl的實驗首次有力地支持了半保留復制方式。他們先將大腸桿菌放在15NH4C1培

28、養(yǎng)基中生長15代，使幾乎所有的DNA都被15N標記后，再將細菌移到只含有14NH4C1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。隨后，在不同的時間取出樣品，用十二烷硫酸鈉(SDS)裂解細胞后，將裂解液放在CsC1溶液中進行密度梯度離心(140000g，20小時)。離心結(jié)束后，從管底到管口，溶液密度分布從高到低形成密度梯度。DNA分子就停留在與其相當?shù)腃sC1密度處，在紫外光下可以看到形成的區(qū)帶。14N-DNA分子密度較輕(1.7g/cm3)，停留在離管口這較近的位置;15N-DNA密度較大停留在較低的位置上。 當含有15N-DNA的細胞在14NH4C1培養(yǎng)液中培養(yǎng)一代后，只有一條區(qū)帶介于14N-DNA與15N-DNA之

29、間，這時在15N-DNA區(qū)已沒有吸收帶，說明這時的DNA一條鏈來自15N-DNA，另一條鏈為新合成的含有14N的新鏈。培養(yǎng)兩代后則在14N-DNA區(qū)又出現(xiàn)一條帶。在14NH4C1中培養(yǎng)的時間愈久，14N-DNA區(qū)帶愈強，而14N-15NDNA區(qū)帶逐漸減弱，但始終未出現(xiàn)其他新的區(qū)帶。按照半保留復制方式培養(yǎng)兩代，只能出現(xiàn)14N-15NDNA兩種分子，而且隨著代數(shù)的增加14N-DNA逐漸增加。Meselson和Stahl的實驗完全證實了保留復制的設想。  復制起點和復制子DNA復制在生物細胞中要從DNA分子上特定位置開始。這個特定的位置就稱為復制起點(Origin of replicati

30、on)，用ori表示。DNA復制從起點開始雙向進行直到終點為止，每一個這樣的DNA單位稱為復制子或復制單元(replicon)。 在原核生物中，每個DNA分子上通常只有一個復制子 而在真核生物中，每個DNA分子有許多個復制子，每個復制子長約50-200kb。因此，真核細胞DNA的復制是由許多個復制子共同完成的 既然DNA復制不是隨機的從DNA分子上的任何一點起始，而是從特定的區(qū)域開始，這說明復制起點有其結(jié)構上的特殊性。如科學家們利用分子克隆技術，分離出大腸桿菌染色體DNA復制起點oriC，發(fā)現(xiàn)其含有3個13bp的串聯(lián)重復保守序列和4個9bp的保守序列DNA復制的特點DNA復制的最主要特點是半保

31、留復制另外，它還是半不連續(xù)復制半不連續(xù)復制DNA雙螺旋的兩條鏈是反向平行的，因此，在復制起點處兩條DNA鏈解開成單鏈時，一條是5'3'方向，另一條是3'5'方向。以這兩條鏈為模板時，新生鏈延伸方向一條為3'5'，另一條為5'3'。但生物細胞內(nèi)所有催化DNA聚合酶都只能催化5'3'延伸，這是一個矛盾。岡崎片段(Okaxaki fragments)的發(fā)現(xiàn)使這個矛盾得以解決。 在復制起點兩條鏈解開形成復制泡(replication bubbles)，DNA向兩側(cè)復制形成兩個復制叉(replication forks)。以

32、復制叉移動的方向為基準，一條模板鏈是3'5'，以此為模板而進行的新生DNA鏈的合成沿5'3'方向連續(xù)進行，這條鏈稱為前導鏈(leading strand)。另一條模板鏈的方向為5''3'，以此為模板的DNA合成也是沿5'3'方向進行，但與復制叉前進的方向相反，而且是分段，不連續(xù)合成的，這條鏈稱為滯后鏈(lagging strand)，合成的片段即為岡崎片段。這些岡崎片段以后由DNA連接酶連成完整的DNA鏈。這種前導鏈的連續(xù)復制和滯后鏈的不連續(xù)復制在生物是普遍存在的，稱為DNA合成的半不連續(xù)復制。 復制的多模式 1單起點、單

33、方向 2多起點、單方向 3單起點、雙方向 4多起點、雙方向3.2 DNA復制的過程DNA復制過程大致可以分為復制的引發(fā)，DNA鏈的延伸和DNA復制的終止三個階段。(一)DNA復制的引發(fā)復制的引發(fā)(Priming)階段包括DNA復制起點雙鏈解開，通過轉(zhuǎn)錄激活步驟合成RNA分子RNA引物的合成，DNA聚合酶將第一個脫氧核苷酸加到引物RNA的3-OH末端。復制引發(fā)的關鍵步驟就是前導鏈DNA的合成，一旦前導鏈DNA的聚合作用開始，滯后鏈上的DNA合成也隨著開始，在所有前導鏈開始聚合之前有一必需的步驟就是由RNA聚合酶(不是引物酶)沿滯后鏈模板轉(zhuǎn)錄一短的RNA分子在有些DNA復制中，(如質(zhì)粒ColE)，

34、該RNA分子經(jīng)過加工成為DNA復制的引物。但是，在大部分DNA復制中，該RNA分子沒有引物作用。它的作用似乎只是分開兩條DNA鏈，暴露出某些特定序列以便引發(fā)體與之結(jié)合，在前導鏈模板DNA上開始合成RNA引物，這個過程稱為轉(zhuǎn)錄激活(transcriptional activation)，在前導鏈的復制引發(fā)過程中還需要其他一些蛋白質(zhì)，如大腸桿菌的dnaA蛋白。這種蛋白質(zhì)可以和復制起點處DNA上高度保守的4個9bp長的序列結(jié)合，其具體功能尚不清楚?？赡苁沁@些蛋白質(zhì)與DNA復制起點結(jié)合后能促進DNA聚合酶復合體的七種蛋白質(zhì)在復制起點處裝配成有功能的全酶DNA復制開始時，DNA螺旋酶首先在復制起點處將雙

35、鏈DNA解開，通過轉(zhuǎn)錄激活合成的RNA分子也起分離兩條DNA鏈的作用，然后單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB蛋白)結(jié)合在被解開的鏈上。 由復制因子X(n蛋白)，復制因子Y(n'蛋白)，n"蛋白，i蛋白，dnaB蛋白和dnaC蛋白等6種蛋白質(zhì)組成的引發(fā)前體(preprimosome)，在單鏈DNA結(jié)合蛋白的作用下與單鏈DNA結(jié)合生成中間物，這是一種前引發(fā)過程。 引發(fā)前體進一步與引物酶(primase)or引發(fā)酶組裝成引發(fā)體(primosome)。引發(fā)體可以在單鏈DNA上移動，在dnaB亞基的作用下識別DNA復制起點位置。首先在前導鏈上由引物酶催化合成一段RNA引物，然后，引發(fā)體在滯后鏈

36、上沿5'3'方向不停的移動(這是一種相對移動，也可能是滯后鏈模板在移動，見后)，在一定距離上反復合成RNA引物供DNA聚合酶合成岡崎片段使用，引發(fā)體中許多蛋白因子的功能尚不清楚。 但是，這些成份必須協(xié)同工作才能使引發(fā)體在滯后鏈上移動，識別合適的引物合成位置，并將核苷酸在引發(fā)位置上聚合成RNA引物由于引發(fā)體在滯后鏈模板上的移動方向與其合成引物的方向相反，所以在滯后鏈上所合成的RNA引物非常短，一般只有3-5個核苷酸長。而且，在同一種生物體細胞中這些引物都具有相似的序列，表明引物酶要在DNA滯后鏈模板上比較特定的位置(序列)上才能合成RNA引物。 為什么需要有RNA引物來引發(fā)DNA

37、復制呢?這可能盡量減少DNA復制起始處的突變有關。DNA復制開始處的幾個核苷酸最容易出現(xiàn)差錯，因此，用RNA引物即使出現(xiàn)差錯最后也要被DNA聚合酶切除，提高了DNA復制的準確性。RNA引物形成后，由DNA聚合酶催化將第一個脫氧核苷酸按堿基互補原則加在RNA引物3'-OH端而進入DNA鏈的延伸階段。 (二)DNA鏈的延伸DNA新生鏈的合成由DNA聚合酶所催化，然而，DNA必須由螺旋酶在復制叉處邊移動邊解開雙鏈。這樣就產(chǎn)生了一種拓撲學上的問題:由于DNA的解鏈，在DNA雙鏈區(qū)勢必產(chǎn)生正超螺旋，在環(huán)狀DNA中更為明顯，當達到一定程度后就會造成復制叉難再繼續(xù)前進，從而終止DNA復制。 但是，在

38、細胞內(nèi)DNA復制不會因出現(xiàn)拓撲學問題而停止。有兩種機制可以防止這種現(xiàn)象發(fā)生: 1DNA在生物細胞中本身就是超螺旋，當DNA解鏈而產(chǎn)生正超螺旋時，可以被原來存在的負超螺旋所中和; 2DNA拓撲異構酶要以打開一條鏈，使正超螺旋狀態(tài)轉(zhuǎn)變成松弛狀態(tài)，而DNA拓撲異構酶(旋轉(zhuǎn)酶)可以在DNA解鏈前方不停地繼續(xù)將負超螺旋引入雙鏈DNA。 這兩種機制保證了無論是環(huán)狀DNA還是開環(huán)DNA的復制順利的解鏈，再由DNA聚合酶合成新的DNA鏈。 前已述及DNA生長鏈的延伸主要由DNA聚合酶催化，該酶是由7種蛋白質(zhì)(多肽)組成的聚合體，稱為全酶。全酶中所有亞基對完成DNA復制都是必需的。亞基具有聚合功能和5'

39、3'外切酶活性，亞基具有3'5'外切酶活性。另外，全酶中還有ATP分子它是DNA聚合酶催化第一個脫氧核糖核苷酸連接在RNA引物上所必需的，其他亞基的功能尚不清楚。 在DNA復制叉處要能由兩套DNA聚合酶在同一時間分別進行DNA前導鏈和滯后鏈復制。如果滯后鏈模板環(huán)繞DNA聚合酶全酶，并通過DNA聚合酶，然后再折向與未解鏈的雙鏈DNA在同一方向上，則滯后鏈的合成可以和前導鏈的合成在同一方向上進行。這樣，當DNA聚合酶沿著滯后鏈模板移動時，由特異的引物酶催化合成的RNA引物即可以由DNA聚合酶所延伸。當合成的DNA鏈到達前一次合成的岡崎片段的位置時，滯后鏈模板及剛合成的岡崎片

40、斷便從DNA聚合酶上釋放出來。 這時，由于復制叉繼續(xù)向前運動，便產(chǎn)生了又一段單鏈的滯后鏈模板，它重新環(huán)繞DNA聚合酶全酶，并通過DNA聚合酶開始合成新的滯后鏈岡崎片段。通過這樣的機制，前導鏈的合成不會超過滯后鏈太多(最后只有一個岡崎片段的長度)。而且，這樣引發(fā)體在DNA鏈上和DNA聚合酶以同一速度移動。 這時，由于復制叉繼續(xù)向前運動，便產(chǎn)生了又一段單鏈的滯后鏈模板，它重新環(huán)繞DNA聚合酶全酶，并通過DNA聚合酶開始合成新的滯后鏈岡崎片段。通過這樣的機制，前導鏈的合成不會超過滯后鏈太多(最后只有一個岡崎片段的長度)。而且，這樣引發(fā)體在DNA鏈上和DNA聚合酶以同一速度移動。 在DNA合成延伸過程

41、中主要是DNA聚合酶的作用。當岡崎片段形成后，DNA聚合酶通過其5'3'外切酶活性切除岡崎片段上的RNA引物，同時，利用后一個岡崎片段作為引物由5'3'合成DNA。最后兩個岡崎片段由DNA連接酶將其接起來，形成完整的DNA滯后鏈。(三)DNA復制的終止過去認為，DNA一旦復制開始，就會將該DNA分子全部復制完畢，才終止其DNA復制。但最近的實驗表明，在DNA上也存在著復制終止位點，DNA復制將在復制終止位點處終止，并不一定等全部DNA合成完畢。 但目前對復制終止位點的結(jié)構和功能了解甚少,在DNA復制終止階段令人困惑的一個問題是，線性DNA分子兩端是如何完成其復制

42、的? 已知DNA復制都要有RNA引物參與。當RNA引物被切除后，中間所遺留的間隙由DNA聚合所填充。但是，在線性分子的兩端以5'3'為模板的滯后鏈的合成，其末端的RNA引物被切除后是無法被DNA聚合酶所填充的在研究T7DNA復制時，這個問題部分地得到了解決。T7DNA兩端的DNA序列區(qū)有160bp長的序列完全相同。而且，在T7DNA復制時，產(chǎn)生的子代DNA分子不是一個單位T7DNA長度，而是許多單位長度的T7DNA首尾連接在一起。T7DNA兩個子代DNA分子都會有一個3'端單鏈尾巴，兩個子代DNA的3'端尾巴以互補結(jié)合形成兩個單位T7DNA的線性連接。然后由DN

43、A聚合酶填充和DNA連接酶連接后，繼續(xù)復制便形成四個單位長度的T7DNA分子。這樣復制下去，便可形成多個單位長度的T7DNA分子。這樣的T7DNA分子可以被特異的內(nèi)切酶切開，用DNA聚合酶填充與親代DNA完全一樣的雙鏈T7DNA分子。在研究痘病毒復制時，發(fā)現(xiàn)了線性DNA分子完成末端復制的第二種方式。痘病毒DNA在兩端都形成發(fā)夾環(huán)狀結(jié)構。DNA復制時，在線性分子中間的一個復制起點開始，雙向進行，將發(fā)夾環(huán)狀結(jié)構變成雙鏈環(huán)狀DNA。然后，在發(fā)夾的中央將不同DNA鏈切開，使DNA分子變性，雙鏈分開。這樣，在每個分子兩端形成一個單鏈尾端要以自我互補，形成完整的發(fā)夾結(jié)構，與親代DNA分子一樣。 v 在真核

44、生物染色體線性DNA分子復制時，尚不清楚末端的復制過程是怎樣進行的。也可能像痘病毒那樣形成發(fā)夾結(jié)構而進行復制。 但最近的實驗表明，真核生物染色體末端DNA復制是由一種特殊的酶將一個新的末端DNA序列加在剛剛完成復制的DNA末端。這種機制首先在四膜蟲中發(fā)現(xiàn)。該生物細胞的線性DNA分子末端有30-70拷貝的5'TTGGGG3'序列，該細胞中存在一種酶可以將TTGGGG序列加在事先已存在的單鍵DNA末端的TTGGGG序列上。這樣有較長的末端單鏈DNA，可以被引物酶重新引發(fā)或其他的酶蛋白引發(fā)而合成RNA引物，并由DNA聚合酶將其變成雙鏈DNA。這樣就可以避免其DNA隨著復制的不斷進行而

45、逐漸變短。 在環(huán)狀DNA的復制的末端終止階段則不存在上述問題。環(huán)狀DNA復制到最后，由DNA拓撲異構酶切開雙鏈DNA，將兩個DNA分子分開成為兩個完整的與親代DNA分子一樣的子代DNA。3.3 與復制有關的酶和蛋白質(zhì)3.3.1 DNA復制的復雜性復制過程解鏈需要能量供應如何維持單鏈過程DNA復制要求高度真實超螺旋的問題不同生物復制機制不同線性DNA復制過程如何解決最后一個引物是怎樣切除的復制體：復制叉上DNA模板以特定的結(jié)構與酶和蛋白質(zhì)偶聯(lián)成的核蛋白復合物。  3.3.2 原核生物DNA復制的酶學v 3.3.2.1 DNA聚合酶 v 3.3.2.2 引物酶和RNA聚合酶 v 3.3.

46、2.3 解螺旋酶 v 3.3.2.4 單鏈結(jié)合蛋白（SSBP） v 3.3.2.5 依賴于DNA的ATP酶 v 3.3.2.6 DNA連接酶 v 3.3.2.7 旋轉(zhuǎn)酶 3.3.2.1 DNA聚合酶v 以E.coliDNA聚合酶 為例v （1）大腸桿菌DNA聚合酶(DNApolymerase，DNApol)v （2）大腸桿菌DNA聚合酶(DNApol)：（3）大腸桿菌DNA聚合酶(DNApolv DNA聚合酶    主要負責DNA損傷的修復和岡崎片段之間間隙的填補。 v 用枯草桿菌蛋白酶處理DNA聚合酶 可得兩個片段，大片段分子量76kd，被叫作klen

47、ow片段，廣泛用于DNA序列分析中。 5'3'聚合活性  要求有雙鏈DNA模板和具有3'羥基的引物，活性很高，可達1000核苷酸/min。3'5'外切活性  可以對不配對的局部單鏈進行識別，切除不配對堿基，又稱“校正功能”。 5'3'外切活性  主要功能是切除復制過程中的引物。pol的5'3'外切活性有三個特點： a. 必須有5'-P末端。 b.被切除的核苷酸必須是氫鍵配對的。 c.可以切除脫氧核糖核苷酸，也可以切除核糖核苷酸。（二）.大腸桿菌DNA聚合酶(DNApol)：(1)聚合作

48、用:該酶催化DNA的聚合，但是對模板有特殊的要求。該酶的最適模板是雙鏈DNA而中間有空隙(gap)的單鏈DNA部份，而且該單鏈空隙部份不長于100個核苷酸。(2)該酶也具有3'5'外切酶活性，但無5'3'外切酶活性。(3)該酶對作用底物的選擇性較強，一般只能將2-脫氧核苷酸摻入到DNA鏈中。(4)該酶不是復制的主要聚合酶，因為此酶缺陷的大腸桿菌突變株的DNA復制都正常?？赡茉贒NA的損傷修復中該酶起到一定的作用。  （三） DNA聚合酶（四）   pol是體內(nèi)DNA復制的主要承擔者，是復制的主要酶類。全酶由多亞基組成.其中、三種亞基組成核心酶

49、，其它為輔助蛋白。 3.3.2.2 引物酶和RNA聚合酶引物酶：用于合成引物的酶。 利福平：抑制RNA的轉(zhuǎn)錄，使細菌無法繁殖。用利福平處理發(fā)現(xiàn)：先導鏈不能合成，而后隨鏈能合成。 3.3.2.3 解螺旋酶3.3.2.4 單鏈結(jié)合蛋白（SSBP）SSB沒有催化功能，它可以特異性地結(jié)合在單鏈區(qū)，使之免被核酸酶水解，起到保護和維持單鏈的作用。 3.3.2.5 依賴于DNA的ATP酶3.3.2.6 DNA連接酶用于連接3-OH和5-P,形成一個磷酸二酯鍵。3.3.2.7 旋轉(zhuǎn)酶v 用于消除正超螺旋，恢復負超螺旋結(jié)構，需要ATP供能。 3.3.3 真核生物DNA復制的酶學3.3.3.1 真核生物DNA聚合

50、酶v 真核生物中發(fā)現(xiàn)有5種DNA聚合酶，分別是：、。 v DNA聚合酶 是DNA復制的主要酶類，由4個亞基組成。原因是： 所有強烈抑制酶的抑制劑都能抑制細胞的復制。 酶的溫度敏感突變株使該細胞的DNA復制成呈溫度敏感型。 顯微注射酶的抗體可以抑制DNA的復制。 酶 的活性隨細胞周期而變化，S期活性最高。 DNA聚合酶具有3'5'外切酶活性，對于復制的真實性十分重要。同是也是前導鏈合成的主要酶類。 目前認為：酶 和酶都是真核DNA復制酶。酶在復制中合成前導鏈，酶合成后滯鏈。 3.3.3.2 真核生物DNA解旋酶 3.3.3.3 真核生物端聚酶v 用于復制染色體末端的序列

51、。實際上是一種逆轉(zhuǎn)錄酶。 3.4 DNA復制的幾種形式3.4.1 線性DNA雙鏈的復制線性DNA先在ori處形成復制泡，從復制眼開始可以單向或雙向復制，真核生物都是多復制泡起始的雙向復制。 4.2.2 型復制環(huán)形DNA大多采用型復制，如E.coli。 特點：從原點ori開始，通常采用雙向等速復制，不斷擴大復制泡，形成環(huán)。3.4.3 滾環(huán)型復制某些環(huán)形的病毒DNA，如x174、噬菌體都是以這種方式復制。 這是一種單向復制類型。 3.4.4 D-環(huán)型（D-loop)動物線粒體DNA的復制方式。單向復制3.5 DNA復制的調(diào)控4.5.1 大腸桿菌DNA復制的調(diào)控v 原核生物DNA鏈的延伸速度是恒定的

52、。 v 與生長、增殖相配合協(xié)調(diào)的DNA的合成，主要依靠復制叉數(shù)量的不同。 v 迅速分裂的細胞具有較多的復制叉，分裂緩慢的細胞復制叉較少。 v 細胞復制叉的多少取決于復制起始的頻率，這是原核細胞復制的調(diào)控點。 v 復制子的調(diào)控由復制起始因子和起始位點兩部分組成。E.coli的起始位點主要是oriC，與蛋白相互作用來啟動復制。主要的起始因子有dnaA、dnaH等蛋白質(zhì)，它們通過與始位點形成復合物相互作用，確定復制的起始頻率。 v 研究發(fā)現(xiàn)：dnaA對復制起正調(diào)控作用。 4.5.2 真核生物DNA復制的調(diào)控v 真核細胞中DNA復制有三個調(diào)控點： 細胞生活周期水平的調(diào)控 真核細胞的生活周期： G1：復

53、制預備期 S：復制期G2：有絲分裂準備期 M：為有絲分裂期。DNA復制只發(fā)生在S期染色體水平的調(diào)控復制子水平的調(diào)控第四章 DNA的損傷與修復4.1 基因突變基因突變：可以通過復制而遺傳的DNA結(jié)構的永久性改變。 4.1.1 點突變v DNA分子最常發(fā)生的點突變是堿基置換和移碼突變兩種。 v 一種堿基被另一種堿基所替代稱為替換。 v 有兩種形式的替換：轉(zhuǎn)換（transition）和顛換(transversion)。 v 轉(zhuǎn)換指的是一種嘌呤替換另一種嘌呤，或一種嘧啶替換另一種嘧啶。 v 顛換指的是嘌呤替換嘧啶或嘧啶替換嘌啶。 v 替換會引起單個密碼子發(fā)生改變。 表4-1 正常血紅蛋白與鐮刀形血紅蛋

54、白的DNA變化和氨基酸差異鏈上5、6、7氨基酸的核苷酸密碼正常         脯       谷      谷        GGA      CTC      GGA鐮刀形         脯&#

55、160;        纈        谷        GGA       CAC      GGA移碼突變 v 在DNA的堿基序列中插入一個或幾個堿基，或失去一個或幾個堿基，使全部密碼發(fā)生了變化，稱為移碼突變(frameshift mutaion)。v 移碼突變常常導致生物的死亡。 4.1.2 染色體突變涉及到染色體較大區(qū)

56、域的突變，主要形式有重復、丟失、倒位和易位等。 4.1.3 基因組突變涉及以基因組為單位的變化，以致影響染色體的數(shù)量 4.2   DNA的損傷DNA損傷是在某些因素作用下，DNA的結(jié)構和功能發(fā)生改變，阻礙DNA的復制與轉(zhuǎn)錄，DNA的這種變化稱DNA的損傷4.2.1 DNA損傷的原因4.2.1.1 DNA分子的自發(fā)性損傷1、DNA復制中的錯誤 DNA復制中的錯配率約在10-10左右，即每復制1010個核苷酸大概會有一個堿基的錯誤。 2、DNA的自發(fā)性化學變化   生物體內(nèi)DNA分子可以由于各種原因發(fā)生變化，至少有以下類型：堿基的異構互變  DNA中的4種堿

57、基各自的異構體間都可以自發(fā)地相互變化（例如烯醇式與酮式堿基間的互變）。 這種變化會使堿基的配對性質(zhì)發(fā)生改變，可使腺嘌呤能配上胞嘧啶、胸腺嘧啶能配上鳥嘌呤等，如果這些配對發(fā)生在DNA復制時，就會造成子代DNA序列與親代DNA不同的錯誤性損傷。 堿基的脫氨基作用  堿基的環(huán)外氨基有時會自發(fā)脫落，從而胞嘧啶會變成尿嘧啶、腺嘌呤會變成次黃嘌呤（H）、鳥嘌呤會變成黃嘌呤（X）等，遇到復制時，U與A配對、H和X都與C配對就會導致子代DNA序列的錯誤變化。胞嘧啶自發(fā)脫氨基的頻率約為每個細胞每天190個。 脫嘌呤與脫嘧啶  自發(fā)的水解可使嘌呤和嘧啶從DNA鏈的核糖磷酸骨架上脫落下來。一個哺

58、乳類細胞在37條件下，20h內(nèi)DNA鏈上自發(fā)脫落的嘌呤約1000個、嘧啶約500個；估計一個長壽命不復制繁殖的哺乳類細胞（如神經(jīng)細胞）在整個生活期間自發(fā)脫嘌呤數(shù)約為108，這占細胞DNA中總嘌呤數(shù)約3%。 堿基修飾與鏈斷裂  細胞呼吸的副產(chǎn)物O2-、H2O2等會造成DNA損傷，能產(chǎn)生胸腺嘧啶乙二醇、羥甲基尿嘧啶等堿基修飾物，還可能引起DNA單鏈斷裂等損傷，每個哺乳類細胞每天DNA單鏈斷裂發(fā)生的頻率約為5萬次。 4.2.1.2 物理因素引起的DNA損傷v 射線引起的DNA損傷是最引人注意的。 1、紫外線引起的DNA損傷 DNA分子損傷最早就是從研究紫外線的效應開始的。當DNA受到最易被

59、其吸收波長（260nm）的紫外線照射時，同一條DNA鏈上相鄰的嘧啶會以共價鍵連成二聚體，相鄰的兩個T、或兩個C、或C與T間都可以環(huán)丁基環(huán)（cyclobutane ring）連成二聚體，其中最容易形成的是TT二聚體. 人皮膚因受紫外線照射而形成二聚體的頻率可達每小時5× 104/細胞，但只局限在皮膚中，因為紫外線不能穿透皮膚。但微生物受紫外線照射后，就會影響其生存。紫外線照射還能引起DNA鏈斷裂等損傷。 2、 電離輻射引起的DNA損傷   電離輻射損傷DNA有直接和間接的效應，直接效應是DNA直接吸收射線能量而遭受損傷，間接效應是指DNA周圍的其他分子（主要是水分子）吸收射線能量產(chǎn)生