染菌的檢查、分析和防止措施

1、染菌的檢查、原因分析和防止措施1. 染菌的檢查與判斷在發(fā)酵過程中對雜菌污染的及早發(fā)現(xiàn)，及時(shí)處理，是免除染菌造成嚴(yán)重?fù)p 失的重要問題。因此，要求有確切、迅速的方法來檢出雜菌的污染，目前常用方 法主要有以下幾種：1顯微鏡檢查通常用革蘭氏染色法，染色后在高倍顯微鏡下觀察。對霉菌、酵母發(fā)酵， 先用低倍顯微鏡觀察生產(chǎn)菌的特征， 然后再用高倍顯微鏡觀察有否染菌存在， 根 據(jù)生產(chǎn)菌與雜菌的特征區(qū)別，判斷是否染菌。必要時(shí)，可進(jìn)行芽抱和鞭毛染色。2平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法先將經(jīng)滅菌的固體培養(yǎng)基倒入滅菌的平板中置培養(yǎng)箱攝氏37度，保溫24h檢查無菌即可使用。將需要檢查的樣品，在無菌平板上劃線，分別置攝氏 37

2、度、攝氏27度培養(yǎng)，以適應(yīng)嗜中菌和低溫菌的生長， 一般在8h后即可觀察。噬菌體檢查可采用雙層平板培養(yǎng)法， 底層同為肉汁瓊脂培養(yǎng)基，上層減少 瓊脂用量。先將滅菌的底層培養(yǎng)基熔后倒平板，凝固后，將上層培養(yǎng)基熔解并保 持?jǐn)z氏40度，加生產(chǎn)菌作為指示菌和待檢樣品混合后迅速倒在底層平板上，置 培養(yǎng)箱保溫培養(yǎng)，經(jīng)1220h培養(yǎng)，觀察有無噬菌斑。培養(yǎng)基 PH7.0葡萄糖%牛肉膏%蛋白胨%氯化鈉%瓊脂%上層0.51.01.00.51.0下層0.51.01.00.52.03 肉湯培養(yǎng)檢查法將需要檢查樣品接入經(jīng)滅菌并經(jīng)過檢查無菌的肉湯培養(yǎng)基中，放置攝氏 37度和攝氏27度分別培養(yǎng)24h，進(jìn)行觀察，并取樣鏡檢。此法

3、常用于檢查培養(yǎng) 基和無菌空氣是否帶菌，也可用于噬菌體檢查，此時(shí)使用生產(chǎn)菌作為指示菌。葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏 0.3%，葡萄糖0.5%，氯化鈉0.5%，蛋 白胨0.8%，1%酚紅溶液0.4%，PH7.2。用以上的檢查方法檢查未發(fā)現(xiàn)污染，還不能肯定未被污染。除以上方法外，還可以從發(fā)酵過程的異?，F(xiàn)象來判斷是否染菌， 如溶解氧、 PH值、排氣中C02含量和菌體酶活力等變化來判斷。2. 發(fā)酵染菌率和染菌原因分析1發(fā)酵染菌率發(fā)酵的總?cè)揪适侵敢荒陜?nèi)發(fā)酵染菌的批數(shù)與總投料發(fā)酵批數(shù)之比。發(fā)酵染菌是在發(fā)酵罐中發(fā)生的染菌率， 包括染菌后被挽救不了導(dǎo)致倒罐的 批數(shù)，但種子罐培養(yǎng)的染菌不接入發(fā)酵罐，不導(dǎo)致發(fā)酵染

4、菌的另行計(jì)算。2染菌原因分析在發(fā)酵染菌之后，必須分析染菌原因，總結(jié)發(fā)酵染菌的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，把發(fā) 酵染菌消滅在發(fā)生之前，防患于未然，是積極制服發(fā)酵染菌的最重要措施。造成發(fā)酵染菌的原因很多，但總結(jié)歸納起來，其主要原因有：無菌空氣 帶菌、設(shè)備滲漏、滅菌不徹底、操作失誤和技術(shù)管理不善。在發(fā)生染菌后，根據(jù) 無菌試驗(yàn)結(jié)果，參考以下方法進(jìn)行分析，找出原因，杜絕污染。A從染菌時(shí)間來看，發(fā)酵早期染菌，可能原因有：種子帶菌，培養(yǎng)基和設(shè)備 滅菌不徹底，接種操作不當(dāng)，無菌空氣帶菌；發(fā)酵后期染菌，可能原因有：中間 補(bǔ)料污染，設(shè)備滲漏，操作問題。B從污染的雜菌種類來看，污染耐熱的芽抱桿菌，可能是培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌 不徹底；污染

5、球菌、無芽抱桿菌等不耐熱雜菌可能是種子帶菌，設(shè)備滲漏；污染 霉菌，一般是無菌室滅菌不徹底或操作問題。C從染菌的幅度來看，如果各個(gè)發(fā)酵罐或多個(gè)發(fā)酵罐染菌，而且所污染的是 同一種雜菌，一般是空氣系統(tǒng)問題；如果各別罐連續(xù)染菌，一般是設(shè)備問題。以上僅僅是在分析問題時(shí)作為考慮問題的入門，應(yīng)根據(jù)具體情況綜合分 析，且通過進(jìn)一步的無菌檢查來驗(yàn)證。3. 雜菌污染途徑及預(yù)防1 種子帶菌及防止種子帶菌的原因主要有以下幾方面A培養(yǎng)基及用具滅菌不徹底菌種培養(yǎng)基及用具滅菌均在滅菌鍋中進(jìn)行，造成滅菌不徹底主要是滅菌 時(shí)鍋內(nèi)空氣排放不完全，造成假壓，使滅菌時(shí)溫度還達(dá)不到要求。B菌種在移種過程中受污染菌種的移接工作是在無菌室

6、中，按無菌操作進(jìn)行。當(dāng)菌種移接操作不當(dāng)， 或無菌室管理不嚴(yán)，就可能引起污染。因此，要嚴(yán)格無菌室管理制度和嚴(yán)格按無 菌操作接種，合理設(shè)計(jì)無菌室。C菌種在培養(yǎng)過程或保藏過程中受污染菌種在培養(yǎng)過程和保藏過程中，由于外界空氣進(jìn)入，也使雜菌進(jìn)入而受污 染。為了防止污染，試管的棉花塞應(yīng)有一定的緊密度，不宜太松，且有一定長度， 培養(yǎng)和保藏溫度不宜變化太大。每一級種子培養(yǎng)物均應(yīng)經(jīng)過嚴(yán)格檢查，確認(rèn)未受 污染才能使用。2無菌空氣帶菌及防止無菌空氣帶菌是發(fā)酵染菌的主要原因之一。 杜絕無菌空氣帶菌，必須從空 氣凈化流程和設(shè)備的設(shè)計(jì)，過濾介質(zhì)的選用和裝填，過濾介質(zhì)的滅菌和管理等方 面完善空氣凈化系統(tǒng)。3培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌

7、不徹底導(dǎo)致染菌及防止培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌不徹底的原因，主要與以下幾個(gè)方面有關(guān)A 原料形狀一般稀薄的培養(yǎng)基容易滅菌徹底，而淀粉質(zhì)原料，特別是有顆粒時(shí)，容易 由于滅菌不徹底，造成染菌。淀粉質(zhì)培養(yǎng)基滅菌以采用實(shí)罐滅菌為好， 在升溫時(shí) 先攪拌混合均勻，并加一定量的淀粉酶邊加邊液化。B實(shí)罐滅菌時(shí)未充分排除罐內(nèi)空氣實(shí)罐滅菌時(shí)，罐內(nèi)空氣未完全排除，造成 假壓使罐頂空間局部溫度達(dá) 不到滅菌要求，導(dǎo)致滅菌不徹底而污染。為此，在實(shí)罐滅菌升溫時(shí)，應(yīng)翻開排氣 閥門及有關(guān)聯(lián)接管的邊閥、壓力表接管邊閥，使蒸汽通過到達(dá)徹底滅菌。C培養(yǎng)基連續(xù)滅菌時(shí)，蒸汽壓力波動大，培養(yǎng)基未到達(dá)滅菌溫度，導(dǎo)致 滅菌不徹底而污染。培養(yǎng)基連續(xù)滅菌應(yīng)嚴(yán)

8、格控制滅菌溫度， 最好采用自動控制裝D設(shè)備、管道存在死角由于操作、設(shè)備結(jié)構(gòu)、安裝或人為造成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效 到達(dá)或不能充分到達(dá)預(yù)定應(yīng)該到達(dá)的局部滅菌部位，從而不能到達(dá)徹底滅菌的要 求。這些不能徹底滅菌的部位稱為 死角死角可以是設(shè)備、管道的某一部位， 也可以是培養(yǎng)基或其他物料的某一局部。管道多指法蘭連接處等。4設(shè)備滲漏引起染菌及防止發(fā)酵設(shè)備、管道、閥門的長期使用，由于腐蝕、摩擦和振動等原因，往 往造成滲漏。例如：設(shè)備的外表或焊縫處有砂眼，由于腐蝕逐漸加深，最終導(dǎo)致 穿孔；冷卻管受攪拌器作用，長期磨損，焊縫處受冷熱和振動產(chǎn)生裂縫而滲漏。 為了防止設(shè)備、管道、閥門滲漏，應(yīng)選用優(yōu)質(zhì)的材料，并經(jīng)常進(jìn)行檢查。冷卻蛇 管的微小滲漏不易被發(fā)現(xiàn)，可以壓入堿性水，在罐內(nèi)可疑地方，用浸濕酚酞指示 劑的白布擦，如有滲漏時(shí)白布顯紅色。5 操作問題上面已指出，在菌種培養(yǎng)過程中，如操作不當(dāng)會引起染菌。在發(fā)酵