分子生物學(xué)許曉東2

1、2 染色體與 dna2.1 染色體2.1.1 染色體概述染色體(chromosome)是細(xì)胞核中載有遺傳信息的物質(zhì)，在顯微鏡下呈絲狀或棒狀，由核酸和蛋白質(zhì)組成，在細(xì)胞發(fā)生有絲分裂時期容易被堿性染料著色，因此而得名。同一物種內(nèi)每條染色體所帶dna的量是一定的，但不同染色體或不同種中間變化很大。 原核細(xì)胞原核細(xì)胞染色體外裹著稀疏的蛋白質(zhì)，其中一部分與dna的折疊有關(guān)，另一些則參與dna復(fù)制、重組及轉(zhuǎn)錄過程。真核細(xì)胞真核細(xì)胞的染色體中，dna與蛋白質(zhì)完全融合在一起，其蛋白質(zhì)與相應(yīng)dna的質(zhì)量比約為2:1.人類染色體顯微結(jié)構(gòu)圖19 mb210 genes240 mb3453 genes2.1.2 真核

2、細(xì)胞染色體的組成1. 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)包括組蛋白和非組蛋白。組蛋白是染色體的結(jié)構(gòu)蛋白，它與dna組成核小體。組成：組成：dna，組蛋白，非組蛋白，rna富含賴氨酸和精氨酸組蛋白的特性組蛋白的特性1. 進(jìn)化上的極端保守性 特別是h3、h4，牛、豬、大鼠的h4完全相同2. 無組織特異性 僅發(fā)現(xiàn)兩個例外（鳥魚兩棲紅細(xì)胞h1-h5，精細(xì)胞魚精蛋白）3. 肽鏈上氨基酸分布的不對稱性 n端堿性氨基酸 c端疏水氨基酸4. 組蛋白的修飾作用 甲基化、乙酰化、磷酸化、adp核糖基化等 5. 富含賴氨酸的組蛋白h5 只存在于鳥類、兩棲類等含有細(xì)胞核的紅細(xì)胞中非組蛋白（含量約為組蛋白的非組蛋白（含量約為組蛋白的60-7

3、0%）包括酶類和細(xì)胞分裂有關(guān)的蛋白（收縮蛋白、骨架蛋白、核孔復(fù)合物蛋白、肌動蛋白、肌球蛋白、微管蛋白、原肌蛋白）高速泳動蛋白（high mobility group protein, hmg蛋白）能與dna結(jié)合，也能與h1作用，可能與超螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)。dna結(jié)合蛋白 可能是一些與dna復(fù)制或轉(zhuǎn)錄有關(guān)的酶或調(diào)解物質(zhì)。a24非組蛋白 c端與h2a相同，功能不詳2. 真核生物基因組真核生物基因組dna特點：特點：含有大量的重復(fù)序列；功能dna序列大多被非功能dna隔開。c值值(c value)：一種生物單倍體基因組dna的總量。c值反常現(xiàn)象值反?，F(xiàn)象(c-value paradox)：c值往往與種系進(jìn)

4、化的復(fù)雜程度不一致。不重復(fù)序列不重復(fù)序列 一個或幾個拷貝，占dna總量的40-80%，序列長約750-2000bp. 單拷貝基因也可以合成大量蛋白： 蠶絲心蛋白 dna 104 mrna 109 protein中度重復(fù)序列中度重復(fù)序列 重復(fù)次數(shù)10-104，占dna總量的10-40%，編碼rrna、trna和某些結(jié)構(gòu)蛋白。 高度重復(fù)序列高度重復(fù)序列 衛(wèi)星dna(satellite dna )，占基因組的10-60%，由6-100個堿基組成，大多位于染色體著絲粒，功能不明，可能與染色體的穩(wěn)定性有關(guān)。3. 染色質(zhì)和核小體染色質(zhì)和核小體染色質(zhì)dna的tm值比自由dna高。染色質(zhì)dna的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄活性

5、比自由dna低。dna酶i對染色質(zhì)dna的消化慢于純dna。延伸 tm值核小體是一種串珠狀結(jié)構(gòu)，由核心顆粒和連結(jié)線dna兩部分組成，可描述如下：每個核小體單位包括約200bp的dna、一個組蛋白核心和一個h1；由h2a、h2b、h3、h4各兩分子形成八聚體，構(gòu)成核心顆粒；dna分子以左手螺旋纏繞在核心顆粒表面，每圈80bp，共1.75圈，約146bp，兩端被h1鎖合；相鄰核心顆粒之間為一段60bp的連接線dna。真核生物基因組的結(jié)構(gòu)特點真核生物基因組的結(jié)構(gòu)特點1.基因組龐大2.存在大量重復(fù)序列3.大部分為非編碼序列（90%）4.轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子(見下頁解釋)5.真核基因是斷裂基因，有內(nèi)含子6

6、.存在大量順式作用元件（啟動子、增強(qiáng)子、沉默子）7.存在大量的dna多態(tài)性8.有端粒結(jié)構(gòu)相對同一染色體或dna分子而言為“順式”（cis）；對不同染色體或dna分子而言為“反式”（trans）。 延伸：什么是順反子2.1.3 原核生物基因組1 結(jié)構(gòu)簡練結(jié)構(gòu)簡練 絕大部分編碼蛋白質(zhì)2 存在轉(zhuǎn)錄單元存在轉(zhuǎn)錄單元 功能相關(guān)的基因往往集中在一起，它們可被一起轉(zhuǎn)錄成多順反子mrna3 有重疊基因有重疊基因閱讀框改變或不改變2.2 dna的結(jié)構(gòu)2.2.1 dna的一級結(jié)構(gòu)dna （脫氧核糖核酸 deoxyribonucleic acid）的組成成分：核糖和脫氧核糖嘌呤(purine)嘧啶(pyrimidi

7、ne) 多聚核苷酸鏈中新生磷酸糖苷鍵的產(chǎn)生dna的方向是5-3（蛋白質(zhì)是n-c）dna通常以線性或環(huán)狀形式存在dna通常是雙鏈的(dsdna)，少數(shù)是單鏈的(ssdna)dna的一級結(jié)構(gòu)是指4種核苷酸的排列順序。gc豐富區(qū) 易形成左手螺旋反向重復(fù)的片段 易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)對高級結(jié)構(gòu)的影響：一級結(jié)構(gòu)對高級結(jié)構(gòu)的影響：延伸：5tctctctctctctagagagagagaga33agagagagagagatctctctctctct55nnngaaggtccnnnnggacgttcnnn33nnncttgcaggnnnncctgcaagnnn5反向重復(fù)序列（inverted repeat se

8、quence） 回文結(jié)構(gòu)（palindrome） nn n n cg cg ta gc gc at at gcnnn nnn2.2.2 dna的二級結(jié)構(gòu)dna的二級結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu)是指兩條多核苷酸鏈反向平行盤繞所生成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。b-dna的反向平行雙螺旋結(jié)構(gòu)克里克的草圖克里克的草圖大溝通常是蛋白質(zhì)與dna相互作用的部位 dna纏繞在組蛋白上右手螺旋：a-dna, b-dna左手螺旋：z-dnab構(gòu)象：構(gòu)象：生物體內(nèi)天然存在的dna幾乎都以b-dna存在。a構(gòu)象：構(gòu)象：是在以鈉、鉀或銫作為反向離子時，將dna纖維在75%相對濕度下進(jìn)行x光衍射測定出來的。dna-rna雜交分子、rna-rna雙鏈

9、結(jié)構(gòu)均為a構(gòu)象。z構(gòu)象：構(gòu)象：在dna進(jìn)行轉(zhuǎn)錄或其他一些生理過程中會產(chǎn)生z-dna結(jié)構(gòu)，之后dna會放出能量，形成b-dna。擴(kuò)展：其他結(jié)構(gòu)holliday junction由重復(fù)排列的端粒構(gòu)成的脫氧核糖核酸四聯(lián)體結(jié)構(gòu)形態(tài)2.2.3 dna的高級結(jié)構(gòu)dna的高級結(jié)構(gòu)的高級結(jié)構(gòu)是指dna雙螺旋進(jìn)一步扭曲盤繞所形成的特定空間結(jié)構(gòu)。1965年vinograd等用電鏡發(fā)現(xiàn)sv40和多瘤病毒的環(huán)形dna的超螺旋。負(fù)超螺旋 松弛dna 正超螺旋拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶l=t+wl (linking number)：環(huán)形dna分子兩條鏈間交叉的次數(shù)t (twisting number)：盤繞數(shù)w (writhi

10、ng number)：超螺旋數(shù)2.3 dna的復(fù)制過程復(fù)雜；需要多種酶和蛋白質(zhì)參與（包括拓?fù)洚悩?gòu)酶、解旋酶、單鏈dna結(jié)合蛋白、引物合成酶、dna聚合酶及連接酶等）。2.3.1 dna的半保留復(fù)制最初推測的復(fù)制模型2.3.2 復(fù)制的起點、方向和速度復(fù)制起點（復(fù)制原點）是固定的，能識別參與復(fù)制起始的特殊蛋白質(zhì)。dna從復(fù)制起點開始復(fù)制直到終點為止，每一個這樣的dna復(fù)制單位稱為復(fù)制子（replicon）。從復(fù)制起點開始，雙鏈解開形成叉子狀的生長點，叫復(fù)制叉（replication fork）。復(fù)制叉移動的方向和速度是多種多樣的，但以雙向等速移動為主。真核生物：雙向等速原核生物：雙向等速（大腸桿菌

11、）雙向不等速（枯草桿菌）先單向后雙向（r6k質(zhì)粒）單向（cole1質(zhì)粒）2.3.3 復(fù)制的幾種主要方式1 線性dna雙鏈的復(fù)制 所有已知的核酸聚合酶，無論是dna聚合酶還是rna聚合聚合酶都只從5向3端移動，新鏈的合成方向與聚合酶移動方向一致，即只能是53； 而對于dna的合成必需一段引物的存在，體內(nèi)dna復(fù)制時，由一段rna引物起始dna合成，起始后它必須切除，切除后，5端如何起始呢？延伸 端粒端粒是染色體末端的dna重復(fù)序列，作用是保持染色體的完整性。dna每次復(fù)制端粒就縮短一點。一旦端粒消耗殆盡，染色體則易于突變而導(dǎo)致動脈硬化和某些癌癥。 1.通過將線性復(fù)制子轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)狀或多聚分子。如噬菌

12、體（成環(huán)）、t7噬菌體（多聚分子）。2.dna可形成特殊的結(jié)構(gòu)。如草履蟲的線性線粒體dna在末端形成發(fā)夾，使分子沒有游離末端。3.某種蛋白質(zhì)可能會介入，在真正的末端上啟動。幾種線性病毒核酸具有與5端堿基共價結(jié)合的蛋白質(zhì)，其中了解最清楚的例子是腺病毒 dna 。4.末端是可變的，而不是精確確定的。真核生物染色體可能采用這種方式，在這種情況下，dna末端的短重復(fù)序列的拷貝數(shù)改變（如端粒的復(fù)制）。?二聚體二聚體3-ohatcgtagcatcgtagc3-oh專一性核專一性核酸內(nèi)切酶酸內(nèi)切酶t7噬菌體的末端復(fù)制噬菌體的末端復(fù)制poxvirus dna replication腺病毒通過蛋白引發(fā)的腺病毒通

13、過蛋白引發(fā)的dna復(fù)制復(fù)制schematic representation of the chromosome end decorated with members of the shelterin complex. (a) linear (top) and folded t-loop (bottom) structural states of the telomere are depicted. note that in the open linear conformation, pot1 alone might be sufficient to confer 3 overhang prot

14、ection. (b) an anti-parallel intramolecular g-quadruplex either alone (top) or in the context of a t-loop (bottom) might perform a capping role to protect the chromosome terminus from degradation by nucleases or extension by telomerase or alt. jcs november 15, 2009 vol. 122 no. 22 4013-4025 2 環(huán)狀dna雙

15、鏈的復(fù)制型 （如大腸桿菌e. coli）滾環(huán)型（rolling circle）（如x174）d-環(huán)形（d-loop） （如哺乳動物線粒體dna）2.4 原核生物和真核生物dna復(fù)制的特點2.4.1 原核生物dna復(fù)制的特點1 dna復(fù)制的引發(fā)oric(84min)（dnaa結(jié)合位點）dnaa與與oric的結(jié)合啟動了的結(jié)合啟動了dna的復(fù)制的復(fù)制不同原核生物的復(fù)制起始位點hu+atprna引物：所有的dna聚合酶都從3羥基端開始dna合成。dna復(fù)制首先需要由引發(fā)酶在dna模板上合成一段rna鏈，提供引發(fā)末端。長度111。 引發(fā)體primosome引發(fā)前體preprimosome引發(fā)酶prima

16、se(dnag)dnab helicasednac helicase assistantdnatpriapribpric2 dna雙螺旋的解旋 dna解鏈酶解鏈酶(dna helicase)需要水解atp獲得能量。大部分沿模板的5-3方向移動，少數(shù)沿3-5方向移動(rep蛋白)。 單鏈結(jié)合蛋白單鏈結(jié)合蛋白(single-strand binding protein, ssb蛋白)防止單鏈dna退火。原核生物ssb蛋白有協(xié)同效應(yīng)。 dna拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶(dna topoisomerase)第一型拓樸異構(gòu)酶（type i topoisomerase）：切斷一股dna，屬于這類型的有拓樸異構(gòu)酶

17、i與拓樸異構(gòu)酶iii等。第二型拓樸異構(gòu)酶（type ii topoisomerase）：切斷雙股dna，屬于這類型的有拓?fù)洚悩?gòu)酶ii與拓?fù)洚悩?gòu)酶ii等。3 岡崎片段與半不連續(xù)復(fù)制岡崎片段(okazaki fragment)一般長約1000-2000個堿基，原核比真核長。前導(dǎo)鏈leading strand后隨鏈lagging strand然后，rnaseh降解rna引物，dna聚合酶i補(bǔ)齊缺口，再由dna連接酶連接兩個岡崎片段。4 復(fù)制的終止tus與約22bp的終止序列ter結(jié)合，使dnab不再解鏈。當(dāng)復(fù)制叉前移，遇到重復(fù)性終止子序列（ter）時，ter-tus復(fù)合物能阻擋復(fù)制叉的繼續(xù)前移，等到

18、相反方向的復(fù)制叉到達(dá)后在dna拓?fù)洚悩?gòu)酶iv的作用下使復(fù)制叉解體，釋放子鏈dnapnas september 2, 2008 vol. 105 no. 3512831-12836 5 dna聚合酶細(xì)菌中，已有五種dna聚合酶被發(fā)現(xiàn)。 * dna聚合酶i（pol i）：c端(klenow 片段)具有聚合酶活性和3-5外切酶活性；n端具有5-3外切酶活性；能去除岡崎片段5端得rna引物；有內(nèi)切酶活性。 * dna聚合酶ii（pol ii）：活性低，在dna損傷修復(fù)中起作用。 * dna聚合酶iii（pol iii）：活性強(qiáng)，具有聚合酶活性和3-5外切酶活性，在大腸桿菌dna復(fù)制過程中起主要作用。

19、* dna聚合酶iv（pol iv）：sos修復(fù)中發(fā)揮作用。 * dna聚合酶v（pol v）： sos修復(fù)中發(fā)揮作用。2.4.2 真核生物dna復(fù)制的特點真核生物是多點復(fù)制，原核生物是單點復(fù)制。真核生物在完成全部復(fù)制之前，各個起始點上dna復(fù)制不能再開始；原核生物起始點上可連續(xù)開始新的dna復(fù)制。 復(fù)制起始位點復(fù)制起始位點：自主復(fù)制序列(autonomous replicating sequence, ars) 這個序列是染色體正常起始復(fù)制所必需的。所有的ars的dna均有一段保守序列。ars能結(jié)合起始點識別復(fù)合物(origin recognition complex, orc)。已發(fā)現(xiàn)已發(fā)

20、現(xiàn)15種真核種真核dna聚合酶，在哺乳動物細(xì)胞中有聚合酶，在哺乳動物細(xì)胞中有5種種：pol ：做為引發(fā)酶合成rna引物，然后做為dna合成酶延伸此段rna引物；合成數(shù)百個堿基后，將后續(xù)的延伸過程交給pol 與。pol ：在dna修復(fù)中起作用。pol ：復(fù)制線粒體dna。pol ：pol 與pol 是真核細(xì)胞的主要dna聚合酶。（前導(dǎo)鏈）pol ：填補(bǔ)引物空隙，切除修復(fù)，重組。（岡崎片段） （真核生物dna聚合酶一般不具有外切酶活性，推測有其他的酶參與校對。）去除岡崎片段去除岡崎片段：分兩步，rna酶h1切斷dna-rna，fen1蛋白降解rna片段，dna連接酶連接兩個岡崎片段。2.4.3 d

21、na復(fù)制的調(diào)控1. 大腸桿菌染色體dna的復(fù)制調(diào)控復(fù)制起始不依賴于細(xì)胞分裂，復(fù)制終止則能引發(fā)細(xì)胞分裂。復(fù)制調(diào)控主要發(fā)生在起始階段。dnaa-adp復(fù)合物； 非甲基化gatc-seqa復(fù)合物schematic representation of mechanisms to limit initiation of chromosome replication in e. coli. the dnaa protein can bind atp or adp (a), bind to oric and separate the dna strands (b). after loading of the

22、 dnab helicase, primase, and the elongation machinery the dnaa-bound atp may be reduced to adp by the b-clamp, which is part of the polymerase complex yellow ellipse, (c). it should be noted that this atp hydrolysis may continue as long as the b-clamp is loaded and not only shortly after initiation.

23、 the nascent dna strands are unmethylated (red) and the seqa protein binds hemimethylated dna (d) and sequesters hemimethylated oric. seqa remains bound at the hemimethylated oric long after the replication fork has passed data, which titrates a large amount of dnaa (e). note the difference in scale

24、 in the different panels. embo reports 1, 6, 479483 (2000) 對dam- e.coli 的研究表明，半甲基化的ori c不能發(fā)動一輪新的復(fù)制在復(fù)制過程中，ori c的半甲基化狀態(tài)約保留13 min。而在基因組其它區(qū)域的gatc位點，在復(fù)制后1.5 min內(nèi)即被甲基化。2. cole1質(zhì)粒dna的復(fù)制調(diào)控引物rna前體的轉(zhuǎn)錄起始于復(fù)制起點上游555個核苷酸處，需經(jīng)rnaseh加工后產(chǎn)生有555個核苷酸的引物，然后由dna聚合酶i在引物的3末端起始dna合成。rna1的編碼區(qū)在引物rna編碼區(qū)的5末端，轉(zhuǎn)錄方向與引物rna相反，因此與引物rn

25、a的5末端互補(bǔ)。rna1通過氫鍵配對與引物rna前體相互作用，阻止了rnaseh加工引物前體，使其不能轉(zhuǎn)化為有活性的引物而對復(fù)制起負(fù)調(diào)控作用。（負(fù)調(diào)控）當(dāng)不存在rna 1時，rna引物前體形成自身的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，起類似終止子的作用當(dāng)前體rna與rna1互補(bǔ)配對時，類終止子效應(yīng)消失，引物前體的轉(zhuǎn)錄被繼續(xù)，阻止了rnase h加工引物前體3. 真核細(xì)胞dna的復(fù)制調(diào)控（1）細(xì)胞生活周期水平調(diào)控 dna復(fù)制只發(fā)生在s期 s期的主要事件是dna復(fù)制，該過程將準(zhǔn)確生成兩套半保留的染色體。對此，有人提出“dna復(fù)制執(zhí)照”假說，該假說認(rèn)為細(xì)胞中存在一種因子使dna僅能復(fù)制一次。且該因子將不斷降解從而使dna復(fù)制

26、于g2期中止，并直至下一次m期重新接觸到該因子才可繼續(xù)復(fù)制。有實驗證明mcm、orc蛋白等成分構(gòu)成了執(zhí)照因子。（2）染色體水平調(diào)控 不同染色體或同一染色體不同部位的復(fù)制子按一定的時間順序在s期起始復(fù)制（3）復(fù)制子水平調(diào)控 各個復(fù)制子按專一的時間順序活化。2.5 dna的修復(fù)維持 dna序列的保真性；可在復(fù)制前后進(jìn)行；有多種修復(fù)機(jī)制來糾正dna損傷；dna 修復(fù)失敗可能導(dǎo)致突變和腫瘤。怎么損傷的？1 自發(fā)損傷自發(fā)損傷 dna復(fù)制中的錯誤（10-1-2 - 10-5-6 - 10-10 ） dna自發(fā)性化學(xué)變化（堿基異構(gòu)、脫氨基、脫嘌呤嘧啶、堿基修飾）2 物理因素物理因素 紫外線 電離輻射3 化學(xué)因素化學(xué)因素 烷化劑 堿基類似物（5-溴尿嘧啶） eb2.5.1 錯配修復(fù)2.5.2 切除修復(fù)ap位點位點所有細(xì)胞中都帶有不同類型、能識別受損核酸位點的糖苷水解酶，它能夠特異性切除受損核苷酸上的n-糖苷鍵，在dna鏈上形成去嘌呤或去嘧啶位點，統(tǒng)稱為ap位點(apurinic/apyrimidinic site) 。ap位點 ap核酸內(nèi)切酶 dna聚合酶i dna連接酶1. 堿基切除修復(fù)2. 核苷酸切除修復(fù)2.5.3 重組修復(fù)有時在進(jìn)行dna修復(fù)之前，受損環(huán)的dna鏈常常還能進(jìn)行復(fù)制。在這種情況下，受損親代鏈的復(fù)制受損壞堿基的干擾，跨過這段損壞序列后，此時在新的一個起點繼續(xù)開始復(fù)制，此時新