《藥物免疫原性研究技術(shù)指導(dǎo)原則(征求意見(jiàn)稿)》

1、一、概述o二、免疫原性研究?jī)?nèi)容1三、抗藥抗體檢測(cè)3（一）試驗(yàn)設(shè)計(jì)考慮3（二）方法學(xué)開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證6（三）試驗(yàn)內(nèi)容7四、B付錄14（-）免疫原性多層級(jí)檢測(cè)策略示意圖14（二）抗藥抗體檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證15（三）體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)2812345678910111213141516171819202122藥物免疫原性研究技術(shù)指導(dǎo)原則一、概述本指導(dǎo)原則中，藥物的免疫原性是指藥物和/或其代謝物 誘發(fā)對(duì)自身或相關(guān)蛋白的免疫應(yīng)答或免疫相關(guān)事件的能力。 免疫反應(yīng)的影響廣泛，從無(wú)臨床意義抗藥抗體的暫時(shí)出現(xiàn), 到嚴(yán)重危及生命。不必要或非預(yù)期的免疫反應(yīng)可能導(dǎo)致中和 藥物的生物學(xué)活性，或與對(duì)應(yīng)的內(nèi)源性蛋白產(chǎn)生交叉免疫

2、反 應(yīng)，也可能導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)和細(xì)胞因子釋放綜合征等不良事件 的發(fā)生，對(duì)患者的安全性和藥物的有效性均有重要影響。對(duì)于大多數(shù)藥物，不良免疫反應(yīng)一般由體液免疫機(jī)制介 導(dǎo)的免疫應(yīng)答所致，因此抗藥抗體一直是定義該類藥物免疫 原性的主要標(biāo)準(zhǔn)。但近年來(lái)隨著免疫調(diào)節(jié)類藥物在重大疾病 中更加廣泛的應(yīng)用，細(xì)胞免疫機(jī)制介導(dǎo)的不良免疫反應(yīng)也應(yīng) 得到重視。藥物的免疫原性受到多種因素的影響，患者自身 和藥物相關(guān)因素均可能影響藥物的免疫原性?；颊吆图膊∠?關(guān)因素包括患者的免疫狀態(tài)和免疫能力、遺傳因素、預(yù)存抗 體、給藥途徑、劑量和頻率等。藥物相關(guān)因素包括產(chǎn)品來(lái)源、 結(jié)構(gòu)、聚合物的形成、糖基化/聚乙二醇化、雜質(zhì)、處方、包 裝和儲(chǔ)

3、存等。建議在藥物開(kāi)發(fā)的全生命周期中始終關(guān)注免疫 原性研究，應(yīng)基于藥物作用機(jī)制，產(chǎn)品相關(guān)因素，以及擬用 適應(yīng)證等因素預(yù)測(cè)免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，基于免疫原性風(fēng)險(xiǎn)設(shè)計(jì)相 應(yīng)的研究進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別。在藥物的開(kāi)發(fā)中，一方面應(yīng)盡量選 擇免疫原性潛在風(fēng)險(xiǎn)較小的候選藥物，另一方面應(yīng)探索如何 減少和控制在臨床研發(fā)中觀察到的免疫原性的不良影響。232425262728293031323334353637383940414243本指導(dǎo)原則適用于蛋白質(zhì)、多肽及其衍生物，以及含有 此類組分的藥物，例如偶聯(lián)藥物。二、免疫原性研究?jī)?nèi)容免疫原性研究主要聚焦在抗藥抗體的檢測(cè)和表征上， 應(yīng)獲得抗藥抗體的發(fā)生率、滴度、存續(xù)時(shí)間和中和能力數(shù)據(jù)。

4、 有些情況下，需要對(duì)抗藥抗體進(jìn)一步進(jìn)行表征，如同種型和 IgG亞型或者與相關(guān)內(nèi)源性蛋白的交叉反應(yīng)。應(yīng)始終考察抗 藥抗體生成與藥代/藥效動(dòng)力學(xué)、療效、以及安全，性之間的相 關(guān)性。免疫原性風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別中，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)也很重要, 應(yīng)在適用的情況下考慮對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。如果觀察到臨床相關(guān) 的免疫反應(yīng)，應(yīng)對(duì)其潛在機(jī)制進(jìn)行研究，并確定關(guān)鍵的影響 因素。這些研究有助于制定和實(shí)施控制和緩解策略，包括修 改產(chǎn)品處方和篩查高風(fēng)險(xiǎn)患者。大多數(shù)情況下治療性蛋白藥物具有種屬差異，基于動(dòng)物 免疫原性研究結(jié)果預(yù)測(cè)人體免疫原性具有局限性。但是，在 非臨床研究中進(jìn)行免疫原性評(píng)價(jià)仍然具有一定意義。免疫原 性相關(guān)的反應(yīng)可導(dǎo)致非臨床研

5、究結(jié)果復(fù)雜化、并難以解釋, 因此免疫原性研究始終是治療性蛋白藥物非臨床安全性研444546474849505152535455565758596061626364究證據(jù)鏈的重要組成部分。應(yīng)考慮將新技術(shù)（新興的生物信 息學(xué)、體外和體內(nèi)模型）用于開(kāi)發(fā)過(guò)程中。對(duì)于細(xì)胞因子釋 放綜合征、自身免疫反應(yīng)等免疫相關(guān)不良反應(yīng)，應(yīng)在藥物的 開(kāi)發(fā)早期進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。除了常規(guī)的動(dòng)物體內(nèi)毒性試驗(yàn)中進(jìn) 行細(xì)胞因子相關(guān)檢測(cè)外,應(yīng)進(jìn)行體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)（具 體試驗(yàn)方法見(jiàn)附錄三）。當(dāng)治療性蛋白藥物對(duì)應(yīng)的內(nèi)源蛋白 具有不可替代的生理功能時(shí)，應(yīng)充分評(píng)估潛在自身免疫反應(yīng) 介導(dǎo)的安全性風(fēng)險(xiǎn)。通?；趯?duì)內(nèi)源性蛋白生理功能的已有 了解，

6、安全性風(fēng)險(xiǎn)是可以預(yù)估的，因此不必為了確定這些安 全性風(fēng)險(xiǎn)而專門(mén)進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)。但是，如果缺乏足夠的認(rèn)知, 并且理論上提示存在安全性風(fēng)險(xiǎn)，則應(yīng)考慮對(duì)治療性蛋白藥 物（或針對(duì)動(dòng)物的替代分子）進(jìn)行動(dòng)物免疫試驗(yàn)，以便于了 解不良免疫反應(yīng)的潛在影響。生物類似藥需要進(jìn)行免疫原性比較試驗(yàn)，生物類似藥和 參比制劑應(yīng)采用同樣的測(cè)定條件和采樣計(jì)劃，需符合現(xiàn)行的 所有標(biāo)準(zhǔn)。分析方法最好能同時(shí)檢測(cè)生物類似藥和參比制劑 的抗藥抗體，至少應(yīng)能檢測(cè)到針對(duì)生物類似藥的所有抗藥抗 體。通常，應(yīng)對(duì)抗藥抗體生成和性質(zhì)（如，交叉反應(yīng)，靶抗 原表位和中和活性）以及抗體滴度進(jìn)行檢測(cè)和描述，并應(yīng)評(píng) 估和解釋對(duì)臨床有效性和安全性指標(biāo)的潛在影響

7、。當(dāng)生產(chǎn)工藝變更需要臨床試驗(yàn)支持時(shí)，免疫原性的研究應(yīng)與藥代動(dòng)力學(xué)，安全性和有效性試驗(yàn)相結(jié)合，應(yīng)優(yōu)先選擇 變更前后藥品的頭對(duì)頭試驗(yàn)。656667686970717273747576777879808182838485免疫原性研究涉及多學(xué)科，免疫原性相關(guān)數(shù)據(jù)分散在上 市申請(qǐng)的多個(gè)部分。建議提交免疫原性綜合概述，可將其放 于CTD2.7.2.4的特殊研究中，總結(jié)應(yīng)簡(jiǎn)明扼要，并包含詳細(xì) 研究報(bào)告的鏈接。三、抗藥抗體檢測(cè)制定與預(yù)期治療計(jì)劃相關(guān)的綜合分析策略對(duì)于闡明免 疫原性數(shù)據(jù)的臨床相關(guān)性至關(guān)重要。應(yīng)在臨床試驗(yàn)開(kāi)展之前 選擇和/或開(kāi)發(fā)用于評(píng)估免疫原性檢測(cè)方法和檢測(cè)策略?？紤] 到與臨床安全性和療效的相關(guān)性

8、，對(duì)免疫原性的檢測(cè)通常集 中在對(duì)抗藥抗體的檢測(cè)和表征研究上。抗藥抗體檢測(cè)需要進(jìn) 行謹(jǐn)慎、且前瞻性地設(shè)計(jì)和計(jì)劃，以保證臨床評(píng)價(jià)開(kāi)始之前 所有關(guān)鍵程序都準(zhǔn)確到位。這包括分析方法的選擇、評(píng)價(jià)、 特征分析、合適的采樣點(diǎn)(包含能夠確定預(yù)存抗體的基線樣 品1充足的采樣體積、樣品采集的流程及儲(chǔ)存方法、以及分 析數(shù)據(jù)選用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。(-)試驗(yàn)設(shè)計(jì)考慮1 .檢測(cè)策略抗藥抗體的檢測(cè)通常應(yīng)采用一種多層級(jí)分析方法，首先 對(duì)所有樣品進(jìn)行篩選試驗(yàn)，其次對(duì)疑似抗體陽(yáng)性樣品的特異性進(jìn)行確證試驗(yàn)，對(duì)已確定抗體陽(yáng)性的樣品進(jìn)行滴度試驗(yàn)， 以及通過(guò)功能性試驗(yàn)對(duì)抗體中和活性進(jìn)行檢測(cè)。其中在已確 定抗體陽(yáng)性的樣品中，有時(shí)還應(yīng)考慮確定抗

9、體同種型、亞型 和結(jié)合表位的檢測(cè)。免疫原性多層級(jí)檢測(cè)決策樹(shù)參見(jiàn)附錄一。8687888990919293949596979899100101102103104105106在多層級(jí)的分析方法中，篩選試驗(yàn)又稱結(jié)合抗體試驗(yàn)， 用于檢測(cè)所有與藥物結(jié)合的抗體。確證試驗(yàn)用于確定藥物結(jié) 合抗體的特異性。滴度和中和抗體試驗(yàn)用于進(jìn)一步分析抗藥 抗體。滴度試驗(yàn)用于檢測(cè)抗藥抗體產(chǎn)生的強(qiáng)度。中和抗體是 指能夠干擾藥物與其靶點(diǎn)相互作用的抗藥抗體。中和活性試 驗(yàn)評(píng)估抗藥抗體對(duì)藥物的中和程度。抗藥抗體滴度、持續(xù)周 期、以及中和活性檢測(cè)信息對(duì)于判斷抗藥抗體對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)、 藥效動(dòng)力學(xué)、安全性和有效性的影響非常重要，這些信息比 抗

10、藥抗體陽(yáng)性率信息更為重要。在非臨床免疫原性研究中， 通常根據(jù)非臨床藥效動(dòng)力學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)和安全性的表現(xiàn)決 定是否需要進(jìn)行除抗藥抗體陽(yáng)性率以外的研究確證。其他分析試驗(yàn)，如抗體同種型、亞型、抗原表位鑒定以 及與內(nèi)源性靶點(diǎn)或其他產(chǎn)品的交叉反應(yīng)性評(píng)價(jià)也具有重要 的作用。初步的篩選試驗(yàn)應(yīng)盡可能檢測(cè)到所有相關(guān)的免疫球 蛋白（Ig）同型抗體，但篩選試驗(yàn)無(wú)需進(jìn)行同型抗體的進(jìn)一 步確定。在某些情況下，應(yīng)該建立可區(qū)分同型抗體的分析方 法。例如，對(duì)于過(guò)敏性反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)較高或觀察到過(guò)敏性反應(yīng)的藥物，則需要進(jìn)行抗原特異性的IgE檢測(cè)。因此，根據(jù)臨床 需要，可能需要評(píng)估特定的同型或亞型。在有些情況下，可 能需要進(jìn)行與其他蛋白

11、交叉反應(yīng)的試驗(yàn)，如檢測(cè)抗藥抗體與 相應(yīng)的內(nèi)源性蛋白質(zhì)的交叉反應(yīng)性。例如，當(dāng)治療性蛋白藥 物在體內(nèi)具有一個(gè)高同源性的蛋白家族，那么為了了解抗藥 抗體是否影響蛋白家族中其它蛋白時(shí)，往往需要評(píng)估抗藥抗 體的交叉反應(yīng)性。107108109110111112113114115116117118119120121122123124125126127對(duì)于多結(jié)構(gòu)域治療性蛋白藥物，如聚乙二醇化蛋白、抗 體偶聯(lián)藥物和雙特異性抗體，建議針對(duì)整個(gè)治療性蛋白藥物 進(jìn)行初步篩選試驗(yàn)和確證試驗(yàn)，對(duì)確證為陽(yáng)性的樣本進(jìn)一步 進(jìn)行域特異性評(píng)價(jià)。2 .分析方法的選擇對(duì)于抗藥抗體檢測(cè)可以采用不同的方法和儀器，包含但 不局限于以下這些

12、：直接法，橋聯(lián)法和均相結(jié)合法。每種分 析方法均有其優(yōu)點(diǎn)和不足，包括檢測(cè)速度、靈敏度、選擇性、 方法的響應(yīng)范圍、檢測(cè)不同免疫球蛋白的能力、檢測(cè)快速游 離出的抗體的能力（如IgM ,在免疫反應(yīng)的早期出現(xiàn)），以及 試劑的可獲得性。所有的分析方法都應(yīng)該考慮其檢測(cè)快速游 離出的抗體的能力。如果無(wú)法檢測(cè)到此類免疫反應(yīng)早期出現(xiàn) 的抗體，易造成真正陽(yáng)性的抗體樣品未被檢出的情況。在分 析中也要重點(diǎn)考慮表位的暴露情況，如果表位與固相載體或者其他報(bào)告試劑（如熒光染料、酶或生物素）結(jié)合，將導(dǎo)致 抗原的構(gòu)象變化，這將掩蓋、暴露、改變或破壞與治療性蛋 白藥物相關(guān)的抗體的結(jié)合位點(diǎn)，從而影響最后的檢測(cè)結(jié)果。128129130

13、1311321331341351361371381391401411421431441451461471483 .試劑的選擇用于抗藥抗體檢測(cè)的許多試劑可以是標(biāo)準(zhǔn)化的或從商 業(yè)來(lái)源獲得，例如，市售試劑。然而，特定方法可能需要其 他特定試劑，包括陽(yáng)性對(duì)照抗體、陰性對(duì)照和系統(tǒng)適用性對(duì) 照。在方法設(shè)計(jì)中需要對(duì)所用到的試劑進(jìn)行合適的選擇。根 據(jù)所選擇的檢測(cè)方法選擇合適的檢測(cè)試劑。通過(guò)試劑的選擇 來(lái)最小化非特異性信號(hào)并維持足夠的靈敏度。陽(yáng)性對(duì)照和陰 性對(duì)照的選擇見(jiàn)附錄二。（二）方法學(xué)開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證方法學(xué)驗(yàn)證的程度主要取決于藥物的開(kāi)發(fā)階段以及潛 在的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于大多數(shù)治療性蛋白產(chǎn)品，在藥品開(kāi) 發(fā)的早期階段

14、（如非臨床、臨床I期和n期），主要涉及臨 界值、靈敏度，選擇性和精密度，而弱化穩(wěn)健性、重復(fù)性和 穩(wěn)定性。對(duì)于高風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品，可能需要在臨床研究之前就進(jìn)行 全面驗(yàn)證。對(duì)于關(guān)鍵性臨床試驗(yàn)以及上市后研究，抗藥抗體 檢測(cè)方法需進(jìn)行全面的方法學(xué)驗(yàn)證。藥物開(kāi)發(fā)全生命周期中， 有可能會(huì)根據(jù)研究需要進(jìn)行檢測(cè)方法參數(shù)的調(diào)整，在此情況 下，應(yīng)合理追加相關(guān)的補(bǔ)充驗(yàn)證內(nèi)容；對(duì)于生物類似藥，免 6疫原性是可比性研究的一部分，需要增加額外的驗(yàn)證內(nèi)容。 此外，對(duì)于某些技術(shù)平臺(tái)，需增加對(duì)其他參數(shù)的驗(yàn)證，如采 用表面等離子共振平臺(tái)時(shí)，需驗(yàn)證表面再生穩(wěn)定性、芯片基 線標(biāo)準(zhǔn)、標(biāo)記試劑的效能及穩(wěn)定性等。具體的驗(yàn)證方法參見(jiàn) 附錄二。149

15、150151152153154155156157158159160161162163164165166167168169（三）試驗(yàn)內(nèi)容1 .篩選試驗(yàn)篩選試驗(yàn)是抗藥抗體檢測(cè)的第一步。所采用的檢測(cè)方法 應(yīng)該具有較高靈敏度，能夠同時(shí)檢測(cè)出樣本中各種類型的低 親和力和高親和力的抗藥抗體。該方法應(yīng)具有一定的假陽(yáng)性 率（通常為5% ）,以增大真實(shí)陽(yáng)性樣本的檢出率；但不期望 出現(xiàn)假陰性。方法建立時(shí)應(yīng)盡可能地選擇與待測(cè)樣本相同或相近的 自然樣本群。所選擇的方法應(yīng)根據(jù)需求進(jìn)行優(yōu)化。樣本（通 常是血清或血漿）中含有可能影響檢測(cè)的成分，可導(dǎo)致假陽(yáng) 性或假陰性結(jié)果的產(chǎn)生和/或?qū)贵w含量的錯(cuò)誤評(píng)估。例如補(bǔ) 體成分或補(bǔ)體

16、受體、甘露糖結(jié)合蛋白、Fc受體、可溶性的靶 分子及類風(fēng)濕因子。應(yīng)采用經(jīng)證實(shí)合理的方法以減少基質(zhì)效 應(yīng)的潛在影響。此外，待測(cè)樣本中的殘留藥物可能與抗藥抗體結(jié)合，從 而使檢測(cè)到的抗體數(shù)量降低。這種干擾分析帶來(lái)的影響取決 于分析模式和抗體的特性?？赏ㄟ^(guò)多種經(jīng)驗(yàn)證的方法規(guī)避或 解決，如酸解離、通過(guò)固相吸附除去過(guò)量的藥物、延長(zhǎng)孵育 時(shí)間和/或使用允許充分稀釋樣本的方法。在某些情況下，可 通過(guò)調(diào)整給藥間隔和抗體采樣時(shí)間來(lái)降低殘留藥物的干擾。 但該方法必須不能顯著地影響抗體的檢測(cè)或患者的治療。在 任何情況下，應(yīng)證明分析方法的藥物耐受水平超過(guò)待測(cè)樣本 中藥物的濃度（一般為藥物的谷濃度）/p>

17、31741751761771781791801811821831841851861871881891902 .確證試驗(yàn)確證試驗(yàn)是為了排除篩選試驗(yàn)中的假陽(yáng)性樣本。篩選試 驗(yàn)中檢測(cè)為陽(yáng)性的樣本，需進(jìn)一步進(jìn)行確證試驗(yàn)以證明抗藥 抗體的特異性。確證試驗(yàn)應(yīng)與篩選試驗(yàn)具有可比的靈敏度，但需要注意 的是，兩個(gè)試驗(yàn)的假陽(yáng)性率不同，且確證試驗(yàn)有更高的特異 性,并至少具有與篩選試驗(yàn)相當(dāng)?shù)倪x擇性以識(shí)SU假陽(yáng)性樣本。 通常情況下，確證試驗(yàn)會(huì)選擇與篩選試驗(yàn)相同的方法與平臺(tái), 采用結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)抑制法進(jìn)行檢測(cè)，即在樣本中加入過(guò)量的藥物 分子，隨后同時(shí)檢測(cè)加入藥物分子和未加入藥物分子樣本的 信號(hào)值，若樣本中含有抗藥抗體，游離的藥

18、物分子將競(jìng)爭(zhēng)結(jié) 合抗藥抗體，從而造成檢出的信號(hào)值下降。也可采用與篩選 試驗(yàn)不同的方法與平臺(tái)進(jìn)行確證試驗(yàn)，這種情況下，兩種方 法的靈敏度都需要用質(zhì)量單位確定，并使用系統(tǒng)適用性對(duì)照,確保方法的靈敏度。191192193194195196197198199200201202203204205206207208209210211若選擇競(jìng)爭(zhēng)性抑制方法，則建議使用抗體陰性、未給予 治療性蛋白的受試者的樣本，加入抑制劑（通常是治療性蛋 白）后，所產(chǎn)生的信號(hào)的數(shù)據(jù)來(lái)確定臨界值。在這種情況下， 用于測(cè)定臨界值的治療性蛋白的競(jìng)爭(zhēng)濃度應(yīng)與將用于樣本 檢測(cè)的濃度一致。這種方法可能不適用于在未給藥受試者中 存在預(yù)存抗體

19、的情況。在這種情況下，建議從臨界值的評(píng)估 中找出疑似陽(yáng)性結(jié)果并予以剔除。在特殊情況下，當(dāng)沒(méi)有本 底水平的陰性對(duì)照樣本時(shí)，應(yīng)采用滴度的改變或正交方法對(duì) 篩選試驗(yàn)中呈陽(yáng)性的樣本進(jìn)行確認(rèn)。對(duì)于確證為陽(yáng)性的樣本, 在某些情況下，需要對(duì)其特異性進(jìn)行檢測(cè)，以區(qū)分抗體的結(jié) 合是針對(duì)藥物相關(guān)成分還是工藝相關(guān)成分（如宿主細(xì)胞蛋 白X在這種情況下，應(yīng)開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證針對(duì)樣本中雜質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生 抗體的檢測(cè)方法。3 .滴度試驗(yàn)滴度定義為樣品檢測(cè)值高于臨界值時(shí)的最大稀釋倍數(shù)。 滴度檢測(cè)常與篩選試驗(yàn)使用相同的平臺(tái)。一般采用連續(xù)稀釋 方法或通過(guò)量效曲線的線性部分外推來(lái)確定滴度。通常情況下，沿用篩選臨界值作為滴度臨界值。但當(dāng)存 在預(yù)存

20、抗藥抗體時(shí)，則應(yīng)根據(jù)給藥后滴度的提升判斷經(jīng)治療 后抗藥抗體的升高?？墒褂媒o藥后增強(qiáng)的信號(hào)值作為臨界值。例如，當(dāng)使用兩倍的稀釋倍數(shù)進(jìn)行滴度測(cè)定時(shí)，可采用高于 給藥前信號(hào)值的兩倍滴度作為臨界值。如果滴度采用臨界值 進(jìn)行滴度曲線回算得到，治療引起的免疫原性反應(yīng)應(yīng)結(jié)合方 法變異進(jìn)行確定。2122132142152162172182192202212222232242252262272282292302312324 .中和活性試驗(yàn)中和活性是指抗藥抗體具有抑制藥物生物學(xué)活性的能 力。中和抗體可以通過(guò)阻斷產(chǎn)品到達(dá)其靶標(biāo)或干擾受體/配體 結(jié)合的作用，從而干擾藥物的體內(nèi)活性。中和活性檢測(cè)方法的分析模式的選擇需要

21、基于多種因 素進(jìn)行考慮，包括但不限于藥物本身的作用機(jī)制、檢測(cè)方法 與體內(nèi)真實(shí)情況的相關(guān)性、方法本身的選擇性、生物基質(zhì)的 干擾程度、靈敏度和穩(wěn)健程度等。對(duì)分析模式進(jìn)行選擇時(shí), 建議將測(cè)定方法與藥物體內(nèi)作用機(jī)制的相關(guān)性作為首要考 慮因素。通常建議采用基于細(xì)胞的中和活性檢測(cè)方法。但是, 當(dāng)藥物在體內(nèi)的作用機(jī)制與細(xì)胞關(guān)系較小，例如體液中游離 靶點(diǎn)的拮抗反應(yīng)、酶反應(yīng)等，或者由于生物基質(zhì)干擾等因素, 細(xì)胞學(xué)方法的變異程度、定量范圍、靈敏度等難以滿足中和 抗體方法學(xué)驗(yàn)證和樣本分析的需要時(shí)，可能需采用基于非細(xì) 胞的試驗(yàn)方法（配體結(jié)合分析、酶反應(yīng)等1在某些特殊情況 下，結(jié)合高度靈敏的藥效動(dòng)力學(xué)或/和藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)

22、據(jù)可以判 斷抗藥抗體對(duì)臨床藥效的影響，這些試驗(yàn)和指標(biāo)有可能代替中和抗體試驗(yàn)，這些數(shù)據(jù)的可替代性應(yīng)與監(jiān)管當(dāng)局溝通交流。233234235236237238239240241242243244245246247248249250251252253采用基于細(xì)胞法的中和活性檢測(cè)方法，通常是在產(chǎn)品活 性測(cè)定方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行開(kāi)發(fā)，這些方法的形式和測(cè)定終點(diǎn) 因產(chǎn)品而異。中和活性檢測(cè)方法開(kāi)發(fā)時(shí)，應(yīng)對(duì)基質(zhì)效應(yīng)、藥 物濃度、配體濃度等予以考察，并對(duì)臨界值、精密度、選擇 性、靈敏度等進(jìn)行驗(yàn)證。中和活性分析方法一般不具有很好 的藥物耐受，因此應(yīng)在采樣時(shí)間點(diǎn)設(shè)計(jì)上予以考慮。此外， 還應(yīng)該針對(duì)不同分析模式的特殊性，考察方

23、法的穩(wěn)健程度, 例如細(xì)胞代次等。通常，基于細(xì)胞的中和活性檢測(cè)方法采用特定濃度的陽(yáng) 性抗體及特定濃度的治療性蛋白藥物。因此，應(yīng)對(duì)治療性蛋 白藥物的濃度進(jìn)行篩選，使其對(duì)細(xì)胞的效應(yīng)對(duì)中和作用足夠 靈敏。如果治療性蛋白藥物的濃度在反應(yīng)曲線的下半部分, 可能沒(méi)有足夠的動(dòng)態(tài)范圍響應(yīng)以達(dá)到中和效果。如果試驗(yàn)是 在接近劑量-反應(yīng)曲線的平臺(tái)濃度下進(jìn)行，對(duì)于中和抗體含量 低的樣本，可能鑒別不出陽(yáng)性結(jié)果。建議治療性蛋白藥物濃 度應(yīng)在曲線的線性范圍下進(jìn)行中和反應(yīng)試驗(yàn)。樣品基質(zhì)可干擾中和反應(yīng)試驗(yàn)，特別是基質(zhì)組分，在基 于細(xì)胞的檢測(cè)中可能增強(qiáng)或抑制藥物的活性。例如，來(lái)自患 有特定疾病受試者的血清中可能含有高水平的細(xì)胞因子

24、，這 些因子可能激活細(xì)胞，增加對(duì)原有刺激因子或藥物的應(yīng)答,254255256257258259260261262263264265266267268269270271272273274從而掩蓋中和抗體的檢測(cè)。因此，應(yīng)了解這些試驗(yàn)中的基質(zhì) 影響并選擇可以被藥物特異性激活的細(xì)胞系。還可通過(guò)特異性抗體抑制或耗竭干擾因子。與所有試驗(yàn)一樣，中和活性試驗(yàn)需采用來(lái)自未給藥受試 者的樣本，通過(guò)試驗(yàn)變異性來(lái)確定臨界值。如果對(duì)在篩選和 確證試驗(yàn)中檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品進(jìn)行中和活性測(cè)定，通常采用 1 %的假陽(yáng)性率。在極少數(shù)情況下，當(dāng)使用中和活性篩選試驗(yàn) 時(shí)，應(yīng)使用5%的假陽(yáng)性率。如果樣本變異程度導(dǎo)致中和抗體 活性難以評(píng)估

25、，可考慮其他方法，或開(kāi)發(fā)能使變異性降低并 獲得更準(zhǔn)確的臨界值的方法。通常，中和活性試驗(yàn)采用固定 臨界值，基于藥物作用的機(jī)制可采用信號(hào)抑制或刺激閾值百 分比來(lái)表示，也可使用浮動(dòng)臨界值。中和反應(yīng)試驗(yàn)一般僅對(duì)抗原特異性抗藥抗體進(jìn)行檢測(cè)，通常不需要特異性驗(yàn)證。由于生物活性檢測(cè)具有一定的復(fù)雜性，在某些情況下，為確定受試者是否已經(jīng)產(chǎn)生了真正的中和抗體，進(jìn)行特異性確證具有一定作用。應(yīng)該考慮以下方(1 )不相關(guān)的抑制分子可能引起中和活性，有時(shí)并不清楚所觀察到的中和活性是由中和抗體或是其他抑制分子導(dǎo)致。對(duì) 給藥前樣本進(jìn)行檢測(cè)是有意義的。若擔(dān)心存在非特異性抑制, 應(yīng)進(jìn)行抗體競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)評(píng)估中和活性是否確實(shí)由抗藥抗體引

26、起，而不是由其他抑制性分子導(dǎo)致。(2)除了治療性蛋白藥275物，細(xì)胞系可能對(duì)多種刺激產(chǎn)生應(yīng)答。在這種情況下，可在 276治療性蛋白藥物存在時(shí)檢測(cè)中和抗體，此時(shí)中和抗體應(yīng)答會(huì)277被特異性阻斷，而不會(huì)阻斷其它刺激引起的應(yīng)答。（3 ）基質(zhì)278含有的可溶性受體或內(nèi)源性藥物類似物可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié) 279果的產(chǎn)生。在這種情況下，直接進(jìn)行基質(zhì)樣本的檢測(cè)或封閉280基質(zhì)因子（若已知）有助于了解試驗(yàn)結(jié)果。28131282283四、附錄(-)免疫原性多層級(jí)檢測(cè)策略示意圖待測(cè)樣本層級(jí)1篩選篩選試驗(yàn)陰性樣本陽(yáng)性樣本一報(bào)告陰性.陰性樣本1一一確證試驗(yàn)層級(jí)2確證.284285286確證陽(yáng)性樣本，28728828929

27、0291292293294295296297298299300301302303304305306307（二）抗藥抗體檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證1 .陽(yáng)性對(duì)照抗體作為評(píng)估方法學(xué)性能的關(guān)鍵試劑，陽(yáng)性對(duì)照抗體直接影 響檢測(cè)方法的靈敏度。理想狀況下，陽(yáng)性對(duì)照抗體應(yīng)能夠反 映藥物在受試個(gè)體中的免疫應(yīng)答情況。因此，選擇合適的陽(yáng) 性抗體對(duì)抗藥抗體檢測(cè)方法學(xué)的開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證是非常關(guān)鍵的。陽(yáng)性對(duì)照抗體可通過(guò)免疫動(dòng)物或從商業(yè)公司購(gòu)買獲得。 一般選擇免疫動(dòng)物制備多克隆抗體作為陽(yáng)性對(duì)照抗體。對(duì)于 臨床研究，如可獲得人的抗藥抗體，則建議優(yōu)先采用。如對(duì) 于治療性單克隆抗體，應(yīng)特別考慮陽(yáng)性對(duì)照抗體的代表性， 建議首先根據(jù)抗體的結(jié)構(gòu)

28、類型（如嵌合、人源化或全人源） 評(píng)估其在受試動(dòng)物或人體中可能產(chǎn)生的抗體所針對(duì)的結(jié)構(gòu) 域或抗原表位，然后選擇合適的免疫原針對(duì)性地制備陽(yáng)性對(duì) 照抗體。作為備選,有時(shí)也可選用單個(gè)或多個(gè)單抗的組合作 為陽(yáng)性對(duì)照抗體。如面臨無(wú)法制備陽(yáng)性對(duì)照抗體的特殊情況， 應(yīng)與監(jiān)管機(jī)構(gòu)討論以何種替代手段進(jìn)行方法學(xué)開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證。當(dāng)檢測(cè)模式為橋連法時(shí)（如對(duì)于單抗類藥物），陽(yáng)性對(duì)照抗 體理論上無(wú)種屬限制和免疫球蛋白亞類限制，但應(yīng)注意IgG4 亞類不適用。陽(yáng)性對(duì)照抗體一經(jīng)確定，即可用于評(píng)價(jià)靈敏度、選擇性、 特異性、重現(xiàn)性等方法學(xué)特性。在方法開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證過(guò)程中，采用陽(yáng)性對(duì)照抗體制備高、中、低不同濃度的質(zhì)控或系統(tǒng)適 用性對(duì)照樣品，以考

29、察能否滿足檢測(cè)較寬抗藥抗體濃度范圍 的需要。在常規(guī)方法學(xué)評(píng)價(jià)與監(jiān)測(cè)時(shí)，可只使用高、低濃度 質(zhì)控樣本，而不使用中濃度質(zhì)控樣本。應(yīng)制備低、中、高濃 度陽(yáng)性對(duì)照樣品，進(jìn)行系統(tǒng)適用性考察。對(duì)于非臨床研究, 可根據(jù)靈敏度確定試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用L52倍陰性對(duì)照或 L52倍篩選臨界值儀器響應(yīng)值或其轉(zhuǎn)換值對(duì)應(yīng)的濃度作為 低濃度陽(yáng)性對(duì)照樣品。在臨床研究中，建議采用統(tǒng)計(jì)的方式 確定低濃度陽(yáng)性對(duì)照樣品的濃度，一般以1 %的分析批拒絕率 來(lái)進(jìn)行計(jì)算。中濃度陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中段濃度點(diǎn)。 建議高濃度陽(yáng)性對(duì)照選擇沒(méi)有鉤狀效應(yīng)的信號(hào)曲線高端對(duì) 應(yīng)的濃度，或者模擬樣本中預(yù)期最高濃度水平。3083093103113123

30、133143153163173183193203213223233243253263273282 .陰性對(duì)照為評(píng)價(jià)非特異性本底水平，方法學(xué)驗(yàn)證和樣本檢測(cè)中均 需設(shè)置陰性對(duì)照。陰性對(duì)照為來(lái)自多個(gè)代表性未給藥個(gè)體基 質(zhì)的混合物。由于分析前的變量可能對(duì)陰性對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果 帶來(lái)影響，應(yīng)盡可能模擬待測(cè)樣本的基質(zhì)特點(diǎn)，如基質(zhì)種類 （一般為血清或血漿種屬、性別、年齡和疾病背景等，并 采用與待測(cè)樣本相同的預(yù)處理方式，如相同的抗凝劑、采樣 體積、相似的制備方法和相同的儲(chǔ)存條件等。如在方法開(kāi)發(fā) 和早期驗(yàn)證試驗(yàn)階段暫時(shí)無(wú)法獲得符合上述條件的基質(zhì)，可以采用健康個(gè)體的基質(zhì)，但應(yīng)在獲得與待測(cè)樣本相同的未給 藥群體的基質(zhì)后

31、，對(duì)臨界值、靈敏度和選擇性等重要方法學(xué) 參數(shù)進(jìn)行確認(rèn)。此外，應(yīng)對(duì)基質(zhì)中可能含有的預(yù)存抗體、可 發(fā)生結(jié)合的蛋白、可溶性受體等因素進(jìn)行評(píng)估。329330331332333334335336337338339340341342343344345346347348陰性對(duì)照樣本的信號(hào)值應(yīng)當(dāng)?shù)陀诘咏诤Y選臨界值， 并且能夠代表臨界值確定試驗(yàn)中個(gè)體樣本的信號(hào)波動(dòng)情況, 如陰性對(duì)照的信號(hào)值遠(yuǎn)低于個(gè)體信號(hào)的均值，則不能用于監(jiān) 測(cè)方法的適用性。3 .臨界值臨界值是將樣本定義為陽(yáng)性或陰性結(jié)果的響應(yīng)水平。建 立合適的臨界值可使產(chǎn)生假陰性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)最小化。臨界值可能受多種干擾物或基質(zhì)成分的影響，應(yīng)在方法 開(kāi)發(fā)早期考慮

32、上述因素。由于來(lái)源于不同目標(biāo)人群和疾病狀 態(tài)的樣本中含有的引起背景信號(hào)發(fā)生變化的因素各有不同， 可能需要分別制定不同的臨界值。如果可行，應(yīng)采用未經(jīng)治療的受試者的樣本通過(guò)重復(fù)試 驗(yàn)對(duì)檢測(cè)的變異程度進(jìn)行考察，并基于統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)臨界值 進(jìn)行計(jì)算。在計(jì)算臨界值時(shí)應(yīng)考慮統(tǒng)計(jì)離群值和真實(shí)陽(yáng)性樣 本的影響，并提供剔除任何數(shù)據(jù)點(diǎn)的理由和用于確定離群值 的判斷方法。3493503513523533543553563573583593603613623633643653663673.1 篩選臨界值篩選臨界值用于初步判定待測(cè)樣本為陰性或潛在陽(yáng)性。篩選臨界值的確定應(yīng)基于多個(gè)空白個(gè)體基質(zhì)的響應(yīng)值，從科 學(xué)和生物統(tǒng)計(jì)的角

33、度進(jìn)行綜合考慮。用于計(jì)算篩選臨界值的 空白個(gè)體基質(zhì)的來(lái)源應(yīng)盡量來(lái)自給藥前的受試者或動(dòng)物，如 選擇來(lái)源于其它群體的空白個(gè)體基質(zhì)應(yīng)進(jìn)行合理性論證。通 常，非臨床研究應(yīng)選擇不少于15個(gè)，臨床研究應(yīng)選擇不少于 50個(gè)空白個(gè)體基質(zhì)。臨床研究中至少對(duì)分析人員、日期、儀 器、固相載體等進(jìn)行考察，臨床前至少考察兩個(gè)實(shí)驗(yàn)變量, 分析時(shí)各樣本均設(shè)置復(fù)孔。在進(jìn)行篩選臨界值計(jì)算時(shí)，如果采用參數(shù)方法，需首先 對(duì)響應(yīng)值（或基于陰性對(duì)照校正后的數(shù)值）進(jìn)行正態(tài)分布評(píng) 估，若為非正態(tài),應(yīng)將數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換（或其他形式的轉(zhuǎn) 換）；然后進(jìn)行離群值判斷，各分析批內(nèi)的分析離群值和生 物離群值不參與計(jì)算，將離群值剔除后的所有個(gè)體用于篩選

34、 臨界值的計(jì)算。如采用非參數(shù)法，無(wú)需進(jìn)行數(shù)據(jù)正態(tài)分布評(píng) 估和數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，但仍需剔除異常值。非臨床研究中，篩選臨 界值的確定應(yīng)基于在至少3天進(jìn)行的3個(gè)分析批的響應(yīng)值（或 基于陰性對(duì)照校正后的數(shù)值）進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。臨床研究中，應(yīng)考察至少2名分析員在至少3天進(jìn)行的6個(gè)分析批。建 議采用空白個(gè)體95%百分位數(shù)的單側(cè)90%置信區(qū)間下限計(jì)算 篩選臨界值。例如，正態(tài)分布的95%的百分位數(shù)可通過(guò)個(gè)體 均值加上1.645倍的標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算；也可用其他方法計(jì)算95%的 百分位數(shù)值，如使用中位數(shù)及中位數(shù)的絕對(duì)偏差代替均值與 標(biāo)準(zhǔn)差，但應(yīng)說(shuō)明計(jì)算方法選擇的依據(jù)。36836937037137237337437537637

35、7378379380381382383384385386387388不同批次間，陰性對(duì)照樣品的平均信號(hào)值可能是恒定的， 也可能在不同的分析批、孔板或分析人員之間變化。當(dāng)這之 間的平均值不同時(shí)，但平均值的方差恒定時(shí)，可以運(yùn)用一種 標(biāo)準(zhǔn)化因子來(lái)計(jì)算并用于檢測(cè)中。這種方式獲得的臨界值稱 為浮動(dòng)臨界值，是最常用的臨界值類型。對(duì)于正態(tài)分布數(shù)據(jù)， 當(dāng)均值為常數(shù)時(shí)，可以在試驗(yàn)驗(yàn)證過(guò)程中建立一個(gè)臨界值， 該臨界值可直接用于研究中的檢測(cè)。這就是所謂的固定臨界 值。通常不鼓勵(lì)采用固定臨界值，因?yàn)樗鼰o(wú)法對(duì)研究中陰性 對(duì)照可能的變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)。當(dāng)平均值和方差均不同時(shí)，可能 需要為每個(gè)分析批、孔板或分析人員計(jì)算臨界值。這

36、就是動(dòng) 態(tài)臨界值。然而，這種方法通常不實(shí)用，因?yàn)檫@需要包含更 多的陰性對(duì)照樣品。如果數(shù)據(jù)顯示需要使用動(dòng)態(tài)臨界值時(shí)， 應(yīng)考慮進(jìn)一步開(kāi)發(fā)試驗(yàn)方法，而不是使用動(dòng)態(tài)臨界值。3.2 確證臨界值由于篩選臨界值通常允許至少5%的假陽(yáng)性率，因此經(jīng)篩389390391392393394395396397398399400401402403404405406407408409選試驗(yàn)判定為“潛在陽(yáng)性”的樣本可能是非特異性的，需進(jìn)一 步通過(guò)確認(rèn)試驗(yàn)考察對(duì)藥物的特異性，并基于確證臨界值 （以百分比抑制率表示）確定是否為陽(yáng)性。在確證臨界值確 定試驗(yàn)中，通常將某一特定濃度的受試藥物加入空白個(gè)體基 質(zhì)，通過(guò)加入藥物的空白個(gè)體

37、基質(zhì)復(fù)孔信號(hào)值與未加藥物空 白個(gè)體基質(zhì)復(fù)孔信號(hào)值計(jì)算信號(hào)抑制率。在剔除離群值后, 選擇信號(hào)抑制率的99%分位數(shù)的80%單側(cè)置信區(qū)間的下限（即允許1 %假陽(yáng)性）作為確證臨界值。建議確證臨界值確定試驗(yàn)與篩選臨界值確定試驗(yàn)在同 一個(gè)分析批或分析板上進(jìn)行。對(duì)空白基質(zhì)數(shù)量、考察變量和 復(fù)孔檢測(cè)的要求與篩選臨界值確定試驗(yàn)相同。4 .靈敏度方法靈敏度是指陽(yáng)性對(duì)照樣本檢測(cè)結(jié)果持續(xù)為陽(yáng)性或 讀數(shù)等同于該檢測(cè)方法臨界值的最低濃度。為了在抗藥抗體 水平達(dá)到對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)、藥效動(dòng)力學(xué)、安全性或有效性產(chǎn)生 影響之前被檢測(cè)到，分析方法應(yīng)具有足夠的靈敏度。值得注 意的是，方法靈敏度是通過(guò)陽(yáng)性對(duì)照抗體建立的，可能不能 完全代表

38、特定受試者體內(nèi)的抗藥抗體應(yīng)答情況。陽(yáng)性對(duì)照抗 體通常為高親和力抗體，該抗體可能會(huì)使靈敏度被高估。因 此，方法靈敏度并不是為了確定受試者體內(nèi)抗藥抗體的絕對(duì) 量，而是為了更全面地理解檢測(cè)方法的性能。由于靈敏度可能受樣本中殘留藥物的影響，因此考察在預(yù)期藥物濃度下的 靈敏度是非常重要的。4104114124134144154164174184194204214224234244254264274284.1 方法靈敏度確定方法靈敏度通常有兩種方法。一種方法是在混合空 白生物基質(zhì)中按照不高于23倍的梯度稀釋陽(yáng)性對(duì)照樣品 （應(yīng)采用經(jīng)親和層析純化后的多抗或單抗）至系列（至少5個(gè)） 已知濃度，在至少滿足一個(gè)濃度

39、的響應(yīng)值低于篩選臨界值的 情況下，高于篩選臨界值的最低濃度即為方法靈敏度；另一 種方法是使用混合空白生物基質(zhì)稀釋陽(yáng)性對(duì)照樣品至系列 已知濃度，對(duì)各濃度的響應(yīng)值和濃度進(jìn)行曲線擬合，根據(jù)篩 選臨界值計(jì)算的陽(yáng)性對(duì)照抗體濃度即為方法靈敏度。建議以陽(yáng)性對(duì)照抗體的加樣濃度乘以最小稀釋倍數(shù)后進(jìn)行靈敏度的報(bào)告。如果采用了一個(gè)以上的陽(yáng)性對(duì)照抗體， 建議分別報(bào)告靈敏度。對(duì)于非臨床研究，方法靈敏度一般需達(dá)到250500ng/mL ；對(duì)于臨床研究，在篩選和確證試驗(yàn)中，IgG和IgM型抗藥抗體的檢測(cè)靈敏度應(yīng)至少達(dá)到10。ng/mLe 在某些特定情況下，基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和以往的數(shù)據(jù)，靈敏度大 于100ng/mL也是可以接受的

40、；有文獻(xiàn)報(bào)道，低至100ng/mL 的抗藥抗體水平也會(huì)與臨床反應(yīng)相關(guān)，此時(shí)可考慮更低的靈敏度。IgE型抗藥抗體的檢測(cè)靈敏度需達(dá)到幾百pg/mL或幾 ng/mL級(jí)別。對(duì)于中和活性試瞼的檢測(cè)可能無(wú)法達(dá)到該靈敏 度水平。值得注意的是，方法靈敏度高度依賴于所采用的陽(yáng) 性對(duì)照抗體，不一定能直接反映待測(cè)樣本中的最低檢出水平； 但方法靈敏度提供了分析方法的性能指標(biāo)，有助于在開(kāi)發(fā)階 段選擇最優(yōu)的抗藥抗體檢測(cè)方法。4294304314324334344354364374384394404414424434444454464.2 藥物耐受水平生物樣本中可能含有高濃度的游離受試藥物，可以與捕 獲試劑/檢測(cè)試劑競(jìng)爭(zhēng)結(jié)

41、合抗藥抗體，進(jìn)而干擾抗藥抗體檢測(cè) 導(dǎo)致假陰性結(jié)果。因此，在方法學(xué)早期開(kāi)發(fā)過(guò)程中，應(yīng)評(píng)估 游離受試藥物對(duì)方法學(xué)的干擾，即藥物耐受水平，并在方法 學(xué)驗(yàn)證中進(jìn)行考察。藥物耐受水平需要結(jié)合待測(cè)樣本中的藥物濃度進(jìn)行考 察。一般使用混合空白基質(zhì)稀釋受試藥物至合適系列濃度， 用該系列稀釋樣本與不同濃度陽(yáng)性對(duì)照抗體樣本（至少包含 低濃度陽(yáng)性對(duì)照抗體或者100ng/niL濃度的陽(yáng)性對(duì)照抗體） 混合后進(jìn)行檢測(cè)。響應(yīng)值高于篩選臨界值所對(duì)應(yīng)的最高受試 藥物濃度即為該濃度陽(yáng)性對(duì)照抗體能夠耐受的最大藥物濃447448449450451452453454455456457458459460461462463464465度。

42、值得注意的是，藥物耐受水平數(shù)據(jù)僅代表某特定濃度的 陽(yáng)性對(duì)照抗體樣本對(duì)藥物的耐受特性，由于陽(yáng)性對(duì)照抗體樣 本與待測(cè)樣本中抗藥抗體的親和力存在差異，可能與待測(cè)樣 本中抗藥抗體的藥物耐受性水平有所不同。在方法開(kāi)發(fā)時(shí)，需對(duì)可能影響藥物耐受性的選擇性、靶 點(diǎn)的性質(zhì)及陽(yáng)性對(duì)照類型進(jìn)行考量。如對(duì)于不耐酸的抗體或 可溶性靶點(diǎn)，酸解離可能并不適用?？赏ㄟ^(guò)采集當(dāng)受試者體 內(nèi)藥物濃度達(dá)到谷濃度時(shí)的樣本來(lái)盡量降低藥物的干擾。5 .精密度待測(cè)樣本的檢測(cè)通常是在不同的分析時(shí)間、分析批（板 分析儀器及分析員之間進(jìn)行的，因此分析方法應(yīng)滿足相應(yīng)的 精密度要求，并分別考察篩選試驗(yàn)精密度和確證試驗(yàn)精密度。臨床、非臨床對(duì)精密度的考察

43、類似，但臨床研究中的批 間精密度考察會(huì)納入更多變量與分析批數(shù)量；非臨床至少納 入2個(gè)變量，臨床至少會(huì)納入4個(gè)變量。批內(nèi)精密度來(lái)源于一個(gè)含至少6套獨(dú)立配制的系統(tǒng)適用 性對(duì)照樣品的分析批數(shù)據(jù)，其通過(guò)系統(tǒng)適用性樣品（陰性對(duì)照、 低濃度陽(yáng)性對(duì)照、中濃度陽(yáng)性對(duì)照、高濃度陽(yáng)性對(duì)照）的變異 系數(shù)（CV）來(lái)呈現(xiàn)，其中陽(yáng)性對(duì)照樣品需要采用與分析方法相同的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換方式來(lái)計(jì)算，其不宜高于20%。批間精密度 通過(guò)所有可報(bào)道的驗(yàn)證分析批系統(tǒng)適用性樣品（陰性對(duì)照、低 濃度陽(yáng)性對(duì)照、高濃度陽(yáng)性對(duì)照）的變異系數(shù)（CV）來(lái)呈現(xiàn), 其中陽(yáng)性對(duì)照樣品需要采用與分析方法相同的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換方 式來(lái)計(jì)算,其不宜高于20% ；若高于20%需要

44、優(yōu)化分析方法 或提供合理性說(shuō)明；對(duì)于陰性對(duì)照樣品或高變異度的細(xì)胞學(xué) 試驗(yàn)，其接受標(biāo)準(zhǔn)可適度放寬。4664674684694704714724734744754764774784794804814824834844854866 .特異性特異性是指某種方法對(duì)于某一目標(biāo)分析物的專屬檢測(cè) 能力，特異性較低可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。所開(kāi)發(fā)的分析方法 應(yīng)能夠特異性地檢測(cè)抗藥抗體，而非單抗藥物、可溶性靶點(diǎn)、 非特異性內(nèi)源性抗體或方法中使用的抗體試劑。類似地，對(duì) 于類風(fēng)濕因子高發(fā)的人群，應(yīng)證明類風(fēng)濕因子不會(huì)干擾分析 方法或該方法能夠區(qū)分出類風(fēng)濕因子和特定抗體。如果抗藥 抗體可與宿主細(xì)胞蛋白或其他產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)發(fā)生交叉

45、反應(yīng), 可能需要對(duì)這些反應(yīng)的特異性進(jìn)行評(píng)估。應(yīng)根據(jù)非臨床與臨床試驗(yàn)不同階段的具體情況考察方 法特異性?？疾熘笜?biāo)包括但不限于血清因子（如類風(fēng)濕因子、 脂質(zhì)和血紅蛋白等X預(yù)存抗體和/或合并用藥等對(duì)方法的干 擾作用。應(yīng)采用添加或未添加受試物相關(guān)物質(zhì)的高濃度和低 濃度陽(yáng)性對(duì)照樣本進(jìn)行特異性考察。所有陰性對(duì)照樣本響應(yīng)值或其轉(zhuǎn)換值應(yīng)小于篩選臨界值；80%陽(yáng)性對(duì)照樣本響應(yīng)值 或其轉(zhuǎn)換值應(yīng)不小于篩選臨界值且滿足精密度要求。4874884894904914924934944954964974984995005015025035045055067 .選擇性選擇性是指分析方法能夠在樣本中存在其他成分的情況下檢出特異

46、性針對(duì)該藥物的抗藥抗體的能力。待測(cè)基質(zhì)中 往往含有大量的不同大小和不同電荷的蛋白質(zhì)，可能對(duì)抗藥 抗體的檢測(cè)造成干擾。如未對(duì)分析方法的選擇性進(jìn)行驗(yàn)證易造成非特異性信號(hào)，從而導(dǎo)致陽(yáng)性樣本無(wú)法被正常檢出。通常需要對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行稀釋處理以獲得較為理想的 抗藥抗體檢測(cè)能力。最小稀釋倍數(shù)有多種定義，包括：產(chǎn)生 最高信噪比的樣本稀釋倍數(shù)，產(chǎn)生最接近稀釋液的信號(hào)的樣 本稀釋倍數(shù)，以及導(dǎo)致最高信號(hào)變量比的樣本稀釋倍數(shù)，可 使用上述定義中的任何一種，但是為了有效計(jì)算方法的靈敏 度，最小稀釋倍數(shù)應(yīng)該考慮待測(cè)樣本的最終稀釋程度，通常 為1:5至1:100 （即1/5到1/100 1建議最小稀釋倍數(shù)不要 超過(guò)上100因

47、為過(guò)高的最小稀釋倍數(shù)可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。 在某些情況下，如采用了更高的最小稀釋倍數(shù)，應(yīng)充分考慮 其對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響以及產(chǎn)品的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。建議通過(guò) 對(duì)一定數(shù)量的未給藥受試者樣本來(lái)確定最小稀釋倍數(shù)。最小 稀釋倍數(shù)的確定通常需要連續(xù)稀釋不含藥的抗藥抗體陰性樣本，或者通過(guò)將已知濃度的陽(yáng)性對(duì)照抗體經(jīng)系列稀釋后加 入基質(zhì)配制至高、中、低濃度，與使用稀釋液配制的相同濃 度的陽(yáng)性對(duì)照抗體進(jìn)行對(duì)比。最小稀釋倍數(shù)應(yīng)使用適當(dāng)數(shù)量 的個(gè)體血清樣本來(lái)計(jì)算，樣本的數(shù)量取決于個(gè)體樣本的變異 性等多種因素；一般推薦至少采用10個(gè)樣本。507508509510511512513514515516517518519520521522523524525526方法學(xué)驗(yàn)證時(shí)，采用至少10個(gè)空白個(gè)體基質(zhì)，2個(gè)濃度 水平的陽(yáng)性對(duì)照樣本考察選擇性，并設(shè)置不添加陽(yáng)性對(duì)照抗 體的空白基質(zhì)對(duì)照。要求所有空白基質(zhì)對(duì)照的響