HPLC測(cè)定板藍(lán)根腺苷含量

1、皖南醫(yī)學(xué)院本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 2014屆本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 題目：HPLC法測(cè)定板藍(lán)根藥材中腺苷含量 所 在 學(xué) 院藥 學(xué) 院所 學(xué) 專(zhuān) 業(yè)藥學(xué)年級(jí)、班級(jí)2010級(jí)藥學(xué)(9)班學(xué) 號(hào)10080257完成人姓名馮學(xué)武指導(dǎo)教師姓名張文芝 2014年4月23日HPLC法測(cè)定板藍(lán)根藥材中腺苷含量摘要 目的：建立一種高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定板藍(lán)根藥材中腺苷的含量。方法：用60%甲醇超聲提取板藍(lán)根藥材，HPLC法檢測(cè)腺苷含量，Lichrospher C18柱（4.6mm×250mm，5m）為色譜柱，甲醇-水（10:90）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm，流速為1.0ml/min，柱溫

2、為30。結(jié)果：腺苷在0.198-0.66µg范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線(xiàn)性關(guān)系，r=0.9993(n=5)；平均回收率為99.68%，RSD%=1.03%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便快速，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于板藍(lán)根藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。關(guān)鍵詞 腺苷；板藍(lán)根；高效液相色譜法Determination of Adenosine Content in Banlangen by HPLC MethodABSTRACTOBJECTIVE: To develop a method for adenosine content in banlangen herbs by HPLC METHOD: Extracted

3、 with 60% methanol content ultrasound banlangen by high performance liquid chromatography, .Eluted with methyl:water(10:90) in a flow rate 1.0ml/min,adenosine was analyzed under the wavelength of 260nm in ODS C18 column, temperature was 30.RESULTS: Adenosine in the range of 0.198-0.66g showed a good

4、 linear relationship, r = 0.9993 (n = 5); average recovery was 99.86%, RSD% = 1.03%. CONCLUSION: The method is simple, rapid, accurate and reliable measurement results can be used for quality control of banlangenKey words: Banlangen HPLC method Adenosine 第 1 頁(yè) 共 2頁(yè)目 錄 中文摘要1英文摘要1 1引言12儀器材料12.1 實(shí)驗(yàn)儀器12

5、.2試劑藥品13 方法13.1實(shí)驗(yàn)原理13.2色譜條件13.2.1檢測(cè)波長(zhǎng)選擇13.2.2最佳色譜條件13.3 對(duì)照品溶液的制備13.4 供試品溶液的制備13.5 線(xiàn)性關(guān)系考察23.6 精密度試驗(yàn)23.7穩(wěn)定性試驗(yàn)23.8重復(fù)性試驗(yàn)2 3.9加樣回收試驗(yàn)24.討論35.結(jié)論 36 參考文獻(xiàn)57 致謝6第 0 頁(yè) 共 1 頁(yè)1 引言板藍(lán)根為十字花科菘藍(lán)屬植物菘藍(lán)Isatisindigotica Fort.的干燥根,中國(guó)藥典1985一2010年版一直有收載,具有性寒味苦,有清熱解毒、涼血消腫的功效,臨床應(yīng)用廣泛。而中國(guó)藥典未規(guī)定其質(zhì)量控制的含量測(cè)定方法和指標(biāo)。腺苷是板藍(lán)根所含的一種天然成分,具有抗

6、凝血、抗擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、松弛支氣管平滑肌、鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)和抗心率不齊的作用1，板藍(lán)根藥材是公認(rèn)的具有抗病毒的有效中藥，在臨床中廣泛使用。盡管對(duì)它們已作了很多研究，但其有效成分及其作用機(jī)理尚未有確切的結(jié)論，幾十年來(lái)板藍(lán)根藥材及其制劑的質(zhì)量監(jiān)控一直未能解決2.3。文獻(xiàn)報(bào)道中有人主張它們的質(zhì)量控制指標(biāo)應(yīng)選靛藍(lán)、靛玉紅。但也有人認(rèn)為“抗內(nèi)毒素試驗(yàn)表明:靛藍(lán)和靛玉紅不具有抗內(nèi)毒素活性。”4而它們的水溶性成分卻具有很強(qiáng)的抗病毒、抗菌、抗內(nèi)毒素、增強(qiáng)機(jī)體免疫作用?？谇昂逅{(lán)根制劑多采用水作為提取溶劑，而靛藍(lán)和靛玉紅具有很強(qiáng)的脂溶性，有人對(duì)水提取液的靛藍(lán)、靛玉紅作了含量測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其提取率僅為1.5% -3.5

7、%。此外，濃縮過(guò)程的損失率高達(dá)92 4%;在通過(guò)提取、濃縮、醇沉、收膏等操作后，其轉(zhuǎn)移率僅為3.3%-13%5.6 。文獻(xiàn)報(bào)道，板藍(lán)根藥材的水溶性成分腺苷，具有抗炎作用6.7，與板藍(lán)根藥材功能主治一致。但目前尚未有板藍(lán)根腺苷含量測(cè)定的相關(guān)報(bào)道。腺苷的含量測(cè)定方法有薄層掃描法、薄層一紫外法、紫外分光度法及高效液相色譜法等。高效液相色譜法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。通過(guò)試驗(yàn)，建立了腺苷含量測(cè)定的高效液相色譜法，為板藍(lán)根藥材及其制劑的質(zhì)量控制提供了較為實(shí)用的檢測(cè)方法。1化學(xué)成分 到目前為止，己經(jīng)從板藍(lán)根中分離出近百個(gè)化合物，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道主要有以下十一大類(lèi)。即生物堿類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、木脂素

8、類(lèi)、蒽醌類(lèi)、甾醇類(lèi)、芥子類(lèi)苷、含硫類(lèi)、氨基酸類(lèi)、核苷類(lèi)及其它類(lèi)化合物。 1.生物堿類(lèi)化合物1.1吲哚類(lèi)生物堿:靛藍(lán)(indigotin) ,靛紅(isatin)，靛玉紅(indirubin) ,靛苷(indoxyl-glucoside)8,2,5-二羥基吲哚(2,5-dihydroxy-indole), 2,3-二氫-4-羥基-O-吲哚-3-乙腈(2.3-dihydro-4-hydroxy-2-oxo-indole-3-acetonitrile),吲哚-3-乙腈-6-O-D-葡萄糖苷(indole-3-acetonitrile-6-O-D-glucopyranoside)9,羥基靛玉紅(hyd

9、roxyindirubin)10，依靛藍(lán)酮(isaindigodione)11和(E)-二甲氧羥芐吲哚(E)-3-(3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzylidene)-2-indolinone)12,青黛酮(qingdainone)13, 1-甲氧基-3-乙腈基吲哚，3-乙酸基吲哚，3-吲哚醛(3-formyl-indole), 1一甲氧基一3-吲哚醛14，脫氧鴨嘴花堿酮(deosyvasicinone)15 ,(E)-2-(3-吲哚）腈基亞甲基3-吲哚16 1.2喹唑酮類(lèi)生物堿:isaindigotone10, 2,4(1H,3H)-喹唑二酮17，色胺酮(tryptant

10、hrin)9,3-(2-羧基苯基-4(3H)-喹唑酮(3-(2-carboxyphenyl)-4(3H)-quinazolinone), 4(3H)-喹唑酮(4(3H)-quinazolinone)13, 3-羥苯基喹唑酮(3-(2-hydroxyphenyl)-4(3H)-quinazolinone)11。 1.3喹啉類(lèi)生物堿:依靛藍(lán)雙酮(isaindigotidione)12，板藍(lán)根甲素(Isatan A)31, 3-2-(5-羥甲基)呋喃基-1 (2H)一異喹啉酮-7-O-D-葡萄糖苷(3-2-(5-hydroxymethyl)furyl-1 (2H)-is )quinolinone-7

11、-O-D-glucoside)32, 2，3-二氫-1H- 吡咯并2,1-c1,4苯并二氮雜蘿-5.11(10H.11aH)-二酮(2,3-dihydro-1 H-pyrrolo 2,1-c 1,4benzodiazepine-5.,11(1 OH,1 l aH)-dion .)20。 2.有機(jī)酸類(lèi)化合物:吡啶-3-羧酸(3-pyridinecarboxylic acid)，順丁烯二酸(maleic acid),2-羥基-1,4-苯二甲酸(2-hydroxy-1,4-benzenedicarboxylic acid)，苯甲酸(benzoic acid)，水楊酸(salicylic acid)，

12、丁香酸(syringic acid)18，棕櫚酸(palmitic acid),琥珀酸(succinic acid)19,鄰氨基苯甲酸(2-amino benzoic acid)20, 5-羥甲基糠酸(5-hydroxymethyl furoic acid)21。 3.黃酮類(lèi):新橙皮苷(neohesperidin)，甘草素(liquiritigenin)，異甘草素(isoliquiritigenin)22 ,異杜荊苷(isovitexin)，蒙花苷(linarin)20，半齒澤蘭素(eupatorin)15 。 4.木脂素類(lèi):(-)關(guān)落葉松脂素(-)-lariciresinol)，落葉松脂素-

13、4-O-D葡萄糖苷(la -iciresinol-4-O-D-glucopyranoside)，落葉松脂素-4，4-二-O-D-葡萄糖苷(la -iciresinol-4,4-di-O-D-glucopyranoside) , 4-(1,2,3一三羥基丙基）-2,6-二甲氧基苯基-1-O-D-葡萄糖苷(4-(1.2,3-trihydroxypropyl)-2,6-dimethoxyphenyl-l-O-D-glucopyranoside),紫丁香苷(syringin)13(+)-異落葉松脂素(+)-isolariciresinol)15 。 5. 蒽醌類(lèi)化合物:大黃素(emodin)6，大黃素

14、-8-O-D-糖苷(emodin-8-O-D-glucoside)20。 6.甾醇類(lèi)化合物:-谷多醇（-sitosterol)，胡蘿卜昔(daucosterol)20 ,-谷甾醇(-sitosterol )24，扶桑甾醇。 7.芥子苷類(lèi)化合物:黑芥子苷(sinigrin),葡萄糖蕓薹素(3-indolylmethyl gluosinolate)，新葡萄糖蕓薹素(neoglucobrassicin), 1-硫代-3-吲哚甲基芥子油苷(1-sulpho-3-indolylmethylgluosinolate)25。 8.含硫類(lèi)化合物:表告依春(epigoitrin) , 1-硫氰基-2-羥基一3-

15、丁烯(1-thiocyano-2-hydroxy-3-butene)26。 9.氨基酸類(lèi)化合物:脯氨酸(praline)，精氨酸(arginine),酪氨酸(tyrosine),纈氨酸(valine),谷氮酸(glutamate acid),-氨基丁酸(-aminobutyric acid)23，亮氨酸，色氨酸，天門(mén)冬氨酸.蘇氨酸，絲氨酸，甘氨酸，異亮氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，組氨酸，賴(lài)氨酸。 10.核苷類(lèi)化合物:尿苷(uridine)，次黃嘌呤(hypoxanthine)，尿嘧啶(uracil)，腺苷(adenosine)，鳥(niǎo)嘌呤(guanine)13。 11.其他類(lèi):甲酸銨22，蔗糖(suc

16、rose), 5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethyl-furaldehyde), n-丁基-O-D-毗喃果糖21,n-丁基-O-D-塔格糖苷27，甘露醇mannitol 26，焦脫鎂葉綠酸(pyrophaeophorbidea)13，遠(yuǎn)志醇(polygalitol)18 。 其他物質(zhì) 微量元素K, Ca,Mg,Zn, Fe,Cu Mn, Pb,Hg,Ce,Co，Ni,Cd和As其中Ca, M n, Zn, Fe含量較為豐富2藥理活性 板藍(lán)根臨床上多用于流感等病毒感染性疾病，療效確切?，F(xiàn)代藥理研究表明板藍(lán)根具有明顯的體內(nèi)外抗流感病毒活性，抗病毒作用是它的主要藥效作用之一。同時(shí)由于板藍(lán)根成

17、分復(fù)雜多樣，經(jīng)藥理試驗(yàn)表明還具有抗菌、清除內(nèi)毒素等藥理活性。2.1抗內(nèi)毒素作用 多數(shù)認(rèn)為是有機(jī)酸類(lèi)成分有較強(qiáng)清除內(nèi)毒所作用，而可能的機(jī)制為對(duì)于內(nèi)毒素誘生炎性介質(zhì)(TNF-，I L-6)有抑制作用35。2.2抗病毒作用 水提液、醇提液等有明顯的抗流感病毒作用;抗流感病毒活性部位可能為結(jié)合氨基酸;有抑制HBsAg活性作用33，腺苷可抑制HSV-1病毒的生物合成，對(duì)腮腺炎病毒、皰疹病毒有抑制作用;板藍(lán)根抗病毒可能的機(jī)制為保護(hù)宿主細(xì)胞或直接抑制病毒的活性34。2.3抗菌作用 水浸液對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草桿菌、八聯(lián)球菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、甲型鏈球菌、肺炎雙球菌、流感桿菌、腦膜炎雙球菌均有

18、抑制作用35。2.4抗炎作用 乙醇提取液可通過(guò)對(duì)非特異性炎癥模型及肉芽腫組織增生的抑制，而發(fā)揮抗炎作用。多糖可抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，減少炎癥因子的產(chǎn)生，用于炎癥性疾病的防治。2.5免疫調(diào)節(jié)作用 板藍(lán)根多糖可顯著促進(jìn)小鼠免疫功能。進(jìn)一步研究表明板藍(lán)根凝集素(屬板藍(lán)根多糖)可與細(xì)胞表面糖蛋白結(jié)合，促進(jìn)小鼠胸腺的發(fā)育和胸腺細(xì)胞的增殖，間接地維持胸腺微環(huán)境，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞、胸腺上皮細(xì)胞分泌胸腺素和細(xì)胞因子，提高機(jī)體的免疫力。從板藍(lán)根二氯甲烷一甲醇(1:1)提取物中分離出的A、B、C、D、E5個(gè)流分及其相應(yīng)的亞流分對(duì)人多形核細(xì)胞化學(xué)發(fā)光的影響既有增強(qiáng)作用，又有抑制作用，提不有可能從板藍(lán)根中獲得免調(diào)

19、節(jié)類(lèi)藥物40。2.6活血化瘀作用 從歐洲菘藍(lán)中分離得到尿苷、次黃嘌呤、尿嘧啶、水楊酸等對(duì)ADP誘導(dǎo)的家兔血小板聚集表現(xiàn)一定的抑制活性，在0.21mg/ml最終濃度抑制率分別為18.2 %,24.2%、10.8 %, 20 %40.溫?zé)岵“l(fā)展到一定階段常見(jiàn)血小板功能亢進(jìn)、內(nèi)外凝血系統(tǒng)激活、血液流變性改變等血瘀證表現(xiàn)。游松等發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根對(duì)二磷酸腺苷(ADP)誘導(dǎo)引起的家兔血小板聚集有明顯的抑制作用，并有一定活血化瘀功效，并認(rèn)為有效成分為尿苷、雌黃嘌呤、尿嘧啶、水楊酸，這些化合物對(duì)溝通中藥的清熱解毒藥物與活血化瘀藥物之間的聯(lián)系起著某種積極的作用 。 以上分析可見(jiàn)，板藍(lán)根具有多種藥理活性，然而其作用機(jī)制

20、和物質(zhì)基礎(chǔ)并未完全闡明，其抗病毒活性是多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的整合作用結(jié)果。3.質(zhì)量控制以中國(guó)藥典一部2010年版收載的板藍(lán)根藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為主對(duì)其質(zhì)量控制現(xiàn)狀分析如下: 板藍(lán)根藥材質(zhì)量控制研究現(xiàn)狀36373839標(biāo)準(zhǔn)/方法項(xiàng)目主要內(nèi)容藥典標(biāo)準(zhǔn)【基原鑒定】植物來(lái)源【性 狀】外觀(guān)、斷曲、顏色、氣味【鑒 別】顯微、熒光、薄層色譜(精氨酸定性檢識(shí)) 其 他水分、浸出物其他標(biāo)準(zhǔn)/方法【含量測(cè)定】指標(biāo)成分:尿苷、腺苷、氨基酸、有機(jī)酸、多糖、靛藍(lán)、靛玉紅、表告依春【指紋圖譜】化學(xué)指紋圖譜【生物控制】抑菌活性測(cè)定、抗病毒活性測(cè)定、生物熱力學(xué)活性測(cè)定等。 以上分析可以看出，常規(guī)鑒別在板藍(lán)根藥材的定性鑒別方面有一

21、定價(jià)值，但以感官鑒別為主，不能很好地進(jìn)行定量分析，對(duì)于喪失外觀(guān)性狀特征的加工品、提取物、制劑等則不能很好的鑒別分析;對(duì)于成分的定性/定量檢測(cè)的研究中，則對(duì)板藍(lán)根所含的大類(lèi)成分幾乎均有涉及，但與藥效關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)、專(zhuān)屬性差或無(wú)法檢測(cè)，化學(xué)指紋圖譜的研究也不能包涵板藍(lán)根的所有化學(xué)信息，同樣存在關(guān)聯(lián)性不好，重現(xiàn)性差等局限性;生物控制方法有望成為解決板藍(lán)根質(zhì)量控制難題的有效途徑之一，符合中藥質(zhì)量控制研究的新趨勢(shì)，但目前的研究處于起步階段，尚無(wú)實(shí)際應(yīng)用。 本課題將以板藍(lán)根主要功效和生物活性為指標(biāo)，嘗試以板藍(lán)根藥材中水溶性成分腺苷作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行系統(tǒng)的研究，以期建立板藍(lán)根品質(zhì)評(píng)價(jià)與質(zhì)量控制的檢定方法，制訂

22、相應(yīng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，與現(xiàn)有藥典方法為主要參考，以完善和提高板藍(lán)根現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控水平。2 儀器材料2.1 實(shí)驗(yàn)儀器LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津），SPD-M20A型紫外檢測(cè)器（日本島津），超聲清洗器（KQ3200E型超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司），容量瓶，微量注射器，分析天平（FA2004型電子天平，上海良平儀器儀表有限公司）粉碎機(jī)，回流裝置，微波爐2.2 試劑藥品 板藍(lán)根藥材（購(gòu)于亳州市貢藥飲片廠(chǎng)），腺苷對(duì)照品（滬試商標(biāo)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），甲醇為色譜純（滬試商標(biāo)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），其余試劑均為分析純，水為蒸餾水（皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)中心供）3

23、 方法3.1實(shí)驗(yàn)原理 高效液相色譜分離是利用試樣中各組分在色譜柱中的淋洗液和固定相間的分配系數(shù)不同，但是楊歲流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱中后，組分就在其中的兩相間進(jìn)行反復(fù)多次（103-106)的分配（吸附-脫附-放出）由于固定相對(duì)各種組分的媳婦能力不同（既保存作用不同），因此各組分在色譜柱的運(yùn)行速度就不同，經(jīng)過(guò)一定的柱長(zhǎng)后，便彼此分離，順序離開(kāi)色譜柱進(jìn)入檢測(cè)器，產(chǎn)生的離子信號(hào)經(jīng)放大后，在記錄器上描繪出各組分的色譜峰。3.2色譜條件3.2.1檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 取腺苷對(duì)照品，加流動(dòng)相制成每1ml中含20g的溶液，用紫外檢測(cè)對(duì)其掃描，發(fā)現(xiàn)腺苷標(biāo)準(zhǔn)品在260nm處有最大吸收，且沒(méi)有干擾，因而選擇260nm為最佳檢測(cè)波

24、長(zhǎng)3.2.2最佳色譜條件 十八烷基硅烷鍵合硅膠填充劑作為色譜柱；甲醇水（10:90）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)260nm；流速為1.0mL/min；柱溫為30。3.3對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取腺苷對(duì)照品6.6 mg，置50 ml容量瓶中，加10%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液，制成濃度為0.132 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)液備用3.4 供試液溶液的制備 取買(mǎi)來(lái)的市售板藍(lán)根藥材塊，研碎成粉末（過(guò)40目篩），精密稱(chēng)取板藍(lán)根藥材粉末1g，置50ml具塞錐形瓶中，分別精密加入60%甲醇20mL，稱(chēng)定重量，超聲提?。üβ?50W頻率20kHz)30 min，取出過(guò)濾，冷卻后加入60%甲醇補(bǔ)足重量，于0.5m微孔濾

25、膜過(guò)濾，取續(xù)濾液即得供試品溶液3.5線(xiàn)性關(guān)系的考察 精密量取儲(chǔ)備液0.6ml、1.0ml 、1.3ml 、1.7ml 與2.0ml于10ml容量瓶中，加10%甲醇稀釋至刻度，高效液相色譜儀測(cè)定峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，y=5252.1x-323.21，相關(guān)系數(shù)為0.9993，腺苷進(jìn)樣量在0.198-0.66g范圍有良好的線(xiàn)性關(guān)系。結(jié)果見(jiàn)下表、 表1 線(xiàn)性關(guān)系實(shí)驗(yàn)進(jìn)樣量（g)0.198 0.33 0.429 0.561 0.66峰面積(Au)724.113 1424.341 1886.184 2642.900 3145.497 方程y=5252.1x

26、-323.21 R2=0.99933.6精密度試驗(yàn) 取腺苷對(duì)照品溶液25l重復(fù)進(jìn)樣5次，按上述實(shí)驗(yàn)方法項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，測(cè)得的峰面積如下： 35.5778, 35.5569, 35.6554, 35.4050, 35.7046, ，RSD%=0.377%，表明儀器精密度良好。3.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取新制備的供試品溶液，分別于0,2，4，8,12h測(cè)定峰面積，測(cè)定的峰面積如下:25.1987,25.5894,25.4876,25.3365, 25.6966, RSD%=0.19%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。3.8重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)的板藍(lán)根藥材3份，按供試品項(xiàng)制備供試液，得板藍(lán)根顆粒的RSD%

27、=1.58%，表明方法重現(xiàn)性良好。 供試品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)圖譜3.9加樣回收實(shí)驗(yàn)取同一批號(hào)的板藍(lán)根藥材0.5g，精密稱(chēng)定，平行5份，精密加入適量的腺有對(duì)照品溶液，按“3.4"項(xiàng)下制備供試品溶液并測(cè)定。(見(jiàn)表2) 表2加樣回收實(shí)驗(yàn) 編號(hào)樣品腺苷含量（mg)加入腺苷含量（mg)測(cè)得量（mg)回收率%平均回收率%RSD 10.19920.15900.356598.8799.681.03% 20.21350.19880.407899.75 30.21090.27820.487899.53 40.24950.31800.559697.50 50.23320.39750.629799.75由上表可得平

28、均回收率為99.68%，且回收率均在95%-105%之間，符合HPLC定量分析的要求。3.10樣品含量的測(cè)定 取不同來(lái)源的板藍(lán)根藥材3批，精密稱(chēng)定1g，粉碎，過(guò)3號(hào)篩，按供試品溶液的制備方法項(xiàng)制備，進(jìn)樣測(cè)定腺有含量，3種來(lái)源的板藍(lán)根藥材的腺含量有差別顯著。(見(jiàn)表3） 表3 不同來(lái)源的板藍(lán)根藥材中腺苷含量 來(lái)源亳州市貢藥飲片廠(chǎng)河北省安國(guó)市瑞琪中藥材有限公司亳州養(yǎng)生坊中藥材專(zhuān)售含量（g/g)160.6216.3110.824討論1.現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根具有多方面藥理作用。目前，板藍(lán)根及其制劑的質(zhì)量控制多以靛藍(lán)、靛玉紅的含量測(cè)定(高效液相色譜法)為指標(biāo)，而板藍(lán)根中靛藍(lán)、靛玉紅的含量?jī)H為百萬(wàn)分之幾，

29、且樣品溶液的制備需用氯仿回流提取很長(zhǎng)時(shí)間(回流提取一次8h或回流提取3次，每次2h)，因而不利于板藍(lán)根飲片炮制或板藍(lán)根制劑制備工藝的篩選控制和成品質(zhì)量控制。板藍(lán)根所含的腺苷具有抗凝血、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、松弛支氣管平滑肌、鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)和抗心率不齊的作用1，在板藍(lán)根中含量較高(約0.2 mg/g)，且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，用高效液相色譜法便于測(cè)定其含量，操作簡(jiǎn)便、易行。2. 樣品處理方式的選擇，包括提取溶劑的考察和提取方式的考察，據(jù)謝宗明等人的實(shí)驗(yàn)參考，在不同比例的溶劑中，60%甲醇提取板藍(lán)根藥材效率最高，超聲提取腺苷的效率也明顯高于回流提取，且方法更高效方便443. 通過(guò)對(duì)來(lái)自不同廠(chǎng)家的板藍(lán)根藥材的核苷類(lèi)成

30、分的分析，發(fā)現(xiàn)腺苷的含量差別很大，含量高的達(dá)216g/g，含量低的僅10.82 g/g。另由陳矛等人的研究也同樣證實(shí)了這一點(diǎn)43。腺苷的含量水平反映了板藍(lán)根藥材的用量，我們通過(guò)對(duì)提取工藝過(guò)程中腺苷轉(zhuǎn)移率的考察表明，腺苷的轉(zhuǎn)移率達(dá)90%以上。板藍(lán)根中藥材用量的懸殊的差別嚴(yán)重影響了板藍(lán)根藥材的質(zhì)量和療效，影響了板藍(lán)根中成藥的市場(chǎng)形象，由此可見(jiàn)，制訂能夠反映板藍(lán)根顆粒中板藍(lán)根藥材用量的含量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于質(zhì)量控制非常重要。 4.流動(dòng)相選擇根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道41 -45先后用分別以甲醇-水（10:90）、乙腈-水（4：96）、甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液（15:85）、甲醇-磷酸鹽緩沖液（pH=7.3)(

31、10：90)等為流動(dòng)相進(jìn)行考察，結(jié)果以甲醇-水（10:90）為流動(dòng)相，所得腺苷峰型良好，峰型尖銳且對(duì)稱(chēng)性號(hào)，分離度高，效果較好。 5 結(jié)論 通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)分析，表明HPLC法測(cè)定板藍(lán)根藥材含量樣品處理方法便捷，測(cè)定方法簡(jiǎn)單，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果也符合規(guī)定，為測(cè)定板藍(lán)根中腺苷建立了一個(gè)穩(wěn)定可靠的定量分析方法。 考文參獻(xiàn)1 張敏如洪亮郭群.高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉和金水寶膠囊中腺苷的含量J.中草藥1994.25(2): 772 張潤(rùn)珍張玉文.板藍(lán)根的研究進(jìn)展J.中草藥2000 31( 6 ):474-4773 周海燕，薄少英，安靜，等.板藍(lán)根的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用J.北京中醫(yī)藥人學(xué)學(xué)

32、報(bào)2000 12(增刊):121-1234 張漢明，張戈，喬傳卓.板藍(lán)根和人青葉不同部位的靛藍(lán)、靛玉紅含量測(cè)定及其部分成分的抗內(nèi)毒素作用J.藥學(xué)實(shí)踐雜志，2000 18 (5): 3475 陳玉生許東明.板藍(lán)根制劑提取工藝的探討J.中國(guó)中藥雜志，1990 15(7): 30-326 徐汝明，陸陽(yáng)，陳澤乃.紫外分光光度法測(cè)定貝母中腺苷的含量J.中國(guó)中藥雜志1996 21(9): 556-5577 H irohiA Robert E W, G ranger D N. Leukocyte adherence in ratmesenteric venules effects of adenosine

33、and methotrexateJ.Gastroenterol 1993 104 31.8中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典S.廣州:廣東科技出版社，1995( I ):1719趙達(dá)文，等.常用中藥材組織粉末圖解M.北京:人民衛(wèi)生出版社.1991: 1810崔熙，李松林，王建新，等.南、北板藍(lán)根的鑒別和氨基酸含量比較分析J.中藥材，1992.15 (5):1711中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，等.中藥志(第一冊(cè))M.北京:人民衛(wèi)生出版社，1979:45312喬傳卓，吳美樞，戴富寶，等.菘藍(lán)的多倍體育種研究J.植物學(xué)報(bào)，1989.31(9):67813喬傳卓，戴富寶，等.兩種倍性水平

34、菘藍(lán)的生藥學(xué)研究J.中草藥，1995.26(8):42314張時(shí)行.靛青根化學(xué)成分的研究J.中草藥，1983.14(6):7-915江蘇新醫(yī)學(xué)院編.中藥大辭典(上冊(cè))S上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1977:125016 Li B. Chen W S, Zheng S Q，et al. Two new alkaloids isolated from tetraploidy Banlangen J.Acta PharmSin(藥學(xué)學(xué)報(bào)),2000.35(7):508-51017 Ding S P, Liu Y H, Li J，et al. Study of the chemical constitu

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36、海，吳曉云，方建國(guó)，等.板藍(lán)根化學(xué)成分研究(V)J.中南藥學(xué)，2003.1(5):302-30523徐晗，方建國(guó).王少兵，等.板藍(lán)根化學(xué)成分研究J.中國(guó)藥學(xué)雜志，2003,38(6):418-41924劉海利，吳立軍，李華，等.板藍(lán)根的化學(xué)成分研究J.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào).2002.19(2):93-9525何軼，魯靜，林瑞超等.板藍(lán)根化學(xué)成分研究J.中草藥， 2003,349):777-77826柏健，肖慧，何結(jié)煒、等.板藍(lán)根化學(xué)成分研究J.中國(guó)中藥雜志，2007,32(3):271-27227李彬，陳萬(wàn)生，趙陽(yáng)，等四倍體板藍(lán)根中的苯丙素類(lèi)成分J.中草藥，2005.36(3):326-32828 Elliott MC. compounds from isatis indigotica Fort. J. Phyt