3 轉(zhuǎn)錄 (2)ppt課件

1、13 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄3.1 轉(zhuǎn)錄的要點轉(zhuǎn)錄的要點3.2 原核生物的轉(zhuǎn)錄原核生物的轉(zhuǎn)錄3.3 真核生物的轉(zhuǎn)錄真核生物的轉(zhuǎn)錄3.4 RNA 的剪輯與加工的剪輯與加工2Reverse transcriptionDNA synthesis中心法則中心法則33.1 轉(zhuǎn)錄的綱要轉(zhuǎn)錄的綱要4轉(zhuǎn)錄（轉(zhuǎn)錄（transcription) :拷貝出一條與DNA鏈序列完全相同的RNA單鏈的過程。有義鏈有義鏈 sense strand (編碼鏈編碼鏈coding strand)與與mRNA序列相同的那條序列相同的那條DNA鏈。鏈。反義鏈反義鏈 antisense strand (模板鏈Template strand) 有義鏈

2、的互補鏈，根據(jù)堿基有義鏈的互補鏈，根據(jù)堿基配對原則指導配對原則指導mRNA合成的合成的DNA鏈。鏈。關鍵詞關鍵詞5啟動子（啟動子（Promoter) RNA聚合酶識別和結(jié)合并啟動轉(zhuǎn)錄的DNA序列. 轉(zhuǎn)錄起始點轉(zhuǎn)錄起始點 (startsite) 與新生RNA鏈第一個核苷酸相對應DNA鏈上的堿基，通常為一個嘌呤終止子終止子(terminator) DNA上引起RNA聚合酶終止轉(zhuǎn)錄的序列.關鍵詞關鍵詞Transcription unit6 RNA的酶促合成的酶促合成rNTP n rNTPrNTP-(rNMP)n nPPiDNA templateRNA-P, Mg2RNA合成: 前體為4種5-核苷三磷

3、酸(rNTP) ATP,GTP,CTP和UTP;模板為DNA雙鏈分子中的一條鏈;催化合成的酶為RNA polymerase;不需要引物,直接開始新生RNA鏈的延伸;堿基配對原則:A-U(T), C-G;聚合反應中生成磷酸二酯鍵,釋放出PPi;新生RNA鏈的延伸方向: 5 373.2 原核生物的轉(zhuǎn)錄原核生物的轉(zhuǎn)錄3.2.1 RNA 聚合酶聚合酶3.2.2 啟動子的組成啟動子的組成3.2.3 轉(zhuǎn)錄的起始和延伸轉(zhuǎn)錄的起始和延伸 3.2.4 大腸桿菌中兩種終止子大腸桿菌中兩種終止子 83.2.1 RNA聚合酶聚合酶 RNA聚合酶核心酶聚合酶核心酶： 2RNA聚合酶全酶：聚合酶全酶：2 RNA聚合酶各亞

4、基的功能（見聚合酶各亞基的功能（見左圖）左圖）910n 細菌RNA pol的核心酶含兩個相同的亞基(由rpoA基因編碼)，為核心酶的組裝所必需，負責識別和結(jié)合啟動子，其N-端結(jié)構(gòu)域參與聚合酶的組裝，C-端結(jié)構(gòu)域參與和調(diào)節(jié)亞基之間的相互作用，以及和增強子元件結(jié)合。此外，亞基在全酶與某些轉(zhuǎn)錄因子相互作用時也發(fā)揮重要作用。 n 和亞基分別由基因rpoB和rpoC編碼，目前認為二者共同構(gòu)成催化部位。亞基是催化部位的主體。研究表明，亞基有兩個結(jié)構(gòu)域，分別負責轉(zhuǎn)錄的起始和延伸， 亞基帶正電荷，與DNA靜電結(jié)合，可結(jié)合兩個Zn2+參與催化過程。利福平能與亞基結(jié)合，強烈地抑制原核生物轉(zhuǎn)錄的起始，但對真核生物的

5、RNA pol不起作用，因此，可用于治療結(jié)核病和麻風病。轉(zhuǎn)錄的另一種抑制劑肝素，因富含陰離子，能與DNA競爭性地結(jié)合于 亞基上，表明 亞基可能是RNA pol與模板DNA的結(jié)合部位。 11Sigma因子因子 是酶的別構(gòu)效應物，提高RNA聚合酶對啟動子的親和力，降低與模板DNA上非特異位點的結(jié)合力。大腸桿菌中有多個 因子, 每個因子能識別不同的啟動子。 sigma 亞基只在轉(zhuǎn)錄的起始階段起作用亞基只在轉(zhuǎn)錄的起始階段起作用12nE.coli的因子由基因rpo D編碼，其主要作用是特異性地識別轉(zhuǎn)錄的起始位點啟動子。啟動子啟動子(promoter)是RNA聚合酶識別、結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄的一段特異性的DNA

6、序列，一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點(+1)的上游，可以同RNA聚合酶特異性結(jié)合，但本身的序列不被轉(zhuǎn)錄。核心酶雖可與DNA結(jié)合，但不能區(qū)別啟動子和一般的DNA序列，或者說不能正確識別啟動子的特異序列。因子與核心酶結(jié)合后，全酶對啟動子的特異性結(jié)合能力是對其他DNA序列結(jié)合能力的107倍。其原因是，核心酶對DNA序列結(jié)合的親和力建立在堿性蛋白和酸性核酸之間靜電吸附作用力之上，這種結(jié)合是沒有特異性的松散結(jié)合，而且被結(jié)合的DNA仍然保持雙螺旋狀態(tài)。因子能大大降低RNA pol與一般DNA序列的結(jié)合常數(shù)和停留時間，同時又增加RNA pol與啟動子的結(jié)合常數(shù)和停留時間，使RNA pol能正確的識別啟動子的特異序列，

7、并與之結(jié)合。 13n 不同的因子可以識別不同的啟動子。如E.coli的一般基因由70(Mr為70103)識別, 枯草芽孢桿菌因子的主要類型為43。識別熱休克應激蛋白基因啟動子的為32，溫度升高時，基因rpoH的產(chǎn)物32濃度升高，溫度回降時，32濃度降低?？梢约僭O，70與32通過競爭已有的核心酶，調(diào)控蛋白質(zhì)合成的起始。誘導32產(chǎn)生的基本信號是因溫度升高引起的未折疊蛋白的聚集。在固氮菌中識別固氮酶相關基因啟動子的為54，當培養(yǎng)基中缺乏氮時，E.coli中會有少量54存在，在這種情況下，基因會轉(zhuǎn)向利用其它可替代的N源。 n 亞基由基因rpoZ編碼，Mr為1.10104，曾長期被忽略，甚至許多人不把它

8、作為聚合酶的組分。然而，現(xiàn)在已經(jīng)肯定，亞基是嗜熱水生菌RNA pol必不可少的組分，也是體外變性的RNA pol成功復性所必需的，它與亞基一起構(gòu)成催化中心，穩(wěn)定其與 亞基的結(jié)合14 因子與其相應的啟動子因子與其相應的啟動子 因子因子 基因基因 功能功能 -35區(qū)區(qū) 間隔間隔 -10區(qū)區(qū) 70 32 54rpoDrpoHrpoN廣泛廣泛熱休克熱休克氮代謝氮代謝TTGACATCTCNCCCTTGAACTGGNA15-17bp13-15bp6bpTATAATCCCCATNTATTGCA153.2.2 啟動子的識別序列啟動子的識別序列16n 若以DNA編碼鏈對應于RNA的第1個核苷酸為+1，其下游(d

9、ownstream)即轉(zhuǎn)錄區(qū)依次記為正數(shù)，上游依次記為負數(shù)(沒有0)，則RNA pol結(jié)合區(qū)即啟動子從70延伸到+30。對比分析多種原核生物的啟動子，發(fā)現(xiàn)幾乎在所有的啟動子起始點的上游都有一個6bp的一致序列。這個六聯(lián)體的中心位于起始點上游10個堿基處，大多位于位置18到8之間，根據(jù)它的位置，六聯(lián)體被命名為10序列，或以發(fā)現(xiàn)者的名字命名為Pribnow框框(Pribnow box)。它的一致序列(consensus sequence)是TATAAT。若用下標表示堿基在不同基因的啟動子中出現(xiàn)的概率，10序列可表示為T80A95T45A60A50T86，如果此位置對于任何堿基都沒有明顯的優(yōu)先性則標

10、為N。另一個保守六聯(lián)體在起始點上游35處，稱35序列。保守序列為TTGACA，可表示為T82T84G78A65C54A45。對上述共有序列進行化學修飾和定位誘變證明，35序列與聚合酶對啟動子的特異性識別有關，10區(qū)富含A-T對，有利于DNA局部解鏈。 17啟動子有三個部分啟動子有三個部分1） -10區(qū)區(qū), 又稱又稱 Pribnow Box 保守序列為T80A95T 45A60A50T96 。在RNA聚合酶的作用下，富含AT的Pribnow框內(nèi)的DNA雙螺旋首先發(fā)生解鏈，與RNA聚合酶形成開放性啟動子復合物。(下標表示堿基在不同基因的啟動子中出現(xiàn)的概率 ) )2）-35區(qū)：區(qū)：保守序列為 T82

11、T84G78A65C54A45。3）轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄啟始點啟始點 ：多數(shù)為A或G 18n -35和-10位點之間的序列為1520bp，其中90%在1618bp。雖然這一序列的確切順序是不重要的，但它的長度對于使-35和-10序列保持適當?shù)木嚯x，以適應RNA pol的幾何形狀是非常重要的。此外，某些轉(zhuǎn)錄活性超強的基因如rRNA基因，除了35區(qū)域和10區(qū)域的啟動子序列以外，在40和60之間的區(qū)域還有一種富含AT(5-AAAATTATTTT-3）的上游增強元件(up element)，該序列可將轉(zhuǎn)錄活性提高30倍。啟動子的一致序列是綜合統(tǒng)計了多種基因的啟動子序列以后得出的結(jié)果，迄今為止，在E.coli中還沒

12、有發(fā)現(xiàn)哪一個基因的啟動子序列與一致序列完全一致。一個基因的啟動子序列與一致序列越相近，則該啟動子的啟動效率就越高。不同基因在啟動子序列上的差異，是基因表達調(diào)控的一種重要途徑。 193.2.3 轉(zhuǎn)錄的起始轉(zhuǎn)錄的起始封閉復合物封閉復合物: 全酶全酶 DNA 雙鏈體雙鏈體開放復合物開放復合物: 全酶全酶 開鏈開鏈 DNA 雙鏈體雙鏈體 三元復合物三元復合物 （Ternary complex）: 全酶全酶 開鏈開鏈 DNA 雙鏈體雙鏈體 新生新生 RNA (up to 9 nucleotides)當新生 RNA達到8-9個核苷酸長度時 , 因子從因子從RNA聚合酶上脫離下來，形成延伸三元復合物，包聚合

13、酶上脫離下來，形成延伸三元復合物，包括括核心酶核心酶 DNA 新生新生 RNA.20 核心酶與因子結(jié)合成全酶，RNA pol全酶與非特異性DNA序列具有一定的親和性，但親和性較低。然而，一旦聚合酶與DNA結(jié)合，即可沿DNA滑動掃描，直到發(fā)現(xiàn)啟動子序列。RNA pol與啟動子的結(jié)合則是特異性的，具有很高的親和性。 （1） RNA pol全酶與雙鏈全酶與雙鏈DNA的非特異性結(jié)合的非特異性結(jié)合21（2 2） RNA polRNA pol與啟動子形成封閉復合物與啟動子形成封閉復合物 一旦RNA pol遇到35區(qū)，便形成封閉復合物(closed complex)。在此階段，DNA并沒有解鏈，聚合酶主要以

14、靜電引力與DNA結(jié)合。這種復合物并不十分穩(wěn)定，半衰期為15min20min。足印法分析表明，在此階段聚合酶復蓋55到+5區(qū)域。 22（3 3） 封閉復合物轉(zhuǎn)化成開放復合物封閉復合物轉(zhuǎn)化成開放復合物n 因子使DNA部分解鏈，形成大小為12 bp17 bp的轉(zhuǎn)錄泡，使 DNA模板鏈進入活性中心，封閉復合物轉(zhuǎn)變成開放復合物(open complex)。一開始，轉(zhuǎn)錄泡覆蓋101，但它很快以一種依賴于Mg 2+的方式從12延伸到+2。開放復合物十分穩(wěn)定，其半壽期在幾個小時以上，此時的聚合酶與啟動子的相互作用既有靜電引力，又有氫鍵。足印法測定表明，在此階段聚合酶復蓋55+20區(qū)域。 23（4 4） RNA

15、RNA合成的起始合成的起始n 在前兩個與模板鏈互補的NTP從次級通道進入聚合酶的活性中心以后，由活性中心催化第一個NTP的3-OH親核進攻第二個NTP的5-磷酸基，形成第一個磷酸二酯鍵。第一個摻入的核苷酸總是嘌呤核苷酸，這是因為聚合酶的第一個NTP結(jié)合位點優(yōu)先結(jié)合嘌呤核苷三磷酸，而第二個NTP結(jié)合位點與4種NTP結(jié)合的親和力相同。此外，新合成的初級轉(zhuǎn)錄物一般含有5-三磷酸，這與成熟的RNA分子不同。一旦有了第一個磷酸二酯鍵，RNA-DNA-RNA pol的三元復合物(the ternary complex)就形成了。RNA pol全酶催化形成6個10個磷酸二酯鍵以后，與核心酶結(jié)合的因子即釋放出

16、來，從此轉(zhuǎn)錄進入延伸階段。 243.2.4 3.2.4 轉(zhuǎn)錄延伸轉(zhuǎn)錄延伸 RNARNA鏈延伸的過程鏈延伸的過程 一旦RNA pol合成了大約10nt左右的RNA鏈，延伸便開始了。這時轉(zhuǎn)錄物的長度足以讓RNA取代因子的位置，使RNA pol的核心酶與因子解離。核心酶因此而可以離開啟動子，沿模板鏈移動了，這一過程稱啟動子清空(promoter clearance)。在因子被釋放以后，延伸因子Nus-A蛋白加入進來，轉(zhuǎn)錄即進入延伸階段。失去因子的核心酶通過封閉的鉗子握住DNA，以更快的速度沿著DNA模板鏈移動，使延伸反應可以持續(xù)進行。RNA pol的結(jié)構(gòu)變化使延伸中的RNA 鏈從RNA/DNA雜交雙

17、鏈中脫離，單鏈DNA重新與互補鏈配對，轉(zhuǎn)錄泡的大小維持在17 bp左右。也就是說，隨著RNA 鏈的延伸，轉(zhuǎn)錄泡與核心酶一起沿著DNA模板鏈同步移動。釋放出來的因子可以重新與核心酶結(jié)合，啟動新一輪DNA的轉(zhuǎn)錄，稱為RNA pol的循環(huán)。 25n 轉(zhuǎn)錄泡的維持需要DNA在轉(zhuǎn)錄泡前面解鏈，同時在轉(zhuǎn)錄泡后面重新形成雙鏈，拓撲異構(gòu)酶能夠在轉(zhuǎn)錄泡的前方解除因解鏈形成的正超螺旋，在轉(zhuǎn)錄泡的后方解除因解鏈形成的負超螺旋。 2627延伸的暫停和阻滯延伸的暫停和阻滯 n 在延伸階段，RNA pol每催化1個新的磷酸二酯鍵形成，就面臨3種選擇，其一是繼續(xù)延伸合成新的磷酸二酯鍵，其二是倒退切除新?lián)饺氲暮塑账?，其三是?/p>

18、伸復合物解離，完全停止轉(zhuǎn)錄。 (1) 暫停 若在轉(zhuǎn)錄過程中，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成了特定的二級結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)，或NTP暫時短缺，均有可能造成轉(zhuǎn)錄暫停。暫停有可能使原核生物轉(zhuǎn)錄和翻譯同步，也有可能對轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白發(fā)揮作用有幫助，還有可能是轉(zhuǎn)錄倒退或完全終止的前奏。RNA合成的重新啟動需要GreA和GreB蛋白來解除暫停狀態(tài)，在RNA pol倒退后，GreA和GreB切除3-端幾個核苷酸，以便讓RNA的3-OH能重新回到活性中心。 28n (2) 倒退 如果在轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)生了錯誤，RNA pol即向后滑動，新生mRNA的3-端被暴露出來，錯誤的寡聚核苷酸被內(nèi)源核酸酶GreA或GreB蛋白切除。GreA和Gr

19、eB很相似，它們的氨基酸序列有35是相同的。然而，它們的作用機制略有不同，其中GreA切除2nt3nt長的寡聚核苷酸，GreB切除2nt9nt長的寡聚核苷酸。可見，倒退可能是對新合成mRNA進行校對的一種手段。 n (3) 阻滯 若暫停的RNA pol倒退，使 RNA堵塞了有關的通道，轉(zhuǎn)錄就會被完全阻滯。解除RNA pol的阻滯狀態(tài)，同樣需要GreA或GreB剪切突出的RNA,解除RNA pol前進的障礙。 29RNA聚合酶的兩種校對功能n焦磷酸裂解編輯反應焦磷酸裂解編輯反應:通過重新加合一個焦磷酸基團使錯誤合成的核苷酸得以釋放n水解編輯水解編輯:n在一種Cre蛋白的協(xié)助下，聚合酶可以從錯誤加

20、合核苷酸處后退一個或幾個核苷酸，從而使RNA3-OH端離開活性中心而被切割，后退的聚合酶則利用重新位于活性中心的3-OH進行延伸。303.2.5 3.2.5 轉(zhuǎn)錄的終止轉(zhuǎn)錄的終止 n 轉(zhuǎn)錄終止于具有終止功能的特定DNA序列，這一特定的序列稱作終止子終止子(terminator)。協(xié)助RNA pol識別終止子的輔助因子(蛋白質(zhì))稱終止因子終止因子(termination factor)。根據(jù)終止子結(jié)構(gòu)的特點和其作用是否依賴于終止因子，將E.coli的終止子分為兩類。一類稱為不依賴于不依賴于因子的終止子因子的終止子，屬于強終止子。另一類為依賴于依賴于因子的終止子因子的終止子，屬于弱終止子。 313

21、.2.5 大腸桿菌中兩種終止子類型大腸桿菌中兩種終止子類型內(nèi)在終止子內(nèi)在終止子 RNA 聚合酶在沒有任何其他因子的參與下，可以在該位點終止轉(zhuǎn)錄。 內(nèi)在終止子內(nèi)在終止子的組成包括 一個富含GC堿基的二重對稱區(qū)。一個在 RNA的3端的寡聚U序列。不依賴于不依賴于 因子的終止子因子的終止子:32n 不依賴于不依賴于因子的終止子因子的終止子(Rho-independent terminator)通常有一個富含AT的區(qū)域和一個或多個富含GC的區(qū)域，具有回文對稱序列，該序列轉(zhuǎn)錄生成的RNA能形成莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)，可終止RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄作用。莖環(huán)結(jié)構(gòu)的下游有一串U序列，而RNA上的多聚U(rU)和DNA模板上

22、的多聚A(dA)之間的堿基對，具有相對較弱的氫鏈，使RNA鏈容易從模板脫離，從而終止轉(zhuǎn)錄。另外，莖環(huán)結(jié)構(gòu)也可能促進RNA聚合酶從模板鏈脫離(圖7-8)。突變實驗證明，凡是影響到富含GC莖穩(wěn)定的突變，或改變dA-rU雜交片段長度的突變均會影響終止子的效率。RNA pol延伸的速率，RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)的強度和大小，以及U的長度均能影響到終止的效率。 33依賴于依賴于因子的轉(zhuǎn)錄終止因子的轉(zhuǎn)錄終止n 依賴于依賴于因子的終止子因子的終止子(Rho-dependent terminator)，其回文對稱序列中不含GC區(qū)，其下游也無一串U序列。這一結(jié)構(gòu)所形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，是一類弱終止子。依賴于因子的終止子在細菌染

23、色體中較少見，而在噬菌體中廣泛存在。 34依賴于依賴于 因子的終止子因子的終止子Rho factor: N端是RNA-binding 區(qū)。 C端時ATP酶區(qū).Rho factor 結(jié)合在新生RNA上的一個特定位點.這個特定位點是一個富含 C 少G的這樣一個區(qū)域. 35Rho factor 結(jié)合在 RNA 的特定位點，沿著RNA5-3方向朝轉(zhuǎn)錄泡靠近，使RNA從模板DNA上釋放,轉(zhuǎn)錄復合物解體,完成轉(zhuǎn)錄過程.Rho factor 不能結(jié)合到任何一個正在被翻譯的轉(zhuǎn)錄物上.363.3 真核生物的轉(zhuǎn)錄真核生物的轉(zhuǎn)錄 3.3.1 真核生物真核生物RNA聚合酶聚合酶3.3.2 啟動子和增強子啟動子和增強子

24、3.3.3 轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄起始 3.3.4 轉(zhuǎn)錄延伸轉(zhuǎn)錄延伸3.3.4 轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄終止 37真核生物轉(zhuǎn)錄的特點真核生物轉(zhuǎn)錄的特點n 真核生物的轉(zhuǎn)錄過程大致分為裝配、起始、延伸和終止四個階段，其延伸和終止與原核生物大致相似，但裝配和起始存在很大的差別。n (1) 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響 真核細胞DNA在轉(zhuǎn)錄之前或轉(zhuǎn)錄之中，染色質(zhì)和核小體的結(jié)構(gòu)必須發(fā)生某種有利于轉(zhuǎn)錄的變化，進入轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。如染色質(zhì)構(gòu)象從緊密狀態(tài)變?yōu)樗缮顟B(tài)，核小體結(jié)構(gòu)臨時解體或重塑(remodeling)，只有這樣，參與轉(zhuǎn)錄有關的酶和蛋白質(zhì)才能識別啟動子和模板等，并順利地催化轉(zhuǎn)錄。 (2) RNA pol的差別 真核生物有3種RNA po

25、l，RNA pol I負責轉(zhuǎn)錄18SrRNA和5.8S rRNA，RNA pol II負責轉(zhuǎn)錄mRNA和snRNA，RNA pol III 負責轉(zhuǎn)錄tRNA、5S rRNA、U6 snRNA和scRNA。真核生物的RNA pol具有更多的亞基，不能直接識別啟動子，無解鏈酶活性。此外，線粒體和葉綠體RNA pol與原核生物類似。 38n(3) 轉(zhuǎn)錄起始的差別 真核生物DNA上包括許多參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的序列，與被調(diào)控的基因位于同一條染色體DNA上，稱順式作用元件順式作用元件(cis-acting element)，如啟動子、增強子和沉默子等。順式作用元件只有與特殊的蛋白質(zhì)因子結(jié)合才會起作用。由于這些蛋

26、白質(zhì)因子的基因通常位于其它DNA分子之上，與被調(diào)節(jié)的基因呈反式關系，因此被稱為反式作用因子反式作用因子(trans-acting factors)。在轉(zhuǎn)錄的起始階段，有多種順式作用元件和反式作用因子相互作用，才能裝配成起始復合物。 n(4) 轉(zhuǎn)錄與翻譯偶聯(lián)關系的差別 原核細胞的轉(zhuǎn)錄與翻譯在時間和空間上存在偶聯(lián)關系。而在真核細胞內(nèi)，轉(zhuǎn)錄發(fā)生在細胞核，翻譯則發(fā)生在細胞質(zhì)，兩者不存在偶聯(lián)關系。n(5) 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的差別 真核細胞轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物多為單順反子，而原核細胞的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大多數(shù)為多順反子。原因是在原核轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中功能相關的基因共享一個啟動子，以一個共同的轉(zhuǎn)錄單位進行轉(zhuǎn)錄。而在真核轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)之中，每一個蛋白

27、質(zhì)的基因都有自己獨立的啟動子。 393.3.1 真核生物真核生物 RNA 聚合酶聚合酶RNA polymerase I 合成 rRNA, 在核仁. RNA polymerase II 合成前體( heterogeneous nuclear) RNA (hnRNA), mRNA的前的前體體, 在核質(zhì)中. RNA polymerase III 合成tRNAs, 5S rRNA 和一些其他小和一些其他小 RNAs ,位于核質(zhì)中.所有真核 RNA polymerases 有 大約12 個亞基 ,相對分子量大于 500 kD. 幾個小亞基是三類聚合酶共有的.403.3.2 啟動子和增強子啟動子和增強子

28、RNA 聚合酶聚合酶 I 啟動子啟動子 由一個啟動子核心區(qū)和上游啟動子原件 (UPE)組成. 核心啟動子是可以起始轉(zhuǎn)錄所必需的最少一套序列元素。從轉(zhuǎn)錄起始點向上游或下游延伸a. RNA polymerase I 啟動子啟動子41b. RNA聚合酶聚合酶 III 啟動子啟動子Pol III Promoter 的啟動子位于的啟動子位于轉(zhuǎn)錄起始點的下游轉(zhuǎn)錄起始點的下游.轉(zhuǎn)錄過程需要一些轉(zhuǎn)錄因子的參與,TFIIIB and TFIIIC 參與 tRNA 的合成, 加上TFIIIA 參與與5S rRNA 的合成.42c. RNA 聚合酶聚合酶 II 啟動子啟動子在-25 -35區(qū)含有TATA序列 (TA

29、TA box)，主要作用是使轉(zhuǎn)錄精確地起始。在-70 -80區(qū)CAAT序列 (CAAT box);在-80 -110區(qū)含有GC序列 (GC box);CAAT區(qū)和GC區(qū)主要控制轉(zhuǎn)錄起始頻率。43nRNA pol II催化的轉(zhuǎn)錄受各種順式作用元件的控制，包括核心啟動子、調(diào)控元件(regulatory elements)、增強子和沉默子。這些元件通過不同的組合，可以構(gòu)成巨大數(shù)量的不同的啟動子，它們可被特異的轉(zhuǎn)錄因子識別和相互作用。就一個啟動子而言，只含其中的13種元件。若基因表達不受時間空間和環(huán)境條件的影響，則啟動子是組成型的。若基因表達受時間、空間以及環(huán)境條件的影響，則是誘導型。 (1) 核心啟

30、動子 核心啟動子核心啟動子(core promoter)也稱基礎啟動子(basal promoter或minimal promoter)，其功能是招募和定位RNA pol II到轉(zhuǎn)錄起始點，從而正確地啟動基因的轉(zhuǎn)錄，也可通過促進轉(zhuǎn)錄復合物的裝配或穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合而提高轉(zhuǎn)錄的效率。屬于核心啟動子的元件有TATA盒、起始子(initiator, Inr) , TFIIB識別元件(TFIIB recognition element, BRE)，下游啟動子元件(downstream promoter element, DPE)和GC盒。 44nTATA盒亦稱Goldberg-Hogness盒，含TA

31、TA(A/T)A(A/T)7個堿基的保守序列，位于25到30區(qū)域，與原核細胞啟動子的Pribnow盒相似，但位置不同。Inr位于3+6，復蓋轉(zhuǎn)錄的起始點，多數(shù)Inr的1堿基為C，+l堿基為A。TATA盒和Inr屬于招募和定位元件，二者共同決定轉(zhuǎn)錄的起點。BRE可視為TATA盒向上游的延伸，位于37到32區(qū)域，為轉(zhuǎn)錄因子TFIIB的識別序列。DPE位于Inr下游，在+28到+32區(qū)域，在Inr的存在下發(fā)揮其促進轉(zhuǎn)錄起始的作用。 45n(2) 上游元件 上游元件包括上游臨近元件(upstream proximal elements, UPE)和上游誘導元件(upstream inducible e

32、lements, UIE)，它們能夠與特殊的反式作用因子結(jié)合。UPE為一些短的核苷酸序列，長度約為6nt20nt，位于核心啟動子上游近側(cè)100bp200bp范圍內(nèi)或更上游區(qū)段，最常見的是增強子元件增強子元件(enhancer element)。UPE的功能是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的效率，但不影響轉(zhuǎn)錄起始點的特異性，屬于UPE的有CCAATA盒、GC盒和八聚體基序(octamer motif, OCT)等。UPE通常存在于大多數(shù)蛋白質(zhì)基因(特別是管家基因)的上游，而且往往不止一個拷貝。 46d. 增強子增強子47增強子（增強子（enhancer）:DNA上能促進啟動子轉(zhuǎn)錄效率的順式作用序列。特點：1)與啟

33、動子區(qū)域的相對位置不固定，可近可遠，可以在啟動子的上游或下游。2)在兩個方向都可以起作用，3)一些增強子具有組織特異性。48Changes in the structure of chromatin at the promoter at initiation of transcription3.3.3 轉(zhuǎn)錄的起始轉(zhuǎn)錄的起始49轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 因子因子普通轉(zhuǎn)錄因子普通轉(zhuǎn)錄因子, 與RNAPloymerase一起結(jié)合到 轉(zhuǎn)錄起始點和TATA box. 激活因子激活因子 是轉(zhuǎn)錄因子，能識別一些特殊的短序列元件，它們與啟動子或增強子結(jié)合。輔激活蛋白輔激活蛋白 一種能增加序列特異性轉(zhuǎn)錄因子對真核細胞基因轉(zhuǎn)錄激

34、活作用的輔助因子。通常與通用轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)結(jié)而起作用。調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)因子 調(diào)節(jié)染色體結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)染色體結(jié)構(gòu)50n TFIID TFIID的Mr為8.0106，含一個TATA結(jié)合蛋白(TATA binding protein, TBP)和11個TBP相關因子(TBP-associated factors, TAFs)，TBP共有180個氨基酸殘基，有2個非常相似的由6個氨基酸殘基組成的馬橙狀結(jié)構(gòu)域，TBP主要識別TATA序列，并與DNA小溝結(jié)合，仿佛馬鞍橫跨在DNA分子上，使小溝擴展為幾乎是平面的構(gòu)象，TATA盒因此而彎曲約80 。TBP還與兩個大的TAFs(TAF250和TAF150)一起與起點附近的D

35、NA接觸，復蓋3717區(qū)域。TF II D除識別和結(jié)合核心啟動子外，還可結(jié)合和招募其他GTFs。51TFIID 是一種普通轉(zhuǎn)錄因子?？梢越Y(jié)合到啟動子轉(zhuǎn)錄起始點 TATA 序列上游序列，幫助RNA聚合酶II與啟動子結(jié)合. 它包括TBP (TATA 結(jié)合 蛋白) 和 TAF (TBP-結(jié)合因子 ) 基團。 52n TFIIA TFIIA由3個亞基組成，其功能包括與TBP氨基端的馬鐙狀結(jié)構(gòu)域結(jié)合，取代與TBP結(jié)合的負調(diào)控因子如NC1和NC2/DR1，穩(wěn)定TBP與TATA盒的結(jié)合。n TFIIB TFIIB為單一肽鏈，同TATA元件上游大溝(至BRE)和下游小溝的堿基有特異性相互作用。TFIIB與TB

36、P-TATA的非對稱性結(jié)合，造成了前起始復合物其余部分的非對稱性組裝，及由此引起的單向轉(zhuǎn)錄。TFIIB還能與TBP羧基端的馬橙狀結(jié)構(gòu)域結(jié)合，與TF II F的RAP30亞基結(jié)合，從而將RNA pol II和TF II F形成的復合物招募到啟動子上。此外，TFIIB能穩(wěn)定TBP與DNA的結(jié)合，為多種激活蛋白的作用目標。 n TFIIF TFIIF由RAP38和RAP74亞基組成，可以同RNA pol II及其它因子結(jié)合，一起被募集到啟動子上，穩(wěn)定DNA-TBP-TFIIB復合體，并為募集TFIIE和TFIIH創(chuàng)造條件。還可降低延伸過程中的暫停，保護延伸復合物免受阻滯。RAP74具有解鏈酶活性，可

37、能參與啟動子的解鏈。在無TF II B的情況下，激活磷酸酶，導致CTD的去磷酸化。 53n TFIIE TFIIE由34kD亞基和57 kD亞基組成，其功能包括與RNA pol II結(jié)合，招募TFIIH。調(diào)節(jié)TFIIH的解鏈酶、ATP酶和激酶活性，參與啟動子的解鏈。 n TFIIH TFIIH有9個亞基，具有解鏈酶，ATP酶和蛋白激酶活性，它的1個亞基是細胞周期素H(cyclin H)。其功能包括與TFIIE緊密結(jié)合和相互調(diào)節(jié)，其中2個最大的亞基(XPB和XPD)所具有的解旋酶活性，促進轉(zhuǎn)錄過程中DNA模板的解鏈。TFIIH還參與第一個磷酸二酯鍵的形成，其激酶活性導致RNA pol II的CT

38、D磷酸化，從而促進啟動子的清空。TFIIH解鏈酶活性還參與核苷酸切除修復，其突變可導致著色性干皮病。 54起始復合物起始復合物 由RNA 聚合酶II和一整套普通轉(zhuǎn)錄因子組成。按一定順序在核心啟動子TATA序列上組裝而成。起始復合物起始復合物55起始復合物形成后在特定條件下，在TFH解旋酶活性的催化下引起啟動子區(qū)域的解鏈，并同時對RNA聚合酶大亞基羧基端七肽重復序列中的Ser進行磷酸化修飾，使RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄并脫離其他普通轉(zhuǎn)錄因子。起始后進入啟動子清除過程起始后進入啟動子清除過程 563.3.4 轉(zhuǎn)錄的延伸轉(zhuǎn)錄的延伸Pol II enzyme: 脫去大多數(shù)的轉(zhuǎn)錄因子; 與延伸因子相互作用延伸

39、因子延伸因子: hSPT5: 加速延伸TFIIS:加速延伸和 幫助RNA聚合酶行使校對功能。 減少延伸過程中RNA聚合酶 II在某些位點的停留時間而增加轉(zhuǎn)錄速度。其次，還可以激活RNA聚合酶 II內(nèi)在的RNase活性，從而去除因錯誤加合的核苷酸，提高轉(zhuǎn)錄的準確性。573.3.5 轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄終止RNA polymerase I 在一個 18 個堿基對的終止區(qū)終止轉(zhuǎn)錄。RNA polymerase III 在一個富含 GC 區(qū)的一個poly(U)4區(qū)域終止轉(zhuǎn)錄。RNA polymerase II?58 轉(zhuǎn)錄的終止 當轉(zhuǎn)錄進行到3-末端，遇到終止信號或終止子序列時，RNA pol II的CTD在T

40、FIIF的作用下去磷酸化，轉(zhuǎn)錄隨即終止。RNA pol II/TF II F復合物離開模板，再與中介因子形成復合物，參與下一輪的轉(zhuǎn)錄循環(huán)。實驗表明，對原核生物的轉(zhuǎn)錄終止起重要作用的可能是莖環(huán)結(jié)構(gòu)，特別莖部的3-多聚U序列，及其附近的富含G-C區(qū)。但真核生物RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的終止區(qū)，似乎不存在典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，3-末端也不見典型的多聚U，RNA pol II轉(zhuǎn)錄終止的機制有待進一步研究。 593.4 RNA 的剪接和加工的剪接和加工3.4.1 mRNA 剪接和加工剪接和加工3.4.2 rRNA 剪接剪接3.4.3 tRNA 剪接和修飾剪接和修飾3.4.4 RNA 編輯編輯60n 基因轉(zhuǎn)錄的直接產(chǎn)物

41、即初級轉(zhuǎn)錄物(primary rtanscripts)通常是沒有功能的，必須經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄后加工(posttranscriptional processing)才會轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘某墒霷NA分子。 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工是基因表達的一個重要環(huán)節(jié)，對其進行深入研究，可以促進生命科學基礎學科的發(fā)展，例如核酶就是在研究轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加工時發(fā)現(xiàn)的。此外，這一領域的研究，也有可能為生命科學在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學領域的應用提供新途徑，比如參與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加工的小RNA，及其與蛋白質(zhì)的復合物RNP如何影響某些基因的表達和細胞的功能，有無可能用此途徑控制疾病，已成為當前研究工作的一個熱點領域。 613.4.1 mRNA 的剪接和加工的剪接和加工

42、62原核生物原核生物mRNAmRNA前體的加工前體的加工n 細菌的轉(zhuǎn)錄和翻譯不存在時空間隔，mRNA的初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物一般不需要加工，在轉(zhuǎn)錄的同時即可翻譯。多順反子的mRNA可被翻譯成多聚蛋白質(zhì)，再切割成不同的蛋白質(zhì)分子，但也有少數(shù)多順反子mRNA需通過內(nèi)切核酸酶切成較小的單位后才進行翻譯。例如，E.coli位于8990位置的一個操縱子含有rp1J(編碼核糖體大亞基蛋白L10)、 rplL(編碼核糖體大亞基蛋白L7/L12)、rpoB(編碼 RNA pol 亞基）和rpoC (編碼 RNA pol 亞基)4個基因，在轉(zhuǎn)錄出多順反子mRNA前體后，由 RNase III將核糖體蛋白與RNA pol亞

43、基的mRNA切開，各產(chǎn)生兩個成熟的mRNA，之后再各自進行翻譯。核糖體蛋白質(zhì)的生成必須與rRNA的合成水平，和細胞的生長速度相適應，其mRNA應當有較高的翻譯水平。而細胞內(nèi)RNA pol的水平則要低得多，其mRNA不需要較高的翻譯水平。將二者的mRNA切開，有利于它們各自的翻譯調(diào)控。 63真核生物真核生物mRNAmRNA前體的加工前體的加工64Pre-mRNA 被稱為核不均一RNA,經(jīng)過剪接、修飾、加工后成為成熟mRNA，才可以作為蛋白質(zhì)合成的模板。Pre-mRNA 包含內(nèi)含子和外顯子。前體前體mRNA65RNA 加工加工 包括包括 5 端和端和3 端的修飾端的修飾, 內(nèi)部磷酸化內(nèi)部磷酸化 ,

44、 剪接剪接, 或或 斷裂斷裂. RNA 剪接剪接 主要包括內(nèi)含子的切除和外含子的連接過程主要包括內(nèi)含子的切除和外含子的連接過程. 關鍵詞關鍵詞66形成形成5-5-端帽子結(jié)構(gòu)端帽子結(jié)構(gòu)n帽子結(jié)構(gòu)的類型帽子結(jié)構(gòu)的類型n真核生物的hnRNA和絕大多數(shù)成熟mRNA的5-端，都含有以7-甲基鳥苷(7-methylguanosine, m7G)為末端的帽子結(jié)構(gòu)(cap structure)，G與mRNA鏈上的核苷酸方向相反，像一頂帽子倒扣在mRNA連上，因此而得名。有3種帽子結(jié)構(gòu)形式，帽子0沒有2-甲基-核苷酸，帽子1末端的第一個核苷酸為2-甲基-核苷酸，帽子2末端的第一個和第二個核苷酸為2-甲基-核苷酸

45、 675 帽子帽子：1) N7-甲基鳥嘌呤核苷酸甲基鳥嘌呤核苷酸部位稱Cap O，符號m7GPPPX, 單細胞真核生物如酵母只具有Cap O。2) 如果在原來轉(zhuǎn)錄物的第一個核苷酸的2-OH位也產(chǎn)生甲基化，則構(gòu)成Cap 1，符號m7GPPPXm.。除了單細胞真核生物外的其余真核生物的主要帽子形式。3) 如果在第二個核苷酸的2-OH位再產(chǎn)生甲基化，構(gòu)成Cap 2，符號m7GPPPXmpYm,。只存在有些真核生物中。加帽反應在RNA 只有20-40個核苷酸長時就開始了。 68帽子結(jié)構(gòu)的形成帽子結(jié)構(gòu)的形成n 已知在轉(zhuǎn)錄的初始產(chǎn)物中，在5-端都有三個磷酸基團(位、位和位)，5-帽子結(jié)構(gòu)就是在此位置上逐步

46、形成的，基本反應的順序為： n (1) 核苷酸磷酸水解酶從生長著的RNA 5-端切去磷酸基團。 n (2) 鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶催化一分子游離GTP的位磷酸基攻擊RNA5-端的位磷酸基，形成5, 5-三磷酸的連接，封閉了RNA的5-端。 n (3) 由鳥苷酸-7-甲基轉(zhuǎn)移酶催化，將SAM的活性甲基轉(zhuǎn)移到鳥嘌呤的N7位，形成帽子0。 n (4) 由2-O-甲基轉(zhuǎn)移酶催化，將SAM的活性甲基轉(zhuǎn)移到mRNA 5-端第一個核苷酸的2-OH上，形成帽子1。再轉(zhuǎn)移一個甲基到mRNA 5-端第二個核苷酸的2-OH上，形成帽子2。 695 端帽子結(jié)構(gòu)的功能端帽子結(jié)構(gòu)的功能(1) 對mRNA的保護作用 細胞中有許多能夠

47、水解mRNA的核酸酶，如果沒有5-端帽子結(jié)構(gòu)，有可能在mRNA還未完全轉(zhuǎn)錄，或者尚未到達發(fā)揮功能的細胞部位就被降解了。 (2) 對翻譯的促進作用 真核生物合成蛋白質(zhì)時，有一種起始因子能夠識別5-端帽子結(jié)構(gòu)，稱帽子結(jié)合蛋白，使mRNA能與核糖體小亞基結(jié)合起始翻譯(見第9章)。如果沒有帽子結(jié)構(gòu)，mRNA的翻譯能力就下降或消失。用化學方法除去5-端的m7G后，病毒RNA及珠蛋白mRNA的模板活性立即消失，說明帶甲基的5-端帽子是翻譯所必需的。 (3) 促進mRNA的輸送 5-端帽子結(jié)構(gòu)有利于成熟的mRNA從細胞核輸送到細胞質(zhì)。 U6snRNA由RNA pol III轉(zhuǎn)錄，缺乏5-帽子結(jié)構(gòu)，仍保持著轉(zhuǎn)

48、錄起始時形成的5-三磷酸末端，因而被留在細胞核內(nèi)，不能進入細胞質(zhì)。 此外，帽子結(jié)構(gòu)可能有助于mRNA前體的正確拼接。 70形成形成3-3-端的多聚腺苷酸端的多聚腺苷酸3 3- -端多聚腺苷酸的特點端多聚腺苷酸的特點n 除了組蛋白的除了組蛋白的mRNA以外，真核生物以外，真核生物mRNA的的3-端都有端都有polyA序列，其序列，其長度一般為長度一般為40200nt。 RNA的的3-端加入端加入polyA的過程稱為的過程稱為3-端多聚腺苷酸端多聚腺苷酸化化(polyadenylation)。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3-端加上端加上polyA的位置稱為的位置稱為polyA位點位點(polyadenyla

49、tion site)。 n 用能在用能在C和和U后面切割的后面切割的RNase A以及能在以及能在G后面切割的后面切割的RNase T1等等RNA內(nèi)切核酸酶將內(nèi)切核酸酶將mRNA水解，得到的水解，得到的polyA在超速離心中的沉降系數(shù)約為在超速離心中的沉降系數(shù)約為7S，相當于，相當于150200nt。同時，用這兩種。同時，用這兩種RNase酶解，還能證明在酶解，還能證明在polyA結(jié)結(jié)構(gòu)中不存在構(gòu)中不存在G、U或或C。從細胞核中得到的。從細胞核中得到的polyA沉降系數(shù)與細胞質(zhì)并不一致，沉降系數(shù)與細胞質(zhì)并不一致，核內(nèi)的核內(nèi)的hnRNA的的3-端端polyA比比mRNA的稍長一些。因為一旦的稍長一些。因為一旦mRNA進入細胞進入細胞質(zhì)，它的質(zhì)，它的polyA就開始不斷降解。同時細胞質(zhì)就開始不斷降解。同時細胞質(zhì)polyA聚合酶聚合酶(cytoplasmic polyA polymerase)再重新催化其延長，進行著降解再重新催化其延長，進行著降解-合成合成-降解的轉(zhuǎn)換，維持降解的轉(zhuǎn)換，維持3-端端poly A的長度為的長度為200nt左右左右71 3 多聚多聚(A) 尾尾:保守序列保守序列AAUAAA是初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物準是初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物準確切割的信號。也是確切割的信號。也是多聚多聚(A) 加尾所必加尾所必需的。需的。內(nèi)切核酸酶內(nèi)切核酸酶 在在AAUAAA序列下游切割序列下游切割R