PCR實驗指導(dǎo)(精修版)

1、應(yīng)用于本科畢業(yè)課題的PCR技術(shù)實驗指導(dǎo)目錄導(dǎo)言1一、實驗原理1二、PCR技術(shù)的特點2三、PCR技術(shù)的變體分類及其應(yīng)用范圍2四、PCR引物設(shè)計4五、PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化6六、PCR實驗中應(yīng)注意的事項8實驗部分10實驗一、常規(guī)PCR10實驗二、梯度PCR12實驗三、 反向PCR (Inverse PCR, IPCR)13實驗四、 不對稱PCR15實驗五、 多重PCR16實驗六、 RT-PCR 反/逆轉(zhuǎn)錄PCR19實驗七、 巢式PCR（Nested PCR）22實驗八、降落/遞減PCR（Touchdown PCR）23實驗九、重疊延伸PCR（ SOE PCR）24實驗十、免疫PCR (Im

2、muno PCR, Im-PCR)26導(dǎo)言PCR技術(shù)，即聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是由美國PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年獲諾貝爾化學(xué)獎）建立的。這項技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時反應(yīng)就將特定的DNA片段擴增數(shù)百萬倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術(shù)在分子生物學(xué)研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動了生命科學(xué)的研究進展。它不僅是DNA分析最常用的技術(shù)，而且在DNA重組與表達、基因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測中具有重要的應(yīng)用價值。一、實驗原理PCR技術(shù)，即聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）

3、。PCR可以被認為是與發(fā)生在細胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程相似的技術(shù)，其結(jié)果都是以原來的DNA為模板產(chǎn)生新的互補DNA片段。細胞中DNA的復(fù)制是一個非常復(fù)雜的過程。參與復(fù)制的有多種因素。PCR是在試管中進行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理與細胞內(nèi)DNA復(fù)制相似，但反應(yīng)體系相對較簡單。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；引物的

4、延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘， 23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。二、PCR技術(shù)的特點檢驗PCR擴增效率的指標(biāo)為特異性、高效性和忠實性。PCR技術(shù)有如下特點：（1）操作簡便；（2）省時；（3）靈敏度高；（4）特異性強；（5）模板材料易獲得；（6）有一程度的單核苷酸錯誤摻入；（7）TagDNA聚合酶催化的PCR擴增終產(chǎn)物3端加尾，這種

5、多出來的突出端堿基幾乎總是A；（8）PCR反應(yīng)過程遵循酶促動力學(xué)規(guī)律。三、PCR技術(shù)的變體分類及其應(yīng)用范圍1逆轉(zhuǎn)錄PCR逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）是將RNA反轉(zhuǎn)錄和PCR結(jié)合而建立起來的一種PCR技術(shù)。其包括兩個過程：通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA和對之進行PCR擴增。其中，用于逆轉(zhuǎn)錄的RNA模板要求完整，并不含DNA和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。逆轉(zhuǎn)錄PCR可以檢測低于10個拷貝的特異RNA。2原位PCR  原位PCR技術(shù)（in situ PCR）是將檢測細胞內(nèi)特定基因的原位雜交技術(shù)和PCR技術(shù)相結(jié)合的方法。它是擴增組織切片或細胞內(nèi)微量的基因，并將其檢測出來的技術(shù)。檢測mRNA時，

6、首先將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并將PCR相關(guān)的引物、底物以及反應(yīng)體系滴于組織切片上，置于原位PCR儀中進行擴增。擴增產(chǎn)物可以利用特異探針進行雜交檢測。in situ PCR的步驟包括:組織前處理；逆轉(zhuǎn)錄；PCR；利用原位雜交技術(shù)檢測。3甲基化PCR  甲基化PCR與常規(guī)PCR在原理上一致，但在引物的設(shè)計以及DNA樣本的處理上有所不同。針對擴增的DNA甲基化區(qū)域，一般需要設(shè)計三條引物：正常序列引物、甲基化對應(yīng)引物以及DNA序列修飾引物。通過三組PCR，判斷DNA序列中甲基化的存在與否。4熒光定量PCR熒光定量PCR（real time PCR，RT-PCR）是一種新的核

7、酸定量測定技術(shù)，該技術(shù)將熒光能量傳遞（fluorescence resonance energy tranfer, FRET）技術(shù)應(yīng)用于常規(guī)PCR中，對樣品進行定量測定。FRET技術(shù)的原理是通過供體與受體發(fā)色團之間相互作用，能量由供體向受體轉(zhuǎn)移，因此，RT-PCR需要熒光探針參與。用于RT-PCR的探針可分為四類：Taqman、分子信標(biāo)（molecular beacon）、SYBRGreen I和FRET探針。熒光定量PCR不僅可以測定靶DNA的含量，用于臨床診斷，而且應(yīng)用應(yīng)用不同的探針檢測基因突變和SNP分析。5多重引物PCR多重引物PCR是在同一擴增體系加入多對引物，同時擴增多個基因片段的

8、PCR技術(shù)。其技術(shù)的優(yōu)點是通過一次擴增可診斷幾種疾病或同一疾病的幾個不同的基因突變。多重PCR必須遵循以下3個條件：設(shè)定保證所有片段都能擴增的反應(yīng)條件；設(shè)計盡量減少非特異性擴增的引物；擴增產(chǎn)物片段大小須有利于分析。6隨機引物PCR多態(tài)DNA的隨機擴增(random amplication of polymorphic DNA，RAPD)或隨機引物PCR(arbitrarily primed PCR，AP PCR)是應(yīng)用基因組DNA中單一、隨機序列的短引物，通過PCR擴增產(chǎn)生一組代表種或株特性的DNA片段。因此，RAPD是獲得種或株的DNA分子指紋圖譜的通用方法。RAPD優(yōu)點在于無須知道目的DN

9、A片段的任何信息，僅應(yīng)用一條隨機序列的引物和不嚴(yán)格的PCR條件，對它方便、敏感,應(yīng)用范圍非常廣。用不同引物和種株做系列類似實驗獲得遺傳資料,可用于作分類學(xué)研究的樹狀圖。特殊條帶可作為某一生物體的種屬標(biāo)記，并符合孟德爾遺傳特征。7巢式PCR，是對靶DNA片段設(shè)計兩套引物系統(tǒng)，第1套引物擴增1530個循環(huán),再用擴增的DNA片段內(nèi)設(shè)定的第2套引物擴增1530個循環(huán),可使目的DNA序列得到高效擴增。套式引物PCR可減少引物的非特異性擴增,增加特異性擴增,減少PCR的誤診率。四、PCR引物設(shè)計1、掌握PCR引物設(shè)計的原則1）典型的引物18 到24 個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在

10、于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24 核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。2）選擇GC 含量為40到60或GC 含量與模板GC 含量接近的引物。3）設(shè)計5'端和中間區(qū)為G 或C 的引物。這會增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。4）避免引物對3'末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴增。5）避免3'末端富含GC。設(shè)計引物時保證在最后5 個核苷中含有3 個A 或T。6）避免3'末端的錯誤配對。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。3最好以G或C 結(jié)

11、尾，防止AT 的松散結(jié)合引起錯配。7）避免存在可能會產(chǎn)生內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)如發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列，這會破壞引物退火穩(wěn)定性。8）引物的一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。兩引物的Tm 值相差不應(yīng)大于5。9）當(dāng)在引物5端添加酶切位點時要考慮：a)該目的序列內(nèi)部不得含有相同的酶切位點， b)如果打算PCR 后直接酶切，不要忘了在酶切位點的外側(cè)再加上保護堿基。2、PCR引物設(shè)計的方法。（1）手工設(shè)計：以基因或cDNA的53方向的單鏈為標(biāo)準(zhǔn)，確定待擴增片段兩側(cè)的引物序列。按53方向，照抄模板的序列，先寫下5端引物的序列；然后根據(jù)模板3的序列，寫下由53方向的互補鏈的堿基序列，即為3引物的序列。（2）計算機軟件設(shè)計引物：

12、目前在Internet網(wǎng)上提供很多免費在線引物設(shè)計程序，根據(jù)PCR引物設(shè)計的基本原則，輸入諸如模板序列、擴增區(qū)域、擴增子長度、引物長度等限定參數(shù)時，便可得到有關(guān)引物最佳序列、引物起始堿基位置、引物的Tm值、引物GC%、引物的二級結(jié)構(gòu)（如自身二聚體形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)、引物間二聚體）、模板和引物結(jié)合的熱函、自由能等熱力學(xué)參數(shù)。能提供PCR引物設(shè)計程序的網(wǎng)站有：http：/等, 不同的程序都有自己的特色，但都能滿足設(shè)計引物的基本需要。此外還可以下載相關(guān)軟件進行設(shè)計，如Primer Primer5.0，Oligo ，并遵循其設(shè)計原則。五、PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化1.

13、變性：在第一輪循環(huán)前,在94下變性5-10min 非常重要,它可使模板DNA 完全解鏈,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復(fù)合物所造成的錯誤。變性不完全,往往使PCR 失敗,因為未變性完全的DNA 雙鏈會很快復(fù)性,減少DNA 產(chǎn)量.一般變性溫度與時間為94 1min。在變性溫度下,雙鏈DNA 解鏈只需幾秒鐘即可完全,所耗時間主要是為使反應(yīng)體系完全達到適當(dāng)?shù)臏囟?。對于富含GC 的序列,可適當(dāng)提高變性溫度.但變性溫度過高或時間過長都會導(dǎo)致酶活性的損失。 2. 退火：這是PCR 的一個關(guān)鍵參數(shù)。在理想狀態(tài)下，退火溫度足

14、夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55到70。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm 低5, 當(dāng)產(chǎn)物中包含有影響實驗的非可異性擴增帶時,以2為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。如果兩個引物Tm 不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm 低5?；蛘邽榱颂岣咛禺愋裕梢栽诟鶕?jù)較高Tm 設(shè)計的退火溫度先進行5 個循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm 設(shè)計的退火溫度進行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。退火溫度越高,所得產(chǎn)物的特異性越高。有些反應(yīng)甚至可將退火與延伸兩步合并,只用兩種溫度(例如用60和94)

15、完成整個擴增循環(huán), 既省時間又提高了特異性。退火一般僅需數(shù)秒鐘即可完成,反應(yīng)中所需時間主要是為使整個反應(yīng)體系達到合適的溫度。 3. 延伸：延伸反應(yīng)通常為72,接近于Taq DNA 聚合酶的最適反應(yīng)溫度75.實際上,引物延伸在退火時即已開始,因為Taq DNA 聚合酶的作用溫度范圍可從20-85.延伸反應(yīng)時間的長短取決于目的序列的長度和濃度.在一般反應(yīng)體系中,Taq DNA聚合酶每分鐘約可合成1kb 長的DNA。延伸時間過長會導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加.但對很低濃度的目的序列, 則可適當(dāng)增加延伸反應(yīng)的時間。一般在擴增反應(yīng)完成后,都需要一步較長時間(10-30min)的延伸反應(yīng),以獲得盡可能完整的產(chǎn)物,

16、 這對以后進行克隆或測序反應(yīng)尤為重要。 4. 循環(huán)次數(shù)： 當(dāng)其它參數(shù)確定之后, 循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA 濃度。一般而言25-30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多,會使PCR 產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。通常經(jīng)25-30 輪循環(huán)擴增后, 反應(yīng)中Taq DNA 聚合酶已經(jīng)不足, 如果此時產(chǎn)物量仍不夠, 需要進一步擴增,可將擴增的DNA 樣品稀釋103-105倍作為模板, 重新加入各種反應(yīng)底物進行擴增, 這樣經(jīng)60 輪循環(huán)后, 擴增水平可達109-1010。擴增產(chǎn)物的量還與擴增效率有關(guān),擴增產(chǎn)物的量可用下列公式表示:CCo(1+P)n 。其中：C 為擴增產(chǎn)物量,C0 為起始DNA 量, P 為增效率,

17、 n 為循環(huán)次數(shù)。在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應(yīng)。平臺期會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結(jié)束反應(yīng)，減少非特異性產(chǎn)物。六、PCR實驗中應(yīng)注意的事項盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應(yīng)是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：   (1)戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套。   (2)使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物

18、分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染。   (3)避免反應(yīng)液飛濺，打開反應(yīng)管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面。   (4)操作多份樣品時，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度。   (5)最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管。  (6)操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性。   (

19、7)盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū)。  (8)重復(fù)實驗，驗證結(jié)果，慎下結(jié)論。實驗部分實驗一、常規(guī)PCR一、原理：類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火(復(fù)性）-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，

20、為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至4060左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，于72左右，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘，23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。二、試劑· 模板DNA· dNTP· Taq DNA聚合酶

21、83; ddH2O· PCR緩沖液· 引物· MgCl2二、儀器與耗材· PCR儀· 移液槍· PCR板· 薄壁管· EP管四、實驗步驟：（1）配制20L反應(yīng)體系，在PCR板中依次加入下列溶液：組分體積模板DNA2L引物11L引物21LdNTP1.5LMgCl22L10×buffer2LddH2O10LTaq酶0.5L（2）設(shè)置PCR反應(yīng)程序。預(yù)變性94 5min變性 94 30s退火55-72 35s25-35個循環(huán)延伸 72 1min/kb終延伸72 10min保持4 1h（3）上樣，啟動反應(yīng)程序。（

22、4）擴增產(chǎn)物的電泳檢測，即瓊脂糖凝膠電泳上樣檢測。五、應(yīng)用：它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究,還可用于疾病的診斷或任何有DNA,RNA的地方。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR）又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術(shù)。實驗二、梯度PCR一、原理：對于一個PCR反應(yīng)，雖然有各種各樣的PCR儀引物設(shè)計軟件或者經(jīng)驗公式計算最適的退火溫度，可是由于模版中堿基的組合千變?nèi)f化，對于特殊片斷，經(jīng)驗公式得到的數(shù)據(jù)不一定能"P"出來結(jié)果，細微的變化對結(jié)果都可能產(chǎn)生決定性的影響，因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的

23、問題。梯度PCR的出現(xiàn)部分解決了一些問題在反應(yīng)過程中每個孔的溫度控制條件可以在指定范圍內(nèi)按照梯度變化，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出最適合的反應(yīng)條件。不單退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以優(yōu)化對于多種聚合酶混合酶擴增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數(shù)高保真Taq酶來說這個非常重要，因為Taq和校正酶的最佳反應(yīng)溫度可能有顯著差異，優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。多次實驗可在一臺儀器上完成，既節(jié)省實驗時間提高效率，又節(jié)省實驗成本。 檢驗地帶網(wǎng) 對于帶梯度功能的PCR儀，需要考慮梯度模式下不同梯度管排間的溫度均勻性和準(zhǔn)確性，還必須考慮儀器在梯度模式和標(biāo)準(zhǔn)模式下是否具有同樣的溫度特

24、性。這種差異可能導(dǎo)致在梯度模式下得出的最佳條件與標(biāo)準(zhǔn)模式下單獨做的結(jié)果出現(xiàn)差異。二、操作步驟：以wealtec的SEDI G為例，96孔控溫模塊按照8x12排布，解鏈步驟設(shè)置完后，設(shè)置退火步驟時，可以選擇“梯度步驟”，此時程序會允許你設(shè)置梯度溫控范圍，讓12個縱列孔位在此步驟時以不同溫度運行。之所以pcr儀有這種功能有兩個原因:1.我們本來就不知道哪個退火溫度最好 2.同一品牌同一型號的不同pcr儀之間溫控也有誤差，一個pcr儀上的退火溫度用到另一個上面效果就又變了，也需要篩選。三、應(yīng)用：梯度PCR其實就是將多個的PCR反應(yīng)放在一起做，不用一次一次的作很多次，溫度梯度PCR可以很快的找出最適合

25、的退火溫度，或者說可以在最適合的退火溫度下擴增出目的條帶。梯度PCR儀除具標(biāo)準(zhǔn)PCR儀功能外，其梯度模塊還能同時進行多個不同退火溫度的PCR反應(yīng)，在梯度模塊上，可實現(xiàn)對梯度溫度和梯度寬度等參數(shù)的調(diào)整，自由編程溫度，梯度實現(xiàn)不同樣品的退火溫度并同時進行熱循環(huán)。僅一次實驗就能確定特定體系相應(yīng)的最優(yōu)退火溫度。從而可在短時間內(nèi)對PCR實驗進行優(yōu)化，大大提高PCR科研效率。實驗三、 反向PCR (Inverse PCR, IPCR)一、原理：擴增引物相反方向DNA 序列的技術(shù)。用反向的互補引物來擴增兩引物以外的未知序列的片段，而常規(guī)PCR擴增的是已知序列的兩引物之間DNA片段.實驗時選擇已知序

26、列內(nèi)部沒有切點的限制性內(nèi)切酶對該段DNA進行酶切，然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環(huán)化連接，再用一對反向的引物進行PCR，其擴增產(chǎn)物將含有兩引物外未知序列，從而對未知序進行分析研究. 其大致步驟為： a. 用一種在靶序列上沒有切點的限制性內(nèi)切酶 消化大分子量的DNA b. 產(chǎn)生的大小不同的線性DNA片段群體，其中具靶DNA區(qū)段的DNA分子長度不超過2-3Kb,經(jīng)連接后環(huán)化成環(huán)狀分子c. 按靶序列設(shè)計的一對向外引物同靶序列5-端互補序列退火結(jié)合，d. 經(jīng)PCR擴增產(chǎn)生的主要是線性雙鏈DNA分子，它是由左側(cè)的序列和右側(cè)序列首位連接而成，其接點就是限制酶的識別位點 二、操作步驟：（一）、

27、限制性內(nèi)切酶消化 1.  選擇合適的限制性內(nèi)切酶，基因組一定要切成彌散性的條帶。在酶切之前，應(yīng)對基因組DNA定量。 2.  根據(jù)T-DNA的左邊界序列選擇合適的酶切位點EcoRI，BamHI和HindIII/PstI，并在酶切位點上游附近設(shè)計引物Z1，Z2，Z3和Z4，然后用這些內(nèi)切酶分別消化基因組DNA，酶切體系如下： 組分體積10×Buffer for EcoR2L基因組DNA3LEcoR0.5L（10u/L）ddH2OUp to 20L37 過夜，電泳檢測酶切效果。（二）、回收DNA1.   將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)到1.5 ml

28、離心管中，用ddH2O洗滌干凈，并稀釋到250 l；2.   加入等體積的酚和氯仿（V：V=1：1），渦旋混勻，室溫靜置1 min；3.  最大速度（13 000 rpm）離心1 min；4.   將上清移到另一管中，加入等體積的氯仿，渦旋混勻，室溫靜置1 min；5.   最大速度（13 000 rpm）離心2 min； 6.   將上清移到另一管中，加入2.5倍體積的-20預(yù)冷的無水乙醇，0.1倍體積的3 M 乙酸鈉（pH=5.2），輕輕振蕩混勻，室溫靜置5 min；7.   4最大速度（13 000 rpm）離心101

29、5 min； 8.   棄上清，盡量除去管壁上的液體；9.   加入1 ml -20預(yù)冷的70%乙醇，輕輕顛倒幾次。最大速度（13 000 rpm）離心5 min；10.   除去乙醇，在超凈臺上平放，將管壁上的乙醇揮發(fā)掉，2040 l ddH2O溶解。-20保存。三、連接1.  體系如下：組分體積10×T4 ligase Buffer 10LDNA2LT4 ligase1L（10u/L）ddH2OUp to100L2-14   過夜2.  連接體系比較大，而DNA含量比較低，不需加入PEG4000，這樣可以促進分

30、子內(nèi)的連接，減少分子間的連接。試驗中我們采取蹇文嬰等（2002）的方法（12-14連接48 h）。連接完成后，65 水浴10 min滅活。按上述3.抽提回收，溶解于40 l ddH2O中。3.  然后就可以用回收的鏈接片段做PCR了。三、應(yīng)用：利用反向PCR可對未知序列擴增后進行分析，探索鄰接已知DNA片段的序列，并可將僅知部分序列的全長cDNA進行分子克隆，建立全長的DNA探針。應(yīng)用于染色體步移、轉(zhuǎn)位因子和已知序列DNA旁側(cè)病毒整合位點分析等研究。實驗四、 不對稱PCR就像任何DNA一樣，PCR的雙鏈DNA產(chǎn)物也可以供序列測定使用。 然而，按照Sanger雙脫氧末端鏈終止法測定DN

31、A的核苷酸序列，最好是使用單鏈模版DNA。 現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展出了一種專門用于制備單鏈DNA的技術(shù)不對稱PCR技術(shù)。 這種技術(shù)，除了使用的兩種引物濃度相差100倍以外，其他的方面跟常規(guī)PCR技術(shù)沒有什么本質(zhì)的區(qū)別。一、基本原理：不對稱PCR主要是在PCR體系中設(shè)計不同的引物濃度，兩條引物濃度比為1：50或1：100，前12個循環(huán)兩條模板等量擴增，之后低濃度引物消耗殆盡，其 擴增產(chǎn)物減少以至于無；而高濃度引物介導(dǎo)產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物（即單鏈DNA）逐漸增加，可得到大量單鏈DNA（ssDNA）用于直接測序。 PCR擴增所用的兩條引物中，濃度受限制的只及高濃度的1%（或2%）。 經(jīng)過PCR循環(huán)直到限制引物耗盡之

32、前，擴增的引物是雙鏈的DNA序列。而后，反應(yīng)混合物中的另一種高濃度的引物，則利用限制引物合成的DNA鏈做模板，繼續(xù)引導(dǎo)DNA合成。二、實驗步驟：）預(yù)變性；）包括若干變性、引物退火和引物延伸循環(huán)的第一部分擴增；）包括若干變性和引物延伸循環(huán)的第二部分擴增。所述引物延伸中所用引物對中的一條引物的末端均加有一段與待擴增靶序列無關(guān)的寡核苷酸尾。三、應(yīng)用：這樣模板鏈繼續(xù)再循環(huán)，由高濃度的引物合成的DNA要比限制引物多得多，而且仍保持單鏈狀態(tài)。產(chǎn)生的ds-DNA與ss-DNA由于分子量不同可以在電泳中分開，而得到純ss-DNA。不對稱PCR主要為測序制備ss-DNA，尤為用c-DNA經(jīng)不對稱PCR進行DNA

33、序列分析是研究真核DNA外顯子的好方法。實驗五、 多重PCR一、基本原理：一般PCR僅應(yīng)用一對引物，通過PCR擴增產(chǎn)生一個核酸片段，主要用于單一致病因子等的鑒定.多重PCR(multiplex PCR)，又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，它是在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同二、實驗步驟 ：（一）DNA提取：DNA提取可以用DNA提取試劑盒或?qū)嶒炇页Ｓ玫囊恍〥NA提取方法進行。（1）取動物組織100mg 左右于樣品管中，用干凈的剪刀將組織塊剪碎。（2）在樣品管中加入如下試劑：500l ST

34、E 溶液25 l 蛋白酶 K（Proteinase K，10 mgml） ，75l 10SDS 。（3）混勻后置56下消化2 小時以上（隔一定時間混勻一次）。（4）加人等體積的飽和酚溶液，輕輕顛倒混合5 分鐘以上（用于rDNA 和RAPD 分析的樣品需抽提24 小時）。 （5）7 000rmin 離心5 分鐘。（6）小心將上層清液移至另一干凈的離心管中，加入等體積的苯酚及氯仿，并重復(fù)步驟（4）和（5）的抽提過程。&#

35、160;（7）以等體積的氯仿（內(nèi)含125 體積的異戊醇）重復(fù)步驟（4）和（5）的抽提過程。 （8）在上清液中加入110 體積的 3moldmNaAc 或5moldmNHAc、2 倍體積的冷無水乙醇或1 倍體積的異丙醇，以沉淀DNA。（9）置-70下沉淀2 小時或置-20下沉淀過夜。（10）7 000rmin 離心10 分鐘，再以 70冷乙醇洗滌DNA 沉淀一次。將沉淀置真空干燥器或37溫箱中干燥。 （11）以適量的TE 溶液（200500l）溶解

36、DNA 樣品。 （12）以分光光度計測定DNA 的濃度（260nm），260280nm 的光密度比值應(yīng)在 1.8 以上，否則提示可能有蛋白質(zhì)或苯酚的污染。（13）以TE 溶液將DNA 樣品稀釋成所需的工作液的濃度。（14）取2l 左右的樣品進行電泳檢測，以判斷 DNA 是否有降解以及是否需要消除RNA。 （二）DNA定量：用紫外分光光度計進行DNA含量測定。 （三）多重PCR擴增：反應(yīng)體系可以選定為20l，50l等，反應(yīng)體系中含有：DNA模板，Mg+，dNTP，Taq DNA聚合酶，各

37、種引物等。根據(jù)實驗要求，設(shè)計合適的循環(huán)參數(shù)。在設(shè)計循環(huán)參數(shù)時要注意兩個原則：一是退火溫度要足夠高。這是因為，多重PCR技術(shù)是在擴增體系中加入了多對引物同時進行擴增，這樣就會由于錯配而產(chǎn)生一些非特異性的擴增產(chǎn)物，增高退火溫度，可以有效的減少非特異性擴增產(chǎn)物的生成；二是循環(huán)參數(shù)要盡量少，以利于檢測擴增產(chǎn)物。多重PCR在一個反應(yīng)體系中同時擴增多個DNA段，其擴增效率并不是完全相同的，循環(huán)參數(shù)的增加，會使Taq酶的消耗增加，再加上每對引物相對退火效率不同，就會使擴增產(chǎn)物混亂，所以，循環(huán)次數(shù)不宜過多。（四）電泳檢測及結(jié)果分析：取擴增產(chǎn)物10×與26×載樣緩沖液(溴酚藍)混勻上樣，同時

38、加入分子量標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)2瓊脂糖凝膠(含0.5g/ml E、恒壓(200-600V)、電泳1-2小時后，置凝膠于紫外檢測凝膠分析儀觀察結(jié)果，并拍照，記錄分析結(jié)果。三、應(yīng)用：多重PCR的主要用于多種病原微生物的同時檢測或鑒定和病原微生物，某些遺傳病及癌基因的分型鑒定。 a.多種病原微生物的同時檢測或鑒定，是在同一PCR反應(yīng)管中同時加上多種病原微生物的特異性引物，進行PCR擴增.b.某些病原微生物，某些遺傳病或癌基因，型別較多，或突變或缺失存在多個好發(fā)部位，多重PCR可提高其檢出率并同時鑒定其型別及突變等可系統(tǒng)應(yīng)用的有:乙型肝炎病毒的分型;乳頭瘤病毒的分型;單純皰疹病毒的分型;杜氏肌營養(yǎng)不良癥的分型及癌

39、基因的檢測等.實驗六、 RT-PCR 反/逆轉(zhuǎn)錄PCR一、原理：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。二、實驗步驟：（一） 總RNA的提?。?70保存）Trizol法：1、取組織100于玻璃勻漿器中，加入1ml Trizol 冰上抽打勻漿（邊勻漿邊暫停）2、移入1.5mlEP管中，顛倒混勻，室溫保存5min3、加氯仿0.2ml（總體積的1/5），振蕩混合，室溫放置5min4、4，離心12000 rpm，15min 5、取上層液相（約400l）移入一新1.5ml EP管中，加等體積異丙醇（約400l）,振蕩混合，室溫保

40、存10min6、4，離心12000 rpm，10min7、棄上清液，加1ml 75%無水乙醇（4保存），振蕩混合8、4，離心7500 rpm，5min9、棄上清液，室溫放置20min(EP管倒置在濾紙上)使RNA沉淀干燥（不能完全干燥）10、加20ul DEPC水至EP管中，在60孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA充分溶解（ 可保存在液氮或低溫冰箱-70）測RNA濃度：走RNA變性電泳觀察18s、28s條帶，分光光度計檢測260/280吸光度比值調(diào)零：750ul DEPC水測量：745ul DEPC水 + 5ul RNA總RNA濃度= OD260×40×稀釋倍

41、數(shù)（150倍）ug/ml = OD260×40×150 ug/ml = OD260×6 ug/ulA1/A2應(yīng)在1.8-2.0之間注意：提取RNA的質(zhì)量主要是要通過260/280的比值看是不是在2.0左右，當(dāng)OD260/OD280<1.8時提示有蛋白或酚的污染，需要進一步純化RNA；還要跑膠看看28s、18s、5s的三條帶是不是清晰，一般質(zhì)量好的RNA，28s:18s的亮度比例在2:1左右，最后一條5s的應(yīng)該比較淡。（二）cDNA第一鏈的合成（Reverse Transcription）：1、在0.5ml微量離心管中，加入總RNA 1-5g，補充適量的DEP

42、C H2O使總體積達11l。在管中加10M Oligo（dT）12-18 1l，輕輕混勻、離心。2、70加熱10min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min。然后加入下列試劑的混合物：組分體積10×PCR buffer2L10mM dNTPmix1L0.1M DTT2L25mM MgCl22L輕輕混勻，離心。42孵育2-5min。3、加入Superscript1l ，在42水浴中孵育50min。4、于70加熱15min以終止反應(yīng)。5、將管插入冰中，加入RNase H 1l ，37孵育20min，降解殘留的RNA。-20保存?zhèn)溆?。（三）進行常規(guī)PCR：1、取0.5ml PCR管，依次

43、加入下列試劑：組分體積第一鏈cDNA2L上游引物2L下游引物2LdNTP(2mM)4LMgCl22L10×PCR buffer2LTaq酶1LddH2O Up to 50L 2、 加入適量的ddH2O，使總體積達50l。輕輕混勻，離心。3、 設(shè)定PCR程序。在適當(dāng)?shù)臏囟葏?shù)下擴增28-32個循環(huán)。為了保證實驗結(jié)果的可靠與準(zhǔn)確，可在PCR擴增目的基因時，加入一對內(nèi)參（如G3PD）的特異性引物，同時擴增內(nèi)參DNA，作為對照。4、 電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。5、密度掃描、結(jié)果分析：采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對電泳條帶進行密度掃描。三、應(yīng)用：該技術(shù)主要用于分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、

44、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。 RT- PCR即逆轉(zhuǎn)錄PCR，是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U增反應(yīng)（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞/組織中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等四、注意事項：1、雙鏈DNA的變性溫度是由雙鏈中C+G的含量決定的，C+G含量越高，模板DNA的溶解溫度就越高。在選擇的變性溫度下，模板鏈越長變性所需時間就越長。如果變性溫度過低或變性時間過短，會使僅僅富含A+T區(qū)域變性。當(dāng)模板DNA的G+C含量超過55%的時需要更高的變性溫度。 2、復(fù)性過程采用的溫度至

45、關(guān)重要如果復(fù)性溫度太高，寡核苷酸引物不能與模板很好的復(fù)性，擴增效率將會降低。如果復(fù)性溫度太低，引物將產(chǎn)生非特異性復(fù)性，從而導(dǎo)致非特異性的DNA片段的擴增。復(fù)性通常在比理論計算的引物和模板的溶解溫度低35的條件下進行。 3、PCR擴增所需的循環(huán)數(shù)目決定于反應(yīng)體系中起始的模板拷貝數(shù)以及引物延伸和擴增的效率。一旦PCR反應(yīng)進入幾何級數(shù)的增長期，反應(yīng)會一直持續(xù)下去，直至某一成分成為限制因素。從這一點上來說，擴增產(chǎn)物中絕大多數(shù)應(yīng)該是特異性的擴增產(chǎn)物，而非特異性的擴增產(chǎn)物應(yīng)該低到難以檢測到的程度。用TaqDNA聚合酶（效率為0.7）在一個含有10的5次方個拷貝的靶序列的反應(yīng)體系中進行30個循環(huán)后往往可以做

46、到上述的理想情況。實驗七、 巢式PCR（Nested PCR）一、原理：巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用兩對（而非一對）PCR引物擴增完整的片段。第一對PCR引物擴增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物（因為他們在第一次PCR擴增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴增片斷短于第一次擴增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴增產(chǎn)生了錯誤片斷，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。因此，巢式PCR的擴增非常特異 。二、實驗步驟 ：1、目標(biāo)DNA模板的第一對引物結(jié)合。第一對引物也可能結(jié)合到其他具有相似結(jié)合位點的片段上并擴增多種產(chǎn)物。但只有一

47、種產(chǎn)物是目的片斷。2、第二套引物對第一輪PCR擴增的產(chǎn)物進行第二輪PCR擴增。由于第二套引物位于第一輪PCR產(chǎn)物內(nèi)部，而非目的片斷包含兩套引物結(jié)合位點的可能性極小，因此第二套引物不可能擴增非目的片斷。這種巢式PCR擴增確保第二輪PCR產(chǎn)物幾乎或者完全沒有引物配對特異性不強造成的非特異性擴增的污染。三、應(yīng)用：一般應(yīng)用于動物方面。如：病毒，梅毒螺旋體，HIV，腫瘤基因等。巢式PCR，可以在106基因組背景下檢測到一個拷貝的病毒基因，所以特異性很好，但也是最容易污染的PCR。四、注意事項 ： 1.  引物設(shè)計原則：每個特異性引物為2426個堿基，Tm：64-65%，GC：44-55% 。這

48、樣你可以同時做多個不同的TAIL PCR。 2.  在第一輪PCR結(jié)束之后，將PCR產(chǎn)物稀釋1 000倍（視情況而定）作為第二輪PCR的模板，第二輪PCR的產(chǎn)物同樣稀釋1 000倍（視情況而定）作為第三輪PCR的模板，這樣依次類推。實際操作中可以搞3輪甚至更多，當(dāng)然做3輪是比較合適了，這個時候PCR的產(chǎn)物已經(jīng)是高度特異性了。實驗八、降落/遞減PCR（Touchdown PCR）一、原理：指的是每一個（或n個）循環(huán)退火溫度逐步降低1度，直到達到一個較低的退火溫度，該溫度稱為：“touchdown"退火溫度，然后在該溫度下繼續(xù)循環(huán)10個左右循環(huán)。該策略的目的在于確保第一個引物模

49、板雜交事件發(fā)生在最互補的反應(yīng)物之間，即特異性擴增的反應(yīng)物之間，當(dāng)退火溫度降低到非特異性擴增發(fā)生的水平時，特異產(chǎn)物在此時已經(jīng)有一個幾何數(shù)的起始優(yōu)勢，在剩余的反應(yīng)中，特異產(chǎn)物會競爭非特異產(chǎn)物，特異產(chǎn)物始終優(yōu)先擴增，從而產(chǎn)生單一的占主導(dǎo)地位的擴增產(chǎn)物。二、實驗步驟：遞減PCR開始先設(shè)定一個比較高的黏合溫度，每個循環(huán)黏合溫度下降1，到一個較低溫度以后每個循環(huán)的黏合溫度保持不變直到結(jié)束。在剛下降到特異性結(jié)合可以進行的最高溫度時，可以達到最高的特異性。這樣在起初的幾個循環(huán)中，特異性擴增序列可以相對非特異性序列多擴增若干倍，從而減輕非特異性擴增對結(jié)果的干擾。這種方法可用于省去多次試驗最佳黏合溫度的工作。PC

50、R設(shè)置程序：一般退火溫度為從Tm+5度降落至Tm-10度,每度2個cycle,最后在Tm-10度上增加5-10個cycle.例：94度預(yù)變性3分鐘，94度變性30秒，65度（Tm若為55度）退火30秒，72度延伸1分鐘。以后每個循環(huán)依次降低1度，直到50度，共15個循環(huán)。94度變性30秒，50度退火30秒，72度延伸1分鐘。1520個循環(huán)。72度延伸10分鐘。三、應(yīng)用：用來避免非特異性序列的擴增。PCR中引物的黏合溫度(annealing temperature)決定了黏合的特異性，溫度越高特異性越強，但過高則不能實現(xiàn)引物和模板的結(jié)合，而過低會產(chǎn)生大量非特異性產(chǎn)物。因此進行PCR時需要尋找合適

51、的黏合溫度。實驗九、重疊延伸PCR（ SOE PCR）一、原理：重疊延伸 PCR 技術(shù) (gene splicing by overlap extension PCR, 簡稱 SOE PCR) 由于采用具有互補末端的引物 , 使PCR 產(chǎn)物形成了重疊鏈 , 從而在隨后的擴增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸 , 將不同來源的擴增片段重疊拼接起來 。此技術(shù)利用PCR 技術(shù)能夠在體外進行有效的基因重組，而且不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理 ,&#

52、160;可利用這一技術(shù)很快獲得其它依靠限制性內(nèi)切酶消化的方法難以得到的產(chǎn)物 。 重疊延伸 PCR 技術(shù)成功的關(guān)鍵是重疊互補引物的設(shè)計 。二、實驗步驟：1、引物設(shè)計重疊延伸PCR做定點突變引物的設(shè)計，如下圖所示。而在隨后的擴增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸 , 將不同來源的擴增片段重疊拼接起來 。此技術(shù)利用PCR 技術(shù)能夠在體外進行有效的基因重組，而且不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理 , 可利用這一技術(shù)很快獲得其它依靠限制性內(nèi)切酶消化的方法難以得到的產(chǎn)物 。 重疊延伸 

53、PCR 技術(shù)成功的關(guān)鍵是重疊互補引物的設(shè)計 。應(yīng)用：重疊延伸 PCR 在基因的定點突變、融合基因的構(gòu)建、長片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的擴增等方面有其廣泛而獨特的應(yīng)用。實驗步驟：1、引物設(shè)計重疊延伸PCR做定點突變引物的設(shè)計，如下圖所示。引物F及R為基因兩端特異引物，其中Fm及Rm為中間引物。其中引物Fm及Rm中間共享一段序列（至少10bp完全匹配），*為突變點，突變點最好是位于引物的5端，盡量避免出現(xiàn)在3端。然后分別用引物F和Rm及Fm和R進行配對進行PCR。該步一定要用pfu酶，不能用Taq酶，因為Taq酶容易在PCR產(chǎn)物末端加A，會造成產(chǎn)物

54、移碼突變。2. 分別回收第1步所得兩條PCR產(chǎn)物3. 將第2步所得兩份PCR產(chǎn)物進行混合使其互為模板及引物，加入dNTP及Pfu或Taq酶及引物F和R進行PCR擴增出具有突變的全基因。三、應(yīng)用：重疊延伸 PCR 在基因的定點突變、融合基因的構(gòu)建、長片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的擴增等方面有其廣泛而獨特的應(yīng)用。實驗十、免疫PCR (Immuno PCR, Im-PCR)是利用抗原抗體反應(yīng)的特異性和PCR擴增反應(yīng)的極高靈敏性而建立的一種微量抗原檢測技術(shù)。是用一段已知DNA分子標(biāo)記抗體作為探針，用此探針與待測抗原反應(yīng)，PCR擴增粘附在抗原抗體復(fù)合物上的這段DNA分子，電泳

55、定性，根據(jù)特異性PCR產(chǎn)物的有無，來判斷待測抗原是否存在。一、基本原理：免疫PCR主要由兩個部分組成，第一部分的免疫反應(yīng)類似于普通的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）的測定過程；第二部分即通常的PCR檢測，抗原分子的量最終由PCR產(chǎn)物的多少來反映。第一步中，首先用待測抗原（如牛血清白蛋白（ESA）包被微滴板孔，再加入相應(yīng)的特異抗體，于是抗體就與固相上的抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，蛋白A-鏈親合素（Protein A-Streptavidin）嵌合體（重組融合蛋白）中的蛋白A部分可與固相上抗原抗體復(fù)合物中的抗體IgG結(jié)合，而鏈親合素部分可與生物素化的pUC19（質(zhì)粒DNA) (Biotin-pUC1

56、9）中的生物素反應(yīng)，從而將特定的DNA間接吸附于固相。接下來，就是第二步中的PCR過程，第一步中吸附于固相的pUC19質(zhì)粒DNA在相應(yīng)的引物存在下，可經(jīng)PCR在幾小時內(nèi)而放大數(shù)百萬倍，PCR產(chǎn)物的多少與固相上抗原的量成正比。二、PCR由以下五部分構(gòu)成：（1）待測抗原；（2）生物素化抗體；（3）親和素（連接分子）；（4）生物素化DNA；（5）PCR擴增。三、主要程序：（1） 抗原+生物素化抗體抗原-生物素化抗體復(fù)合物；（2） 加親合素抗原-生物素化抗體-親合素復(fù)合物；（3） 加生物素化DNA抗原-生物素化抗體-親合素-生物素化DNA；（4） PCR擴增生物素化DNA部分。四、實驗步驟：（一）制備生物素化DNA 將噬粒 BLuescript skt，用生物素標(biāo)記的M13