花藥和花粉的培養(yǎng)

1、第二節(jié)第二節(jié) 花藥和花粉培養(yǎng)花藥和花粉培養(yǎng) 概念及意義概念及意義花粉及小孢子培養(yǎng)花粉及小孢子培養(yǎng)花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng)一一. 概念及意義概念及意義花藥的結(jié)構(gòu)花藥的結(jié)構(gòu) 花藥是產(chǎn)生花粉的主要部分，一般由四個(gè)花粉囊組成（也有兩個(gè)）分左、右兩半，中間由藥隔相連，從花絲通入一條維管束與藥隔相連，（主要提供養(yǎng)料，水分）囊外由囊壁包圍，內(nèi)生許多花粉粒，花粉粒（小孢子）成熟后，同一側(cè)的隔壁消失而上，下連通。花藥開裂（縱，橫，孔，瓣裂）花粉粒散出，開始傳粉?；ㄋ幍陌l(fā)育花藥的發(fā)育幼嫩細(xì)胞幼嫩細(xì)胞孢原細(xì)胞孢原細(xì)胞初生壁細(xì)胞初生壁細(xì)胞造孢細(xì)胞造孢細(xì)胞花粉母細(xì)胞花粉母細(xì)胞纖維層纖維層中層（逐漸消失）中層（逐漸消失）絨氈層（

2、逐漸消失）絨氈層（逐漸消失）平周平周分裂分裂 花藥的起源：最初在花托上產(chǎn)生雄蕊原基成為早期的花藥頂端發(fā)育：外為一層原表皮細(xì)胞以后發(fā)育成表皮內(nèi)為形狀相似具有高度分裂能力的薄壁細(xì)胞，由于四個(gè)角隅細(xì)胞分裂速度快而形成四棱的外形即花藥的雛體。每棱的表皮下出現(xiàn)一個(gè)或幾個(gè)體積較大的細(xì)胞稱為孢原細(xì)胞，經(jīng)常平周分裂產(chǎn)生二層： 周緣細(xì)胞緊貼表皮又稱初生壁細(xì)胞，以后發(fā)育變化與表皮一起構(gòu)成花粉囊的壁層。造孢細(xì)胞，有絲分裂形成花粉母細(xì)胞花藥中部細(xì)胞分裂分化為藥隔和維管束。 花粉粒的形成過程花粉粒的形成過程造孢細(xì)胞造孢細(xì)胞2n四分體四分體n有絲分裂有絲分裂減數(shù)分裂減數(shù)分裂花粉母細(xì)胞花粉母細(xì)胞2n單核花粉粒單核花粉粒n成

3、熟花粉粒成熟花粉粒n（雄配子體）（雄配子體）3-細(xì)胞花粉粒細(xì)胞花粉粒（三核花粉粒）（三核花粉粒）精細(xì)胞精細(xì)胞n精細(xì)胞精細(xì)胞n2-細(xì)胞花粉粒細(xì)胞花粉粒（二核花粉粒）（二核花粉粒）營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞n生殖細(xì)胞生殖細(xì)胞n花粉粒的形成花粉粒的形成 兩者的共同點(diǎn)是利用兩者的共同點(diǎn)是利用花粉（小孢子）染色花粉（小孢子）染色體數(shù)目的單倍性體數(shù)目的單倍性，培育單倍體植株，這是花藥，培育單倍體植株，這是花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物遺傳育種的和花粉培養(yǎng)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物遺傳育種的主要原因。主要原因。染色體組染色體組 (genome)(genome) 一般地說，像生殖細(xì)胞中的一般地說，像生殖細(xì)胞中的一組大小、

4、形狀各不相同的染色一組大小、形狀各不相同的染色體就叫一個(gè)染色體組。體就叫一個(gè)染色體組。 一個(gè)染色體組中含有的染色一個(gè)染色體組中含有的染色體數(shù)一般用體數(shù)一般用 x x 來表示，例如人來表示，例如人體的一個(gè)染色體組可以表示為體的一個(gè)染色體組可以表示為 x=23x=23。單倍體單倍體（haploidhaploid） 如：普通小麥為六倍體，體細(xì)胞中有六個(gè)染色體如：普通小麥為六倍體，體細(xì)胞中有六個(gè)染色體組，而以它的花粉培養(yǎng)出的單倍體植株的細(xì)胞中組，而以它的花粉培養(yǎng)出的單倍體植株的細(xì)胞中就含有三套染色體組。就含有三套染色體組。 只有二倍體生物的單倍體才是一個(gè)染色體組。只有二倍體生物的單倍體才是一個(gè)染色體組

5、。所所以，只要是由配子發(fā)育成的個(gè)體，無論其體細(xì)胞以，只要是由配子發(fā)育成的個(gè)體，無論其體細(xì)胞中含有幾組染色體均叫單倍體。中含有幾組染色體均叫單倍體。 diploid diploid 植物其植物其haploidhaploid即為即為monoploidmonoploid 玉米玉米 2n = 2x = 20 n = x = 102n = 2x = 20 n = x = 10 水稻水稻 2n = 2x = 24 n = x = 122n = 2x = 24 n = x = 12 柑橘柑橘 2n = 2x = 18 n = x = 92n = 2x = 18 n = x = 9 tetraploidtet

6、raploid植物其植物其haploidhaploid為為dihaploiddihaploid 馬鈴薯馬鈴薯 2n = 4x = 48 n = 2x = 242n = 4x = 48 n = 2x = 24 陸地棉陸地棉 2n = 4x = 52 n = 2x = 262n = 4x = 52 n = 2x = 26 hexaploidhexaploid植物其植物其haploidhaploid為為triploidtriploid 普通小麥普通小麥2n = 6x = 42 n = 3x = 212n = 6x = 42 n = 3x = 21 octoploidoctoploid植物其植物其ha

7、ploidhaploid為為tetraploidtetraploid 草莓草莓 2n = 8x = 56 n = 4x = 282n = 8x = 56 n = 4x = 28單倍體植物與它們的二倍體相比較，有三個(gè)明單倍體植物與它們的二倍體相比較，有三個(gè)明顯的特點(diǎn)：顯的特點(diǎn)： 1、體細(xì)胞染色體數(shù)減半、體細(xì)胞染色體數(shù)減半 2、生長(zhǎng)發(fā)育弱，體形小、各器官明顯減?。?、生長(zhǎng)發(fā)育弱，體形小、各器官明顯減??； 3、雌雄配子嚴(yán)重?cái)∮?，有的甚至不能進(jìn)入有性世代。、雌雄配子嚴(yán)重?cái)∮?，有的甚至不能進(jìn)入有性世代。培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件培養(yǎng)培養(yǎng)部分花藥通過胚狀體途徑形成小植株煙草花藥培養(yǎng)煙草花藥培養(yǎng)a) 球形胚

8、 d) 魚雷形胚蕓苔屬小孢子培養(yǎng)部分花藥產(chǎn)生愈傷組織接種在平板上的水稻花藥水稻花藥培養(yǎng)愈傷組織轉(zhuǎn)接種到再生培養(yǎng)基愈傷組織分化形成再生植株水稻花藥培養(yǎng) 花藥培養(yǎng)不經(jīng)愈傷組織花藥培養(yǎng)不經(jīng)愈傷組織直接產(chǎn)生胚狀體直接產(chǎn)生胚狀體是是最最理想的方式理想的方式，這樣可免去愈傷組織和生根階段。，這樣可免去愈傷組織和生根階段。但多數(shù)情況是產(chǎn)生愈傷組織，這時(shí)要用提高細(xì)但多數(shù)情況是產(chǎn)生愈傷組織，這時(shí)要用提高細(xì)胞分裂素，降低生長(zhǎng)素甚至不用生長(zhǎng)素的分化胞分裂素，降低生長(zhǎng)素甚至不用生長(zhǎng)素的分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化產(chǎn)生芽。培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化產(chǎn)生芽。花藥培養(yǎng)生長(zhǎng)過程花藥培養(yǎng)生長(zhǎng)過程 (a) anther at the onset of

9、 the culture.(b) anther after 6 days in culture. (c, d) embryos emerging from the anthers after 30 days in culture, showing roots (c) and shoots (d). (eg) plantlets with cotyledons (e) and with leaves (f, g) subcultured in growing medium. (h) 80-day-old regenerated haploid plant from anther culture

10、(left-hand side) and a diploid control of the same age (right-hand side). 花藥有藥壁花藥有藥壁(2(2n)n)、藥隔藥隔(2(2n)n)、花粉花粉( (n)n)等，等，因此，再生植株有可因此，再生植株有可能來自藥壁能來自藥壁(2(2n)n)、藥藥隔隔(2(2n)n)、或起源于數(shù)或起源于數(shù)個(gè)花粉個(gè)花粉( (n)n)的嵌合體。的嵌合體。 游離花粉粒培養(yǎng)，游離花粉粒培養(yǎng)，再生植株為純合體。再生植株為純合體?？醋o(hù)培養(yǎng)：看護(hù)培養(yǎng)：將花藥水平放于固體培養(yǎng)基上，在其上覆將花藥水平放于固體培養(yǎng)基上，在其上覆 蓋小圓形濾紙，在濾紙滴加蓋小

11、圓形濾紙，在濾紙滴加0.50.5mlml含含1010個(gè)花粉個(gè)花粉 粒的懸浮液滴的培養(yǎng)方法。粒的懸浮液滴的培養(yǎng)方法。微室培養(yǎng)：微室培養(yǎng)：將一滴花粉懸液滴在蓋玻片上，在翻過來將一滴花粉懸液滴在蓋玻片上，在翻過來 放在凹穴載玻片上，蓋玻片四周用石蠟密封。放在凹穴載玻片上，蓋玻片四周用石蠟密封。雙層培養(yǎng)：雙層培養(yǎng)：固相和液相雙層培養(yǎng)。固相和液相雙層培養(yǎng)。a: nln培養(yǎng)基培養(yǎng)基過濾滅菌過濾滅菌b: 花蕾研磨花蕾研磨c: 過濾小孢子過濾小孢子d,e: b5懸浮懸浮f: 離心離心g: nln懸浮懸浮h: 胚胎發(fā)生胚胎發(fā)生i: 植株再生植株再生四、花藥和花粉培養(yǎng)中雄核發(fā)育的途徑及四、花藥和花粉培養(yǎng)中雄核發(fā)育

12、的途徑及 雄核發(fā)育誘導(dǎo)雄核發(fā)育誘導(dǎo)1 1、雄核發(fā)育的途徑、雄核發(fā)育的途徑（根據(jù)小孢子最初幾次分裂方式的不同）（根據(jù)小孢子最初幾次分裂方式的不同） 小孢子發(fā)育途徑小孢子發(fā)育途徑（途徑（途徑） 單核小孢子有絲分裂形成單核小孢子有絲分裂形成2 2個(gè)等同的子細(xì)胞個(gè)等同的子細(xì)胞 營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育途徑（途徑營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育途徑（途徑） 單核小孢子進(jìn)行一次正常的非均等分裂后，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞繼續(xù)分裂單核小孢子進(jìn)行一次正常的非均等分裂后，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞繼續(xù)分裂 生殖細(xì)胞發(fā)育途徑（途徑生殖細(xì)胞發(fā)育途徑（途徑） 單核小孢子進(jìn)行一次正常的非均等分裂后，生殖細(xì)胞繼續(xù)分裂單核小孢子進(jìn)行一次正常的非均等分裂后，生殖細(xì)胞繼續(xù)分裂 生殖細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)

13、細(xì)胞發(fā)育途徑（途徑生殖細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育途徑（途徑）單核小孢子進(jìn)行非均等分裂后，生殖細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞均繼續(xù)分裂，參與孢子體的單核小孢子進(jìn)行非均等分裂后，生殖細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞均繼續(xù)分裂，參與孢子體的形成形成2 2、雄核發(fā)育誘導(dǎo)、雄核發(fā)育誘導(dǎo) 多數(shù)物種適于雄核發(fā)育的花粉發(fā)育時(shí)期是在多數(shù)物種適于雄核發(fā)育的花粉發(fā)育時(shí)期是在花花粉單核晚期粉單核晚期（即在有絲分裂即將開始、正在進(jìn)行（即在有絲分裂即將開始、正在進(jìn)行或剛剛結(jié)束時(shí)），此時(shí)對(duì)于誘導(dǎo)雄核發(fā)育的外界或剛剛結(jié)束時(shí)），此時(shí)對(duì)于誘導(dǎo)雄核發(fā)育的外界刺激刺激最敏感最敏感。 原因：原因：煙草花粉發(fā)育的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：煙草花粉在正煙草花粉發(fā)育的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：煙草花粉在正

14、常的或體內(nèi)發(fā)育期間，單核小孢子在第一次有絲分裂之后常的或體內(nèi)發(fā)育期間，單核小孢子在第一次有絲分裂之后能活躍地合成能活躍地合成rnarna、蛋白質(zhì)和核組蛋白。但是，與蛋白質(zhì)和核組蛋白。但是，與rrnarna合合成有關(guān)的基因在第一次有絲分裂以后會(huì)關(guān)閉成有關(guān)的基因在第一次有絲分裂以后會(huì)關(guān)閉2424小時(shí)。據(jù)研小時(shí)。據(jù)研究，這一時(shí)期是究，這一時(shí)期是花粉發(fā)育分化終端的臨界期花粉發(fā)育分化終端的臨界期，凡是已經(jīng)通，凡是已經(jīng)通過這一時(shí)期的花粉粒，都會(huì)不可逆地依一定程序進(jìn)行配子過這一時(shí)期的花粉粒，都會(huì)不可逆地依一定程序進(jìn)行配子體分化。因此，花藥培養(yǎng)的取材時(shí)間必須在這一時(shí)期之前，體分化。因此，花藥培養(yǎng)的取材時(shí)間必須

15、在這一時(shí)期之前，才有可能誘導(dǎo)花粉配子體改變發(fā)育方按孢子體方式發(fā)育。才有可能誘導(dǎo)花粉配子體改變發(fā)育方按孢子體方式發(fā)育。 sunderland(1978) sunderland(1978)認(rèn)為在花粉群體中具有胚胎發(fā)生潛認(rèn)為在花粉群體中具有胚胎發(fā)生潛力的花粉，是在培養(yǎng)前被作用于活體的因素所力的花粉，是在培養(yǎng)前被作用于活體的因素所預(yù)先決定預(yù)先決定的的，離體花粉只是起孢子體發(fā)育的觸發(fā)作用和維持相繼，離體花粉只是起孢子體發(fā)育的觸發(fā)作用和維持相繼的生長(zhǎng)作用。的生長(zhǎng)作用。 這些具有胚胎發(fā)生潛力的花粉粒比正常花粉粒小，細(xì)這些具有胚胎發(fā)生潛力的花粉粒比正常花粉粒小，細(xì)胞質(zhì)染色淺，發(fā)育遲緩，稱為胞質(zhì)染色淺，發(fā)育遲緩

16、，稱為s-s-花粉或花粉或e-e-花粉。花粉。 在一個(gè)植物種或品種的花粉群體中，出現(xiàn)正常和非正在一個(gè)植物種或品種的花粉群體中，出現(xiàn)正常和非正常兩種類型花粉粒的現(xiàn)象，稱為常兩種類型花粉粒的現(xiàn)象，稱為花粉的二型性花粉的二型性。 該理論是否具有真實(shí)性和普遍性，還需要進(jìn)一步的試該理論是否具有真實(shí)性和普遍性，還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)和觀察。驗(yàn)和觀察。如在水稻中，秈稻花粉培養(yǎng)力遠(yuǎn)低于糯稻?；蛐团郀铙w數(shù)量/106小孢子 成苗率（%）處于不同發(fā)育階段的煙草花芽處于不同發(fā)育階段的煙草花芽 花粉發(fā)育時(shí)期的確定n預(yù)處理是小孢子培養(yǎng)成功的前提條件n 預(yù)處理目的：是改變小孢子的發(fā)育方向，使盡可能多的小孢子從配子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑（即成為具胚胎發(fā)生潛力的小孢子）。適當(dāng)?shù)念A(yù)處理能使綠苗產(chǎn)量大量增加。similar nuclei3 to 5cmicrospore3 to 5cgenerativevegetativecold treatment (3 to 5c) enhances symmetricdivision of microspores or division of vegetativenuclei embryo花藥組織的存在對(duì)小孢子的胚性分裂具有明顯的促進(jìn)作用。但花藥壁損傷會(huì)釋放