蛋白質(zhì)測序技術

1、蛋白質(zhì)測序技術一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構的測定 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構是蛋白質(zhì)作用的特異性、空間結(jié)構的差異性和生物學功能多樣性的基礎。 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構中除肽鍵外，有些還含有二硫鍵。蛋白質(zhì)一級結(jié)構 測定的原理1.氨基酸組成的分析(1) 蛋白質(zhì)樣品的純化; (2) 蛋白質(zhì)分子中多肽鏈數(shù)目測定(3) 氨基酸組成的分析蛋白質(zhì)一級結(jié)構的測定測定多肽鏈的數(shù)目蛋白質(zhì)測序的步驟拆分多肽鏈拆分多肽鏈斷開多肽鏈內(nèi)的二硫鍵斷開多肽鏈內(nèi)的二硫鍵測定每一肽鏈的氨基酸組成測定每一肽鏈的氨基酸組成鑒定多肽鏈的鑒定多肽鏈的n-末端和末端和c-末端末端裂解多肽鏈為較小的肽段裂解多肽鏈為較小的肽段測定各肽段的氨基酸序列測定各肽段的氨基酸序列

2、利用重疊肽重建完整多肽鏈的一級結(jié)構利用重疊肽重建完整多肽鏈的一級結(jié)構確定二硫鍵的位置確定二硫鍵的位置蛋白質(zhì)一級結(jié)構測定基本原則1.確定蛋白質(zhì)的純度在97%以上。2.測定多肽鏈的數(shù)目。3.拆分多肽鏈。4.分析每一條多肽鏈的氨基酸組成。5.鑒定多肽鏈的n末端和c末端氨基酸殘基。6.用兩種以上方法裂解多肽鏈成較小的肽段。7.測定各肽段的氨基酸序列。8.拼接各肽段成完整的多肽鏈。9.確定二硫鍵的位置。.多肽鏈數(shù)目的測定 根據(jù)蛋白質(zhì)n端和c端殘基的摩爾數(shù)和蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量可確定分子中的多肽鏈數(shù)目。若含一條多肽鏈，蛋白質(zhì)的摩爾數(shù)與末端基的摩爾數(shù)相等；如果后者是前者的倍數(shù)，說明該蛋白質(zhì)分子是由多條多肽鏈

3、組成。如果檢測到的末端基多于一種，表明蛋白質(zhì)由兩條或多條不同的多肽鏈組成，即樣品是雜多聚蛋白質(zhì)（heteromultimeric protein）。.拆分蛋白質(zhì)的多肽鏈 寡聚蛋白質(zhì)的亞基必須拆分。可用變性劑如8 mol/l尿素、6 mol/l鹽酸胍或高濃度鹽處理。若亞基間通過二硫橋（s-s）交聯(lián)，如胰島素（含兩條多肽鏈）和-胰凝乳蛋白酶（含3條多肽鏈）則可用氧化劑或還原劑將二硫鍵斷開。 拆開后的單個多肽鏈可根據(jù)它們的大小或/和電荷的不同進行分離、純化。.拆開多肽鏈內(nèi)的二硫橋 多肽鏈內(nèi)半胱氨酸殘基之間的s-s橋必須在進行第4步前予以斷裂。.測定每一條多肽鏈的氨基酸組成 分離純化的多肽鏈一部分樣品

4、完全水解，測定氨基酸組成，計算氨基酸成分的分子比或各種殘基的數(shù)目。.鑒定多肽鏈的n端和c端殘基 多肽鏈的另一部分樣品進行末端殘基的鑒定，以便建立兩個重要的氨基酸序列參考點。.裂解多肽鏈成較小的片段 用兩種或幾種不同的斷裂方法（指斷裂點不一樣）將每條多肽鏈樣品降解成兩套或幾套重疊的肽段或稱肽碎片。每套肽段進行分離、純化，并對每一純化了的肽段進行氨基酸組成和末端殘基的分析。.測定各肽斷的氨基酸序列 最常用edman降解法，并有自動序列分析儀可供利用，此外尚有酶解法和質(zhì)譜法等。.建立完整多肽鏈的一級結(jié)構 利用兩套或多套肽段的氨基酸序列彼此間有交錯重疊可以拼湊出原來的完整多肽鏈的氨基酸序列。.確定半胱

5、氨酸殘基間形成的s-s交聯(lián)橋的位置 氨基酸序列測定中不包括輔基成分分析，但是它應屬于蛋白質(zhì)化學結(jié)構內(nèi)容。2.n-2.n-末端氨基酸組成的分析末端氨基酸組成的分析(1)與2，4-二硝基氟苯的反應 (sanger反應）在弱堿性溶液中，氨基酸的- 氨基很容易與2，4-二硝基氟苯（dnfb）作用，生成穩(wěn)定的黃色2，4-二硝基苯基氨基酸（簡寫為dnp-氨基酸）。 dnfb+nccr3onccr1onccr2ohhhhhh2nccr5onccr4ohhhho2no2nfo2no2nfnccr3onccr1onccr2ohhhhhhnccr5onccr4ohhhhhclo2no2nncr1hhcooh+ot

6、her amino acidsdnp-amino acid sanger法法 dnfb （二硝基氟苯）反應二硝基氟苯）反應黃色:根據(jù)它在薄層層析或紙電泳中的遷移特性進行鑒定 丹磺酰氯是二甲氨基萘磺酰氯的簡稱+hci 這個反應首先被edman用于鑒定多肽或蛋白質(zhì)的n-末端氨基酸。 在弱堿性條件下，氨基酸中的-氨基還可以與異硫氰酸苯酯（pitc）反應，產(chǎn)生相應的苯氨基硫甲酰氨基酸（ptc-氨基酸）。在無水酸中，ptc-氨基酸即環(huán)化為苯硫乙內(nèi)酰脲（pth），后者在酸中極穩(wěn)定，此法最大優(yōu)點是水解除去末端標記的氨基酸產(chǎn)基時不會破壞余下的多肽鏈。 +pitc弱堿中弱堿中(400 c)苯硫乙內(nèi)酰脲苯硫乙內(nèi)酰

7、脲(pth-aa)(pth-aa)(無水氫氟酸中無水氫氟酸中)h+苯氨基硫甲酰氨基酸苯氨基硫甲酰氨基酸（ptc-ptc-氨基酸）氨基酸）（edman反應）反應）.2021-10-30南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院16（4）氨肽酶法從多肽鏈的從多肽鏈的n n未端依次向內(nèi)切未端依次向內(nèi)切 nhnh2 2 -aa-aa-aa-aa. 據(jù)一定時間內(nèi)釋放出的據(jù)一定時間內(nèi)釋放出的aaaa的數(shù)量和種的數(shù)量和種類來推測類來推測. . 3. c-未端的測定方法肼解法 多肽與肼在無水條件無水條件下加熱，c-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與c-端氨基

8、酸分離。 注:末端若為半胱氨酸或胱氨酸半胱氨酸或胱氨酸就不能用此法，必須烷基化后再肼解。h2nch crohnch croorncchhnohn-1n-端氨基酸 c-端氨基酸orncchh2nohh2nch cronhnh2+h+nh2nh2氨基酸酰肼c-端氨基酸用自動序列分析儀測序用自動序列分析儀測序儀器原理：edman法。1967液相測序儀 自旋反應器，適于大肽段。1971固相測序儀表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦連肽段的端。1981氣相測序儀 用polybrene反應器。 （聚陽離子）四級銨鹽聚合物 液相：5nmol 20-40肽 97% 氣相：5pmol 60 肽 98%蛋白質(zhì)序列儀的

9、結(jié)構示意圖序列儀反應室的結(jié)構 20 種pth氨基酸hplc圖譜二硫鍵、酰胺及其他修飾基團的確定二硫鍵、酰胺及其他修飾基團的確定1、二硫鍵的確定（對角線電泳法）二硫鍵的確定（對角線電泳法）碘乙酰胺封閉-sh胃蛋白酶酶解蛋白質(zhì)第一向電泳過甲酸氧化ss生成-so3h第二向電泳分離出含二硫鍵的兩條短肽，測序與拼接出的肽鏈比較，定出二硫鍵的位置。 樣品蛋白質(zhì)經(jīng)硫氧還蛋白處理后，利用熒光巰基探針標記巰基，目標蛋白會帶上熒光探針。再進行對角線電泳時，如果發(fā)現(xiàn)目標蛋白存在分子內(nèi)二硫鍵，則經(jīng)處理后所得的點位于對角線的上方；如果目標蛋白存在分子間二硫鍵，則經(jīng)處理后得到的點位于對角線的下方。 2、酰胺的確定酰胺的確

10、定asp（天冬氨酸） asn（天冬酰胺）、glu（谷氨酸）-gln酶解肽鏈，產(chǎn)生含單個asx或glx的肽，用電泳法確定是asp還是asn舉例：leu-glx-pro-val肽在ph=6.0 時，電荷量是 leu+ pro0 val- 此肽除glx外，凈電荷為0，可根據(jù)此肽的電泳行為確定是glu或是gln。3、糖、脂、磷酸基位置的確定糖、脂、磷酸基位置的確定糖類通過asn、ser與蛋白質(zhì)連接，-n-糖苷 -c-糖苷脂類：ser、 thr（蘇氨酸）、cys（半胱氨酸）磷酸：ser、 thr、his經(jīng)驗性序列： lys(arg)-ser-asn-ser(po4)arg-thr-leu-ser(po4

11、)lys(arg) ala-ser(po4)序列測試時應注意的問題 一、與樣品相關的因素（1）樣品純度：90%, 鹽含量在mmol/l內(nèi)，不含變性劑（如sds)等雜質(zhì)，其n-端必須是均一的高純樣品。例如樣品中含2個混合物，只有含量相差4-5倍以上才能對主序列和次序列進行分析。純度鑒定方法：a：質(zhì)譜b ：sds-pagec ：hplcd ：hpce 一般采用2種以上的方法加以驗證。（2）樣品量： 至少需要10pmol,例如標準蛋白質(zhì)測定：10pmol樣品可以測定20氨基酸殘基。 一般樣品量大于50pmol或者更多測定序列越長。如分子量為20000的蛋白質(zhì)，50pmol約為1微克。所以蛋白質(zhì)n-端

12、測序?qū)儆诔Ｒ?guī)測定。（）樣品存在狀態(tài)a 液體：液體樣品中不能含有蛋白酶以防降解，同時樣品測試前不能放置太久，在20以下保存，最好盡早測試。b 轉(zhuǎn)膜樣品：樣品經(jīng)凝膠電泳分離后，應馬上進行電轉(zhuǎn)移至pvdf膜上面，轉(zhuǎn)膜前不能放置很久以防止樣品擴散。含有樣品的pvdf可以用濾紙夾住保持在密封塑料袋中，可以在冰箱保存3-6個月。（）如果樣品沒有任何信號峰，要考慮蛋白n-端封閉。具報道約50%天然蛋白質(zhì)n-端被修飾如乙?；?，甲酰化，焦谷氨酸化，須經(jīng)蛋白質(zhì)化學降解或酶切后分離后分析。 有時樣品在分離純化中中會產(chǎn)生n-端封閉，主要由于溶液中去垢劑或化學物質(zhì)與蛋白樣品n-端功能基團反應，或者分離純化中ph過高（p

13、h9-10）轉(zhuǎn)膜樣品要求： （）為防止部分蛋白質(zhì)在電泳過程被膠內(nèi)雜質(zhì)而封閉末端，請預先自做預電泳。即用低電壓跑空膠2.5h再上樣電泳分離。 （）電泳過程中，用盡量量避條帶帶拖現(xiàn)現(xiàn)，用于測序的條帶用狹窄清晰。而且必須保證一定的量，測定20個氨基酸以上的蛋白質(zhì)，至少需要2-3條明亮，清晰的條帶。 （)樣品轉(zhuǎn)膜后請用coomassier250染色分鐘，量避使用coomassieg250. ( 4 ) 含樣品的pvdf膜夾在濾紙間保存在密封塑料袋中，冰箱內(nèi)可以放置-6月（），電泳緩沖液建議使用緩沖液，而不要使用ris-甘氨酸緩沖液。二、edman降解與儀器有關的因素 （1）由于各種氨基酸殘基化學或物理

14、性質(zhì)不同，因此判斷其含量時pth信號的強弱會發(fā)生變化。如：絲氨酸和蘇氨酸因發(fā)生脫羥基而破壞，半胱氨酸被修飾很難有信號，組氨酸和精氨酸由于極性而難以萃取，蛋氨酸極易氧化而收率低。 （2）修飾殘基在檢測時接近或覆蓋已知氨基酸時會造成氨基酸識別錯誤。 （3）測序用的化學試劑必須具有高的純度，消除一切可能導致在pth色譜中產(chǎn)生的假峰，所有試劑和溶劑均保證測序級。二、二級結(jié)構的測定 圓二色光譜法（圓二色光譜法（cd） 肽鍵是高度有規(guī)律排列的，其排列的方向性決定了肽鍵能肽鍵是高度有規(guī)律排列的，其排列的方向性決定了肽鍵能級躍遷的分裂情況。具有不同二級結(jié)構的蛋白質(zhì)或多肽所級躍遷的分裂情況。具有不同二級結(jié)構的蛋

15、白質(zhì)或多肽所產(chǎn)生產(chǎn)生cd譜帶的位置、吸收的強弱都不相同。譜帶的位置、吸收的強弱都不相同。因此，因此，根據(jù)所測得蛋白質(zhì)根據(jù)所測得蛋白質(zhì)或多肽的遠紫外或多肽的遠紫外cd譜，譜，能反映出蛋白質(zhì)或多肽鏈能反映出蛋白質(zhì)或多肽鏈二級結(jié)構的信息，從而揭二級結(jié)構的信息，從而揭示蛋白質(zhì)或多肽的二級結(jié)構。示蛋白質(zhì)或多肽的二級結(jié)構。2021-10-3035南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院2. 二級結(jié)構的測定 傅立葉紅外光譜法傅立葉紅外光譜法 原理：紅外光譜的形成是以分子的振動為基礎，在生物原理：紅外光譜的形成是以分子的振動為基礎，在生物大分子中，這些振動（化學鍵的伸縮、扭曲、旋轉(zhuǎn)等）大分子中，這些振動（化學鍵的伸縮、扭曲

16、、旋轉(zhuǎn)等）能定位到分子中特殊的鍵和基團，有關的鍵和基團能定位到分子中特殊的鍵和基團，有關的鍵和基團主要包括主要包括c=o，-cooh，coo-，o-h，s-h等。故可等。故可以通過紅外光譜推知蛋白質(zhì)以通過紅外光譜推知蛋白質(zhì)的相關結(jié)構信息。的相關結(jié)構信息。2021-10-3036南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院蛋白質(zhì)的各種二蛋白質(zhì)的各種二級結(jié)構在紅外光級結(jié)構在紅外光譜酰胺譜酰胺i i區(qū)的特區(qū)的特征吸收。征吸收。 3. 三級結(jié)構的測定 x射線衍射法射線衍射法 原理：當一束原理：當一束x射線照射到晶體上，首先被電子所散射，每射線照射到晶體上，首先被電子所散射，每個電子都是一個新的輻射波源，向空間輻射出與入

17、射波同個電子都是一個新的輻射波源，向空間輻射出與入射波同頻率的電磁波。由于這些散射波之間的干涉作用，使得空頻率的電磁波。由于這些散射波之間的干涉作用，使得空間某些方向上的波始終保持相互疊加，于是在這個方向上間某些方向上的波始終保持相互疊加，于是在這個方向上可以觀測到衍射線，而另一些方向上的波則始終互相抵消，可以觀測到衍射線，而另一些方向上的波則始終互相抵消，于是就沒有衍射線產(chǎn)生。于是就沒有衍射線產(chǎn)生。x射線在晶體中的衍射現(xiàn)現(xiàn)，實質(zhì)射線在晶體中的衍射現(xiàn)現(xiàn)，實質(zhì)上是大量的原子散射波互相干涉的結(jié)果。上是大量的原子散射波互相干涉的結(jié)果。 晶體所產(chǎn)生的衍射花樣都反映出晶體內(nèi)部的原子分布規(guī)律。晶體所產(chǎn)生的

18、衍射花樣都反映出晶體內(nèi)部的原子分布規(guī)律。一個衍射花樣的特征，可以認為由兩個方面的內(nèi)容組成：一個衍射花樣的特征，可以認為由兩個方面的內(nèi)容組成： 衍射線在空間的分布規(guī)律，稱之為衍射幾何，衍射線的分布規(guī)律是晶胞的大小、形狀和位向決定。 衍射線束的強度，衍射線的強度則取決于原子的品種和它們在晶胞中的位置。2021-10-3037南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院三級結(jié)構的測定 三維電鏡重構技術三維電鏡重構技術 原理：在電鏡下觀察生物大分子時，觀察的對現(xiàn)是三維結(jié)原理：在電鏡下觀察生物大分子時，觀察的對現(xiàn)是三維結(jié)構，電鏡圖像是這些三維結(jié)構的二維投影。由生物結(jié)構的構，電鏡圖像是這些三維結(jié)構的二維投影。由生物結(jié)構的二

19、維電鏡圖像推知其三維結(jié)構的方法稱為三維電鏡方法。二維電鏡圖像推知其三維結(jié)構的方法稱為三維電鏡方法。 優(yōu)點：可以直接獲得分子的形貌信息；適于解析那些難以優(yōu)點：可以直接獲得分子的形貌信息；適于解析那些難以結(jié)晶的膜蛋白，大分子復合體等；適于捕捉動態(tài)結(jié)構變化結(jié)晶的膜蛋白，大分子復合體等；適于捕捉動態(tài)結(jié)構變化信息；易同其他技術相結(jié)合得到分子復合體的高分辨率的信息；易同其他技術相結(jié)合得到分子復合體的高分辨率的結(jié)構信息；電鏡圖像中包含相位信息，所以在相位確定上結(jié)構信息；電鏡圖像中包含相位信息，所以在相位確定上要比要比x射線晶體學直接和方便。射線晶體學直接和方便。 不足：由于生物樣品易受輻照損傷、圖像襯度低、

20、信噪比不足：由于生物樣品易受輻照損傷、圖像襯度低、信噪比低的特點，它對生物大分子的高分辨率結(jié)構解析非常困難。低的特點，它對生物大分子的高分辨率結(jié)構解析非常困難。2021-10-3038南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院三、蛋白質(zhì)二級結(jié)構預測蛋白質(zhì)二級結(jié)構預測1、二級結(jié)構預測概述、二級結(jié)構預測概述 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構預測的基本依據(jù)是：蛋白質(zhì)的二級結(jié)構預測的基本依據(jù)是：每一段相鄰的氨基酸殘基具有形成一定二級結(jié)每一段相鄰的氨基酸殘基具有形成一定二級結(jié)構的傾向。構的傾向。 二級結(jié)構預測問題是模式分類問題二級結(jié)構預測問題是模式分類問題 二級結(jié)構預測的目標：二級結(jié)構預測的目標： 判斷每一段中心的殘基是否處于判斷每一

21、段中心的殘基是否處于 螺旋、螺旋、 折疊、轉(zhuǎn)折疊、轉(zhuǎn)角（或其它狀態(tài)）之一的二級結(jié)構態(tài)，即三態(tài)。角（或其它狀態(tài)）之一的二級結(jié)構態(tài)，即三態(tài)。 基本策略（1）相似序列相似結(jié)構qlmgerirarrkklkqlmgaerirarrkklk結(jié)構？結(jié)構？基本策略（2）分類分析螺旋提取樣本提取樣本聚類分析聚類分析學習分類規(guī)則學習分類規(guī)則預測預測.-gly-ala-glu-phe-. 二級結(jié)構預測的方法大體分為三代： 第一代是基于單個氨基酸殘基統(tǒng)計分析 從有限的數(shù)據(jù)集中提取各種殘基形成特定二級結(jié)構的傾向，以此作為二級結(jié)構預測的依據(jù)。 第二代預測方法是基于氨基酸片段的統(tǒng)計分析 統(tǒng)計的對現(xiàn)是氨基酸片段 片段的長度

22、通常為11-21 片段體現(xiàn)了中心殘基所處的環(huán)境 在預測中心殘基的二級結(jié)構時，以殘基在特定環(huán)境形成特定二級結(jié)構的傾向作為預測依據(jù) 這些算法可以歸為幾類： （1）基于統(tǒng)計信息 （2）基于物理化學性質(zhì) （3）基于序列模式 （4）基于多層神經(jīng)網(wǎng)絡 （5）基于多元統(tǒng)計 （6）基于機器學習的專家規(guī)則 （7）最鄰近算法 第一代和第二代預測方法對三態(tài)預測的準確第一代和第二代預測方法對三態(tài)預測的準確率都小于率都小于70%，而對，而對 折疊預測的準確率僅為折疊預測的準確率僅為28 48% 其主要原因是只利用局部信息其主要原因是只利用局部信息 第三代方法（考慮多條序列）第三代方法（考慮多條序列） 運用長程信息和蛋白

23、質(zhì)序列的進化信息運用長程信息和蛋白質(zhì)序列的進化信息 準確度有了比較大的提高準確度有了比較大的提高2、蛋白質(zhì)二級結(jié)構預測方法、蛋白質(zhì)二級結(jié)構預測方法(1) 經(jīng)驗參數(shù)法經(jīng)驗參數(shù)法蛋白質(zhì)二級結(jié)構的組成規(guī)律性比較強蛋白質(zhì)二級結(jié)構的組成規(guī)律性比較強三種基本二級結(jié)構平均占氨基酸殘基的三種基本二級結(jié)構平均占氨基酸殘基的85%各種二級結(jié)構非均勻地分布在蛋白質(zhì)中各種二級結(jié)構非均勻地分布在蛋白質(zhì)中螺旋的形成規(guī)律：螺旋的形成規(guī)律：在一段序列中發(fā)現(xiàn)第在一段序列中發(fā)現(xiàn)第i、i+3、i+4位（如位（如1、4、5）是疏水殘基時，這一片段就被預）是疏水殘基時，這一片段就被預測為測為螺旋；螺旋；當發(fā)現(xiàn)第當發(fā)現(xiàn)第i、i+1、i+

24、4位（如位（如7，8，11）為疏水殘基時，這一片段中被預測為為疏水殘基時，這一片段中被預測為螺螺旋。旋。對于對于折疊的形成規(guī)律：折疊的形成規(guī)律：對于對于折疊，中存在著一些特征的親疏水折疊，中存在著一些特征的親疏水殘基間隔模式，埋藏的殘基間隔模式，埋藏的折疊通常由連續(xù)折疊通常由連續(xù)的疏水殘基組成，一側(cè)暴露的的疏水殘基組成，一側(cè)暴露的折疊則通折疊則通常具有親水常具有親水-疏水的兩殘基重復模式。疏水的兩殘基重復模式。原則上，通過在序列中搜尋特殊的親疏水原則上，通過在序列中搜尋特殊的親疏水殘基間隔模式，就可以預測殘基間隔模式，就可以預測螺旋和螺旋和折疊。折疊。點模式方法：點模式方法：將將20種氨基酸殘基分為親水、疏水以及兩性殘種氨基酸殘基分為親水、疏水以及兩性殘基三類基三類用八殘基片段表征親疏水間隔模式用八殘基片段表征親疏水間隔模式以一個二進制位代表一個殘基，疏水為以一個二進制位代表一個殘基，疏水為1，親，親水為水為0，共八位。，共八位。這樣，八殘基片段的親疏水模式可用這樣，八殘基片段的親疏水模式可用0 255的