梗阻性黃疸大鼠肝臟損害及血清毒性物質(zhì)變化

1、梗阻性黃疸大鼠肝臟損害及血清毒性物質(zhì)變化 作者：韓德蘭 苑建斌 王永清 閆秀玲【摘要】 目的:探討梗阻性黃疸(梗黃)大鼠肝臟損害及其血清毒性物質(zhì)的變化。方法:采用膽總管結(jié)扎方法建立梗阻性黃疸大鼠模型，將36只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(sham)組6只、梗阻性黃疸(CBDL)組30只(CBDL組又分為1周、2周、3周、4周、5周亞組,每組6只)。監(jiān)測各組血液TNF、內(nèi)毒素、肝功能變化。結(jié)果：CBDL組均可見肝細(xì)胞壞死及增生，匯管區(qū)可見膽管擴(kuò)張、膽汁淤積，肝組織改變隨梗阻時(shí)間的延長而逐漸加重，血清內(nèi)毒素及TNF含量與梗阻時(shí)間明顯相關(guān)。結(jié)論：CBDL大鼠肝臟形態(tài)改變明顯，血ALT、TBIL、內(nèi)毒素、TNF

2、含量明顯升高，并與梗黃時(shí)間有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 大鼠;黃疸/阻塞性;肝臟;腫瘤壞死因子【ABSTRACT】 Objective:To study the liver damage and toxicity index variation in serum for obstructive jaundice rats.Methods:Choledoch ligation method was used to establish obstruction jaundice rat model,while 36 models were divided into sham group with 6 mice

3、，and CBDL group 30，30 models in CBDL group were subdivided into.1week、2week、3week、4week、5week，per 6 groups.The blood TNF，endotoxin，liver function were detected.Results:For the rats in CBDL group,liver shape changed obviously,and blood ALT，TBIL，the endotoxin，TNF contents increased evidently,concernin

4、g with time of OJ.Conclusion:Microscope examination showed that liver cell necrosis was heavy in rats of CBDL group，bile was filled up in bile duck in rats of both group，and the liver organization was damaged along with the obstruction time extension，but was aggravated gradually.The blood endotoxin

5、and TNF content were obviously related with obstruction time.【KEY WORDS】 Rats,Jaundice/Obstructive,Liver,Tumor necrosis factor梗阻性黃疸(obstructive jaundice，OJ)是多種肝膽疾病的共同病理過程，具有死亡率高、并發(fā)癥多的臨床特點(diǎn)，目前普遍認(rèn)為與內(nèi)毒素(ETX)有關(guān)12。而腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)在內(nèi)毒素血癥(endotoxemia,ETM)中起關(guān)鍵作用 1。本研究通過觀察OJ大鼠模型2周肝臟形態(tài)學(xué)改變、不同時(shí)

6、間肝功能指標(biāo)及內(nèi)毒素、TNF濃度變化，以期發(fā)現(xiàn)其變化規(guī)律，為臨床研究和治療提供可靠依據(jù)。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 按照GB1492294實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物和寄生蟲檢測等級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)，選用同一實(shí)驗(yàn)室清潔級(jí)成年健康雄性SpragueDawley大鼠36只，體重(250±25)g。由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證編號(hào)：807145)。1.2 主要儀器、制劑 德國Bayer公司3600020自動(dòng)生化分析儀;日本Olympus公司CHK2FGS顯微鏡;日本Hitach公司80P7超速低溫離心機(jī);德國Walldorf公司HM315組織切片機(jī);北京普爾偉業(yè)生物科技公司TNF放免試劑盒;北京安度

7、斯生物技術(shù)公司的鱟試劑盒等。1.3 方法1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立 對大鼠采用膽總管結(jié)扎的方法建立梗阻性黃疸大鼠模型(CBDL組)3。具體操作方法如下：采用10%水合氯醛按 3mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。在無菌條件下行腹腔正中線切口，切口長約2cm，至劍突下，暴露十二指腸上段膽總管，近肝門處分離肝門靜脈與膽總管，剝離膽總管周圍組織。用3/0號(hào)絲線雙重結(jié)扎膽總管，與兩道結(jié)扎線之間切斷膽總管，分層關(guān)腹。假手術(shù)組(sham 組)動(dòng)物游離膽總管步驟與前相同，但只置線不結(jié)扎。整個(gè)操作均在無菌條件下進(jìn)行，然后飼以正常飲水及復(fù)合飼料喂養(yǎng)。模型建立組分別于結(jié)扎后1、2、3、4、5周麻醉動(dòng)物取材(每個(gè)取材時(shí)

8、間點(diǎn)6只)，假手術(shù)組6只與5周模型組同批麻醉取材。1.3.2 取材 以10%水合氯醛(3mL/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，切開皮膚暴露腹腔，心臟取血，留取血液。血標(biāo)本靜置1h后，以3 000r/min低溫離心15min，取血清-20凍存，用于TNF、ETX、肝功能檢測。留取肝組織，采用HE染色確定模型建立情況，Masson三色染色觀察肝硬化形成情況，石蠟包埋的肝組織以4m的厚度連續(xù)切片，按以下步驟進(jìn)行Masson三色染色：二甲苯脫蠟梯度酒精至水-0.5%蘇木素7min1%鹽酸酒精分化4s酸性麗春紅品紅15min1%磷鉬酸10s2%苯胺藍(lán)2min0.2%冰醋酸1min梯度酒精至水二甲苯透明中性樹膠

9、封片。1.3.3 血清肝功能檢測 從-20冰箱中取出血清樣本，于37水浴箱中水浴10min，采用全自動(dòng)血清生化分析儀，由生化室協(xié)助測定血清總膽紅素(TBIL)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)值。1.3.4 血清TNF的測定 取血清樣本嚴(yán)格按照大鼠放射免疫試劑盒說明書要求檢測細(xì)胞因子TNF水平。1.3.5 ETX測定 在一定條件下，極微量的ETX能把終點(diǎn)法鱟試劑(TAL)中的凝固酶原激活為凝固酶，凝固酶能迅速催化人工合成的顯色底物分裂出顯色基團(tuán)pNA(對硝基苯胺)，游離的pNA在溶液中呈黃色，可用分光光度計(jì)在405410mm處測定溶液的吸光度值A(chǔ)。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS12.0軟件包，數(shù)據(jù)

10、均用均數(shù)±準(zhǔn)差(x±s)表示，進(jìn)行方差檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性。2 結(jié)果2.1 活體觀察動(dòng)物模型均成功建立。sham 組大鼠活動(dòng)靈敏，毛發(fā)光滑，大便黑硬，小便淡黃。CBDL組動(dòng)物于手術(shù)1周可見耳部等皮膚較薄的部位黃染，尿色轉(zhuǎn)為深黃，之后出現(xiàn)食欲不振，精神萎靡，毛發(fā)蓬松，黃染，大便蒼白，小便黃，5周末時(shí)動(dòng)物體形消瘦、腹部膨隆、步態(tài)不穩(wěn)。2.2 大鼠肝組織病理變化HE、Masson三色染色顯示，sham組：HE染色肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝板排列整齊(圖1);Masson三色染色僅在門管區(qū)可見少量結(jié)締組織(圖2)。CBDL組：造模2周門管區(qū)小膽管廣泛增生，膽管擴(kuò)張

11、，其上皮呈低柱狀或立方形，增生的小膽管周圍有纖維組織增生，門管區(qū)所占面積擴(kuò)大，肝小葉內(nèi)也有纖維組織增生(圖3、4)。圖1 假手術(shù)組(HE×100)圖2 假手術(shù)組(Masson×400)圖3 模型建立組(HE×100)圖4 模型建立組(Masson×400)2.3 血清各指標(biāo)檢測結(jié)果2.3.1 肝功能變化 血清ALT在CBDL術(shù)后造模組1周即明顯增加，與Sham組比較有明顯差異(P<0.05)，之后逐漸下降，但均明顯高于Sham組。血清TBIL趨勢與ALT相同。2.3.2 ETX及TNF變化 ETX檢測結(jié)果：CBDL術(shù)后造模組1周血漿內(nèi)毒素水

12、平即明顯升高，與Sham組比較差異有顯著性(P<0.05)。3周時(shí)有所下降，但仍顯著高于Sham組。5周時(shí)又回升至術(shù)后1周水平;TNF檢測結(jié)果：CBDL術(shù)后造模組1周血清TNF水平即明顯升高，與Sham組比較差異有顯著性(P<0.05)，之后呈上升趨勢，3周時(shí)血清TNF水平達(dá)高峰，4周時(shí)有所回落，5周有所回升，但均明顯高于Sham組(見表1、表2)。表1 兩組TBIL和ALT水平變化注：與Sham組相比*P<0.05表2 兩組ETX、TNF水平變化注：與Sham組相比*P<0.053 討論梗阻性黃疸是一種常見病，其術(shù)后并發(fā)癥和死亡率較高，

13、其主要原因是內(nèi)毒素血癥和多臟器損害2。ETX對OJ大鼠肝臟有強(qiáng)烈的損傷作用，而它的病理生理作用主要由TNF所介導(dǎo)4。TNF是一種細(xì)胞因子，是由單核巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞等產(chǎn)生，適量時(shí)可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，分泌過多時(shí)，則參與機(jī)體的多種病理生理改變，甚至造成多器官損傷2。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CBDL組血漿ETX、TNF水平先升高，之后下降，后又回升趨勢，可能是由于血液中梗阻性黃疸初期腸道內(nèi)膽鹽的減少、細(xì)菌的異常繁殖及腸道黏膜的缺血缺氧可造成腸源性ETX大量進(jìn)入血液，ETX刺激枯否細(xì)胞產(chǎn)生的TNF也增多并逐漸達(dá)到高峰，但隨著梗阻時(shí)間的延長，腸道黏膜的免疫屏障功能保護(hù)性增強(qiáng)，進(jìn)入血液的ETX量減少，且腎

14、臟在 NO 作用下排除一定量的ETX，之后由于腸系膜血流增加，門脈壓升高，進(jìn)入肝臟的血流增加，ETX增加，從而產(chǎn)生的TNF也隨之增加5。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明，血清TNF值與Sham組比較差異有顯著性。與姜憲等6的研究結(jié)果一致。ETX和TNF隨時(shí)間改變的同時(shí)肝臟損害亦隨梗阻時(shí)間的延長而逐漸加重，這與楊光等的血清TNF參與了梗阻性黃疸時(shí)肝的損害，并與肝功能的損害程度正相關(guān)4結(jié)論相似。本研究探討了梗阻性黃疸大鼠肝損害與ETX、TNF等隨時(shí)間改變的規(guī)律，期望為梗阻性黃疸肝損害的臨床研究和治療提供一定的理論基礎(chǔ)。【參考文獻(xiàn)】 1 Cagl IK,Besirov E,Ozkan H，et al.The effe

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