細胞增殖、凋亡、粘附的測定方法

1、細胞增殖的檢測方法：四甲基偶氮唑鹽法(MTT)MTT 商品名為噻唑藍， 是一種黃色的染料。1983 年Mosmann 建立MTT比色法，用于檢測細胞存活和增殖。其原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT 還原為不溶于水的藍紫色結晶-甲瓚(formazan)并沉積在細胞中，而死亡的細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫分析儀測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)量范圍內(nèi)，MTT結晶形成的量與細胞數(shù)成正比。此方法已廣泛用于各種細胞增殖的檢測、腫瘤細胞的生長、生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定4-8等。

2、此方法簡便、靈敏且無放射性。MTT 溶液需要放置在4避光保存，最好是現(xiàn)用現(xiàn)配。由于MTT 經(jīng)還原所產(chǎn)生的產(chǎn)物甲瓚不溶于水，無法直接測定吸光度，需要被溶解之后才能檢測。這不僅使工作量增加，而且MTT 溶液具有致癌性。需要注意的是，MTT 法只能用來檢測細胞相對數(shù)和相對活力， 但不能測定細胞的絕對數(shù)。另外， 有研究發(fā)現(xiàn)過氧化物會降低MTT 測定的準確度，抑制將近95%的MTT 與O2的反應，MTT 溶解產(chǎn)物甲瓚會吸附在納米纖維上， 而致使檢測的結果呈現(xiàn)假陰性。內(nèi)鹽法(MTS) MTS 是一種新型的MTT 類似物。MTS 在偶聯(lián)劑PMS 存在的條件下， 可被活細胞線粒體中的多種脫氫酶還原成水溶性的有

3、色甲瓚產(chǎn)物， 其顏色深淺與活細胞數(shù)量在一定范圍內(nèi)呈高度相關，可用酶標儀檢測。它的優(yōu)點在于無放射性、快速、安全、方便、靈活及特異性強，同時又克服了MTT、XTT 的缺點。此方法已應用于細胞增殖的檢測、藥物敏感性試驗、細胞毒性的檢測等，且比MTT法更加準確。此方法在一定程度上也存在缺陷。最新研究表明在96 孔板試驗中， 靠外的孔液體易蒸發(fā)，對檢測結果有一定影響24，且不適合于豬淋巴細胞促有絲分裂反應的檢測.細胞粘附能力測定：蛋白染料染色法測細胞粘附本法是以蛋白染色劑如氨基黑10B來問接測定96孔板中的細胞數(shù)目，該法迅速可靠，還可用怍細胞形態(tài)學觀察和染色細胞的照像。Schulz 等對入角化細胞株Ha

4、CaT 受其亞克隆細胞株、鼠成纖維細胞林3T，骨髓瘤細胞株x63一Ag8653作過這方面的研究。即用甲醛或戊二醛固定粘附細胞，吹打去除未牯附的細胞 而粘附的細胞用pH3，5的氨基黑染色，先用pH355的鹽酸洗去附著的染料，結合的蛋白染料可用NaOH 溶解，然后在酶標儀上讀取620rim405或750rim處的OD值。若用該法反映未牯附和半粘附的細胞數(shù)量，可在染色前先離心t然后固定。該法測量表明，氨基黑的染色吸光度值與細胞數(shù)、DNA含量呈良好的線性關系，直線的回歸斜率對不同的細胞而有所不同。另外、該法可用來測定某些藥物的細胞毒作用、LAK細胞的殺傷作用以及雜交瘤抗體對細胞擴增的生物效應。E rt

5、t 曾用氟基黑染色法來問接反映24孔板上培養(yǎng)的細胞數(shù)，但其操作過程比較繁瑣，如細胞固定，染色細胞蛋白質沉淀，多次溫育、沖洗、離心、溶解變性強白，最后轉移至比色杯中進行常規(guī)比色。而本法只需在96孔板上即可進行。實驗結果重復性好，敏感性高，時間短，試劑便宜。但在測定某種細胞的粘附性時，必須先建立其細胞數(shù)與光密度值之問的回歸曲線。因為某一特定細胞的直線回歸斜率與該種細胞的太小及其蛋白質的含量有關。氨基黑染色法不能區(qū)分死亡細胞與活的細胞，但是粘附生長的細胞一旦死亡。即可自行脫離吸附的介質，被吸出洗去。因此，需要用 cr標記和其他物質拆記靶細胞測定粘附的試驗太多可用該法代替。值得注意的是，死亡后仍能附著

6、的細胞不能用氨基黑染色法測定粘附性 這時可以選用中性紅、MTT以及其他臺適的染色方法。Joni 曾用氨基黑染色法測定細胞弱粘附特性-即最小切應力粘附測定(MinimaSheariorce adhesion assay，MSFA)，其步驟與常規(guī)的粘附測定方法基本一致。不同之處是去除未粘附細胞時，在液體中用輕柔的切應力去除未粘附的細胞，這樣強粘附與弱粘附的細胞可同時被測定。MSFA法去除非粘附細胞的操作方法如下：將孵育后臺粘附細胞的96孔板扳孔朝上以一定角度浸入盛有0，85 Nacl鹽液的容器中(容器中含液量約為2.5 升)然后在液體中輕輕反轉培養(yǎng)板避免板孔中形成氣泡，使板孔向下板底向上，這時可使

7、培養(yǎng)板從液體中升至液面，容器中的鹽液用40ram 長的轉子以300rPm 的轉速室溫下攪動7分鐘這樣板孔中未桔附的細胞可技去際 96孔板從NaC鹽液容器中取出時，要重新翻轉板孔向上，然后浸入含100 甲醇的容器中，在甲醇溶液中上下左右轉動96孔板使鹽波和甲醇充分混臺切勿使細胞暴露于空氣中，每過5分鐘重復以上動作，60分鐘后從甲醇液體中取出96孔板一去掉甲醇，染色細胞，酶標儀上讀取570nm OD值一牯附率的計算用以下公式： OD570粘附細胞 粘附率×100 OD570孔中加入的總細胞用該法測得的牯附率高于常規(guī)方法的25-3倍，而基礎的非特異性粘附率不變。結晶紫染色：他是細胞核染色常

8、用的，用來顯示染色體的中心體，并可染淀粉、纖維蛋白、神經(jīng)膠質等。凡是用番紅和蘇木精或其他染料染細胞核不能成功時，用它能得到良好的結果。用番紅和結晶紫作染色體的二重染色，染色體染成紅色，紡錘絲染成紫色，所以也是一種顯示細胞分裂的優(yōu)良染色劑。用結晶紫染纖毛，效果也很好。用結晶紫染色的切片，缺點是不易長久保存。蘇木精是淡黃色到銹紫色的結晶體，易溶于酒精，微溶于水和甘油，易溶于熱水和熱乙醇，溶于堿、氨和硼砂的溶液。它是染細胞核的優(yōu)良材料，他能把細胞中不同的結構分化出各種不同的顏色。分化時組織所染的顏色因處理的情況而異，用酸性溶液（如鹽酸酒精）分化后呈紅色，水洗后仍恢復青藍色，用堿性溶液（如氨水）分化后

9、呈藍色，水洗后呈藍黑色。遇光變紅。Giemsa染色法：嗜酸性顆粒為堿性蛋白質，與酸性染料伊紅結果，染粉紅色，稱為嗜酸性物質；細胞核蛋白和淋巴細胞 胞漿為酸性，與堿性染料美藍或天青結合，染紫藍色，稱為嗜堿性物質；中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍均可結合，染淡紫色，稱為中性物質。 m#UOkrO PH對細胞染色有影響。細胞各種成分均為蛋白質，由于蛋白質系兩性電解質，所帶電荷隨溶液PH而定，在偏酸性環(huán)境中下正電荷增多，易與伊紅結合，染色偏紅；在偏堿性環(huán)境中負電荷增多，易與美藍或天青結合，染色 偏藍。因此細胞染色對氫離子濃度十分敏感，染色用正經(jīng)片必須清潔，無酸堿污染。配制瑞特液必須用優(yōu)質甲醇，稀釋染色必

10、須用緩沖液，沖洗用水應近中性，否則可導致各種細胞染色反應異常，以致識別困難，甚至造成錯誤。MTT(l)接種細胞:用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細胞,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制成單個細胞懸液,以每孔103一104個細胞接種于%孔板中(本實驗所接種的細胞數(shù)是每孔2x103個細胞),每孔體積200ul,各組每個時相6孔,測量時取6孔OD平均值。同時設不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照孔。(2)培養(yǎng)細胞:將培養(yǎng)板放入COZ孵箱,在37、5%COZ及飽和濕度條件下培養(yǎng)(培養(yǎng)時間取決于實驗目的和要求)。(3)呈色:分別于1天、2天、3天、4天和5天,在待測孔中每孔加入MTT溶液(smg/ml)20

11、ul,37繼續(xù)孵育4一6h,終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液,每孔加入150ulDMSO,振蕩10min,使其充分溶解。(4)比色:選擇490nm波長,在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值(OD值),一記錄結果。(5)以培養(yǎng)時間為橫軸,光吸收值為縱軸繪制細胞生長曲線。2.1細胞培養(yǎng)2.1.1細胞的復蘇(l)細胞培養(yǎng)室的常規(guī)消毒(2)無菌操作配置好IOml完全細胞培養(yǎng)液并放入37恒溫水浴箱中預溫至37并轉入無菌細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)備用。(3)從液氮中待復蘇的細胞,立即放入37很穩(wěn)水浴箱中輕輕來回旋轉,確保細胞凍存液在1分值之內(nèi)解凍。(4)待細胞解凍,立即用滴管吸取解凍的細胞懸液放入裝有預溫的完全細胞培養(yǎng)液

12、的細胞培養(yǎng)瓶內(nèi),置37、5%C02恒溫恒濕細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),次日換液。2.1.2培養(yǎng)細胞換液(l)細胞培養(yǎng)室的常規(guī)消毒。(2)按常規(guī)操作配制好完全細胞培養(yǎng)液并放入37恒溫水浴箱中預溫備用。(3)從細胞培養(yǎng)箱中取出前一日復蘇的裝有細胞的細胞培養(yǎng)瓶,置倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。(4)在無菌操作臺內(nèi)用直頭吸管輕輕吸出舊的培養(yǎng)液至廢液缸,棄吸管。(5)取新吸管,加入無血清的不完全培養(yǎng)液,輕輕轉動培養(yǎng)瓶,把殘存的舊培養(yǎng)液沖掉。(6)棄去無血清的不完全培養(yǎng)液,加入事先已預溫的完全細胞培養(yǎng)液。(7)蓋好培養(yǎng)瓶的瓶蓋(稍松),置37、5%C02恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。(8)清走所有吸管、玻璃用品等,擦拭工作臺

13、。2.1.3細胞的凍存(l)細胞培養(yǎng)室的常規(guī)消毒。(2)按常規(guī)操作無菌配制好1.Oml細胞凍存液。(3)從細胞培養(yǎng)箱中取出裝有細胞的細胞培養(yǎng)瓶,擰緊瓶蓋,置倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。當細胞處于對數(shù)生長期時(長滿細胞培養(yǎng)瓶底部70一80%面積時),此時即可凍存。(4)凍存細胞24小時前給細胞換液。(5)用胰酶消化收集細胞,重懸在含有完全培養(yǎng)基中,1000印n訂min離心5分全中。(6)去除胰酶及舊的培養(yǎng)液,留細胞沉渣。加入預先配制好的細胞凍存液(含無血清的不完全培養(yǎng)液7份,純血清2份,DMS01份)。(7)用吸管輕輕吹打使細胞均勻,分裝入無菌凍存管中,每只凍存管內(nèi)加液lml。旋緊凍存管瓶蓋,

14、做好標記,用封口膜封住凍存管瓶身及瓶蓋。(8)將裝有細胞的凍存管依次460分鐘一一2060分鐘一一80過夜一液氮內(nèi)長期凍存。2.1.4細胞的傳代(1)吸除或倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。(2)用無血清的培養(yǎng)液洗細胞1次。(3)向瓶內(nèi)加入lml胰蛋白酶消化液,輕輕搖動培養(yǎng)瓶,使消化液流遍所有細胞表面,然后吸掉或倒掉消化液后再加lml新的消化液,輕輕搖動后再倒掉大部分消化液,僅留少許進行消化?；蛘卟徊捎蒙鲜霾襟E,直接加1一Zml消化液進行消化,但要注意盡量減少消化液的剩余量。(4)在37或室溫25以上環(huán)境進行消化,消化2一5分鐘后把培養(yǎng)瓶放置于倒置顯微鏡下進行觀察,發(fā)現(xiàn)細胞胞質回縮、細胞間隙增大后,應立即

15、終止消化。(5)小心倒掉殘余消化液(不含EDTA)或直接加入含血清的培養(yǎng)液,終止消化。(6)用彎頭吸管,吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液,反復吹打瓶壁細胞,吹打過程要順序進行,從培養(yǎng)瓶底部一邊開始到另一邊結束,以確保所有底部都被吹到。吹打時動作要輕柔,不要用力過猛,同時盡可能不要出現(xiàn)泡沫,以免對細胞有損傷。細胞脫離瓶壁后形成細胞懸液。流式細胞儀檢測細胞凋亡基本原理其原理主要是根據(jù)細胞凋亡時在細胞、亞細胞和分子水平上所發(fā)生的特征性改變些改變包括細胞核的改變、細胞器的改變、細胞膜成分的改變和細胞形態(tài)的改變等，其中細胞核的改變最具特征性，主要包括以下幾方面：1. 細胞核的改變：由于凋亡細胞核的改變，造成各染色體熒光染

16、料對凋亡細胞DNA可染性發(fā)生改變。研究表明，用各種染色體熒光染料對經(jīng)固定的凋亡細胞進行染色，其DNA可染性降低。許學者把這種DNA可染性的降低認是凋亡細胞的標志之。2. 光散射特性：凋亡細胞形態(tài)上的改變影響它們的光散射特性。在流式細胞儀上，散射光與細胞的小有關，而側散射光反映的是光在細胞內(nèi)的折射作用，與細胞內(nèi)的顆粒多少有關。在細胞凋亡時，細胞固縮，體積變小，故前散射光降低，這一特性往往被認為是凋亡細胞的特點之一。此外細胞凋亡時由于染色體降解，核破裂形成，細胞內(nèi)顆粒往往增多，故凋亡細胞側散射光常增加。細胞壞死時，由于細胞腫脹，其前散射光增大；側散射光在細胞壞死時也增大，因此可根據(jù)前散射光和側散射

17、光區(qū)別凋亡細胞和壞死細胞。但需要注意的是，根據(jù)前散射光和側散射光判斷凋亡細胞的可靠性受被檢測細胞形態(tài)上的均一性和核胞漿比率影響很大。因此在某些淋巴細胞凋亡中，用光散射特性檢測凋亡的可靠性較好，而在腫瘤細胞凋亡中，其可靠性就較差。根據(jù)光散射特性檢測凋亡細胞最主要的優(yōu)點是可以將光散射特性與細胞的表面免疫熒光分析結合起來，用以區(qū)別經(jīng)這些特殊處理發(fā)生選擇性凋亡的淋巴細胞亞型。也可用于活細胞的分類。試劑與儀器l PBS溶液；l PI染液：將PI溶于PBS（pH7.4）中，終濃度為100ug/ml。用棕色瓶4避光保存。l 70%乙醇l 400目篩網(wǎng)l 流式細胞儀實驗步驟1. 收集細胞目約（1 5）

18、5;106個/mL，500 1000 r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液。2. 3mlPBS洗滌1次。3. 離心去PBS，加入冰預冷的70%的乙醇固定，4，12小時。4. 離心棄去固定液，3mlPBS重懸5min。5. 400目的篩網(wǎng)過濾1次，5001000r/min離心5min，棄去PBS。6. 用1mlPI染液染色，4避光30min。7. 流式細胞儀檢測：PI用氬離子激發(fā)熒光，激光光波波長為488nm，發(fā)射光波波長大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光分析PI熒光強度的直方圖也可分析前散射光對側散射光的散點圖。8. 結果判斷：在前散射光對側散射光的散點圖或地形圖上，凋亡細胞與正常細胞相比，前散射光降

19、低，而側散射光可高可低，與細胞的類型有關；在分析PI熒光的直方圖時，先用門技術排除成雙或聚集的細胞以及發(fā)微弱熒光的細胞碎片，在PI熒光的直方圖上，凋亡細胞在G1/G0期前出現(xiàn)一亞二倍體峰。如以G1/G0期所在位置的熒光強度為1.0，則一個典型的凋亡細胞樣本其亞二倍體峰的熒光強度為0.45，可用雞和鮭魚的紅細胞的PI熒光強度做參照標準，兩者分別為0.35和0.7，可以確保在兩者之間的不是細胞碎片而是完整的細胞。注意事項細胞凋亡時，其DNA可染性降低被認為是凋亡細胞的標志之一，但這種DNA可染性降低也可能是因為DNA含量的降低，或者是因為DNA結構的改變使其與染料結合的能力發(fā)生改變所致。在分析結果時應該注意。流式檢測細胞周期要點： 最關鍵的就是減少細胞碎片和單細胞懸液的制備！1、細胞消化要理想，資料顯示最好消