課題申報書日本血吸蟲（中國大陸株）尾蚴的性別鑒定應用技術研究

1、登記序號 項目編號 科研設計書項目名稱： 日本血吸蟲尾蚴性別鑒定應用技術的研究承擔單位： 單位地址： 郵政編碼： 開 戶 行： 帳 號： 1103021109000077488項目負責人： 電 話： 職務職稱： 填報日期 2004年7月28日江蘇省地方病協(xié)會二四年制一、 立項依據(jù)：血吸蟲是一具有兩性染色體的吸蟲，有8對染色體，其中雌性性染色體為異配子體（zw），雄性為同配子體（zz）。盡管雌性和雄性成蟲階段具有明顯的性別二態(tài)性，可用肉眼區(qū)別，但在幼蟲階段即毛蚴、胞蚴和尾蚴階段，無明顯的性別二態(tài)性，肉眼難以區(qū)別。傳統(tǒng)動物感染方法，是在實驗室內(nèi)取感染了血吸蟲的鼠或其它嚙齒類動物的肝、腸或糞便收集蟲

2、卵，孵化毛蚴，用單只毛蚴感染單只釘螺，養(yǎng)殖篩選陽性釘螺，獲得單性尾蚴，用以感染嚙齒動物，待其發(fā)育至成蟲階段，解剖動物收集成蟲，用肉眼或在解剖顯微鏡下根據(jù)形態(tài)學的差異，確定感染尾蚴性別。然而，單性雌性尾蚴不能發(fā)育到完全成熟的成蟲，給鑒別帶來一定困難。同時常規(guī)方法需要花費時間長，日本血吸蟲從尾蚴感染動物到發(fā)育成熟至少需3周。采用分子生物學的方法，可快速鑒定尾蚴的性別。代表性差異分析（rda）方法是基于遞減雜交法，用于發(fā)現(xiàn)兩dna基因組群間差異，是一種改良的扣除雜交法，并可用于分離基因組間差異性片段。由于血吸蟲為兩性染色體的吸蟲，其雄性為同性配子體（zz），而雌性為異性配子體（zw）。rda方法從宏

3、觀上看，系用雄蟲染色體zz去扣除雌蟲染色體中的z，從而獲得w染色體。drew a.c.等（1995）采用此方法分離出兩段曼氏血吸蟲雌性特異性序列，并將其制備成探針，用southern blot 方法證實只與曼氏血吸蟲雌性基因組dna特異性雜交。w1重復序列作為雌性特異性序列，存在于曼氏血吸蟲波多黎各株生活史的各個階段。并根據(jù)曼氏血吸蟲雌性該特異性序列w1設計出一對引物w1a和w1b。直接加入該引物對單個尾蚴作pcr擴增，瓊脂糖凝膠電泳。結果雌性尾蚴呈現(xiàn)擴增產(chǎn)物pcr-w1條帶，雄性尾蚴不呈現(xiàn)擴增條帶。此方法能快速、可靠地用來鑒定曼氏血吸蟲尾蚴的性別?；诼涎x尾蚴性別鑒定的現(xiàn)有方法，為探索

4、適合日本血吸蟲尾蚴性別鑒定方法提供了理論和方法依據(jù)。利用代表性差異分析（rda）方法，分離出日本血吸蟲雌性特異性序列，將此特異性序列制備成dna探針，用southern blot 方法鑒定日本血吸蟲尾蚴性別。也可對此特異性序列進行測序，設計一對引物，對單個尾蚴的dna作pcr擴增，瓊脂糖凝膠電泳，則雌性尾蚴呈現(xiàn)擴增條帶，雄性則不呈現(xiàn)擴增條帶，從而用pcr方法可快速鑒定日本血吸蟲單個尾蚴的性別。研究日本血吸蟲尾蚴的性別鑒定技術，建立日本血吸蟲尾蚴快速鑒定應用技術有助于血吸蟲幼蟲階段生物學和生理學實驗的研究；對血吸蟲病疫苗評價方法的標準化、遺傳學的研究；及其流行病學、感染診斷和病理學研究結果的正確

5、評價；不同性別尾蚴的易感性和感染比率以及減蟲率（減雌率）和減卵率的正確評估等均具有重要的意義。同時為進一步開發(fā)適合我國國情的日本血吸蟲尾蚴性別鑒定試劑盒打下基礎。二、 主要研究內(nèi)容、關鍵技術、目標：1、 研究內(nèi)容1.1 用代表性差異分析方法獲得日本血吸蟲雌性基因組dna特異性序列。1.2 對特異性序列測序，設計引物，pcr擴增。1.3 實驗室內(nèi)建立一種簡單、快速的日本血吸蟲尾蚴性別鑒定方法。2、 關鍵技術2.1 日本血吸蟲雄蟲、雌蟲基因組dna的提取2.2 代表性差異分析方法（rda）和pcr。2.3 低熔點凝膠回收雌性特異性片段2.4 大腸桿菌e.coli tg1感受態(tài)細胞的制備技術、dna

6、的重組和克隆篩選、重組dna的轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒dna的提取。2.5 dna探針的制備和southern blot 驗證方法2.6 雌性特異性序列測序和引物設計。3、 目標建立一種簡單、快速、靈敏的日本血吸蟲尾蚴性別鑒定方法。三、 研究方法及技術路線1. 用傳統(tǒng)方法確定尾蚴的性別，獲取單性尾蚴樣本1.1 以逸蚴法篩選出陰性釘螺用于感染，所有用于實驗的螺均篩選3次。1.2 以單只毛蚴感染單只釘螺；螺感染后在光照培養(yǎng)箱中養(yǎng)殖90天或在春夏季室溫條件下養(yǎng)殖100天。逸蚴法篩選出陽性釘螺，取單性尾蚴感染小鼠，35天后剖殺，取成蟲確定尾蚴的性別。并分別收集單性尾蚴分別編號保存于-70液氮備用。2. 用代表性差異

7、分析方法分離日本血吸蟲雌性特異性序列2.1 感染家兔4只，每只約用1500-1800條尾蚴。45天后剖殺家兔，收集成蟲，在解剖鏡下將成蟲雌雄分開，分別保存于-70液氮中備用。2.2 取雌蟲、雄蟲各200條用基因組dna提取試劑盒分別提取雌蟲和雄蟲的基因組dna。2.3 用限制性內(nèi)切酶hind對雌蟲、雄蟲dna進行酶切。將酶切產(chǎn)物與兩條適配子（r hind24,5-agcactctccagcctctcaccgca-3和r hind12,5-agcttgcggtga-3）組成的接頭用t4連接酶進行連接。2.4 以連接物為摸板，做pcr擴增；并瓊脂糖凝膠電泳看連接情況。2.5 擴增子的純化 對雌蟲、

8、雄蟲dna的pcr產(chǎn)物用pcr純化試劑盒純化，限制性內(nèi)切酶hind酶切。將酶切后的pcr產(chǎn)物過交聯(lián)葡聚糖g-50柱去除適配子接頭r hind24和r hind12。如此制備的雌蟲dna為檢測子，雄蟲dna為驅(qū)動子。2.6 扣除雜交法及pcr2.6.1 取以上的檢測子1ug連接新的適配子接頭（j hind24 5-accgacgtcgactatccatgaaca-3和j hind12 5-agcttgttcatg-3）；然后取0.5ug帶有新接頭的檢測子與40ug的驅(qū)動子溶于4ul的3×ee緩沖液中，加入1ul的5m的nacl，扣除雜交，67、20小時；并做pcr和瓊脂糖凝膠電泳。2.

9、6.2 將rda的第一輪pcr產(chǎn)物酶切后，過交聯(lián)葡聚糖g-50柱去除適配子接頭j hind24和j hind12，連接下一個新的適配子接頭（n hind24 5-aggcagctgtggtatcgagggaga-3和n hind12 5-agcttctccctc-3），取檢測子0.1ug與40ug驅(qū)動子進行第二輪rda，pcr和瓊脂糖凝膠電泳。2.6.3 同上，酶切后過交聯(lián)葡聚糖g-50柱去除適配子接頭n hind24和n hind12，再連接適配子接頭j hind24和j hind12，取400pg檢測子與40ug驅(qū)動子進行第三輪扣除雜交，pcr和瓊脂糖凝膠電泳。2.7 將獲得的特異性dna

10、片段進行低熔點瓊脂糖凝膠回收，pcr純化試劑盒純化。2.8.1 制備大腸桿菌e.coli tg1感受態(tài)細胞：本實驗以e.coli tg1菌株為受體細胞，用氯化鈣處理是受體菌處于感受狀態(tài)。2.8.2 dna的重組和克隆篩選：將獲得特異性dna片段連接到載體質(zhì)粒puc19制得重組質(zhì)粒；經(jīng)-互補現(xiàn)象篩選（藍白斑篩選）方法對重組質(zhì)粒進行篩選。2.8.3 重組dna的轉(zhuǎn)化：用電擊轉(zhuǎn)化的方法，設定電擊儀參數(shù)（電脈沖25uf、電壓2.5kv、電阻200）；吸取一定量的感受態(tài)細胞和重組質(zhì)粒puc19，加入預冷的電擊杯，放入樣品池，按以上設定參數(shù)啟動對細胞的電脈沖，儀器會顯示4-5ms具有12.5kv/cm的電

11、場強度，脈沖結束后，將細胞取出加入到1mlsoc培養(yǎng)液中復蘇1h，接種于特制平板上，37培養(yǎng)。2.8.4 挑選培養(yǎng)出的單個白色菌落，接種于液體培養(yǎng)；用質(zhì)粒dna提取試劑盒提取質(zhì)粒dna。2.9 southern-blot 方法驗證：利用dig dna labeling anddetection kit制備dna探針和southern-blot驗證。3. 將經(jīng)southern-blot方法驗證出的雌蟲特異性序列進行測序，并設計引物。4. 根據(jù)設計好的引物，對提取的成蟲基因組dna和已知性別的尾蚴dna作pcr，瓊脂糖凝膠電泳來進行證實。5. 根據(jù)設計好的引物，采用直接法（不提取dna）對單個尾蚴

12、作pcr，瓊脂糖凝膠電泳，來確定此尾蚴的性別。6日本血吸蟲尾蚴性別鑒定pcr法操作條件優(yōu)化研究。四、 現(xiàn)有工作條件和基礎：1 工作基礎本實驗室是江蘇省寄生蟲分子生物學重點實驗室，寄生蟲學為江蘇省135重點學科，擁有清潔級小鼠動物房，從事寄生蟲免疫學和分子生物學研究二十余年，在儀器設備上完全具備進行寄生蟲免疫學和分子生物學研究以及動物試驗的的條件。有一定的專業(yè)技術和專業(yè)人員隊伍，人員配置合理。2 儀器設備主要包括溫控設備：4、-20、-70冰箱、thz-95型恒溫振蕩器、scs-24型搖床、光照培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、微波爐等；凈水設備：milliq水純化設備；消毒設備：高壓蒸氣滅菌鍋；計量設備：各

13、種精密度天平、量筒、移液管及各種規(guī)格的可調(diào)試微量移液器、ph計、紫外分光光度計等；離心設備：各種不同規(guī)格的普通、高速冷凍離心機；蛋白核酸分析設備：dy-a瓊脂糖凝膠電泳儀、多功能蛋白電泳儀（bio-rad）、核苷酸序列分析儀（bio-rad）、核酸蛋白測定儀(beckman)、快速蛋白液相層析系（pharmacia）等；其它分子生物學儀器：pcr儀、超聲儀、電穿孔轉(zhuǎn)基因儀、干膠儀、酶標儀、凝膠掃描儀、影像密度掃描儀等。五、 計劃進度：總期限一年：1-3月 采購釘螺，并篩選陰性釘螺。2-4月 購陽性釘螺并感染家兔，剖殺家兔收集成蟲和蟲卵。4-5月 單只毛蚴感染單只釘螺.4-5月 訂購試劑5-11

14、月 分離雌蟲特異性序列，并測序和設計引物，進行尾蚴性別鑒定。11-12月 收集、分析資料和書寫總結報告六、 項目研究預期成果及效益 采用分子生物學技術，建立一種快速、準確、有效的日本血吸蟲尾蚴性別鑒定方法，并為進一步開發(fā)響應的鑒定試劑盒打下基礎；和發(fā)表相應的論文。七、 經(jīng)費預算試劑 萬元試驗動物 萬元試驗耗材費 萬元交通、差旅費用 萬元管理費 萬元總計 萬元八、 主要研究人員單位 姓名 性別 年齡 專業(yè) 職務（稱）項目中的作用九、單位意見、蓋章 年 月 日 十、主管部門意見、蓋章 年 月 日登記序號： 項目編號：中醫(yī)藥、中西醫(yī)結合科研項目課題設計書課題名稱：痛痹顆粒對骨關節(jié)炎細胞凋亡和增殖的機

15、理研究申報單位： 江蘇省中醫(yī)院課題負責人： 朱萱萱計劃年限：郵政編碼： 210029 聯(lián)系電話： 8661714130306申報日期：江蘇省中醫(yī)藥局制填寫提綱一、立項依據(jù)：與選題直接相關的國內(nèi)外現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢；選題的理論和實踐依據(jù)；研究目的、意義；本研究達到的科學技術水平，預期社會經(jīng)濟效益和應用推廣前景。二、科研假說或技術構思，主要研究內(nèi)容、關鍵技術、目標（達到的主要技術指標或技術經(jīng)濟指標），技術特征及創(chuàng)新之處，開發(fā)項目應說明開發(fā)規(guī)模。三、研究試驗方法及技術路線（工藝路線）。四、現(xiàn)有工作條件和基礎：開展本項研究的技術優(yōu)勢，現(xiàn)有的主要儀器設備及應用合格實驗動物的基本條件等；已有工作基礎，預

16、試驗情況。五、計劃進度：根據(jù)總的研究期限、年度計劃進度，分別列出具體的目標和進度的考核指標。六、參加（協(xié)作）單位意見及具體分工（附協(xié)議書）。七、經(jīng)費概算（包括其他部門的撥款、貸款、自籌記憶取得的自主）和核算依據(jù)，以及分年度使用計劃。填寫說明一、內(nèi)容填寫自備附頁，用紙大小和封頁一致，字跡清楚，裝訂整齊后按申報要求上報。二、填寫提綱所列內(nèi)容，要全面詳細、如實填寫。三、封面上“登記序號”“項目編號”請勿填寫。1、 立項依據(jù)1.1 研究目的、意義骨關節(jié)炎（osteoarthritis，oa）又稱退行性關節(jié)病，以關節(jié)軟骨發(fā)生彌漫性龜裂、纖維化和脫失及因骨組織增生性變化為特征的一組臨床征候群，是多見于中年

17、以后的慢性進行性關節(jié)疾患。該病發(fā)病率隨年齡增長而升高，據(jù)調(diào)查，在美國目前2億多人口中，就有骨關節(jié)炎4500萬，發(fā)病率占總?cè)丝诘?0%，在老年人中所占比例更高，50歲以上人群中，oa的患病率僅次于心血管疾病，位居第二位。在我國，根據(jù)流行病學調(diào)查顯示，5564歲的人群中發(fā)病率達40%，而65歲以上人群的患病率達60%90%。隨著計劃生育政策的長久實施及經(jīng)濟發(fā)展，我國已進入老齡化社會，oa的發(fā)病率還將越來越高，這不僅嚴重危害人民的生活、健康，對社會也將造成很大負擔。同時世界其他國家也面臨著同樣的問題，因而oa引起了國際、國內(nèi)醫(yī)學界的相當重視。近年來對oa的研究頗多，在發(fā)病機制、檢測手段以及治療方法上

18、均取得較大進步，但總的來說還缺乏令人滿意的突破性進展。西藥治療oa的主要手段是非甾體藥，但存在副作用大、作用單一及有較多禁忌癥等缺點。雖然中藥治療oa也取得了一些經(jīng)驗，但對其具體的作用機制有深入研究的卻很少，因此在中醫(yī)理論的指導下，運用現(xiàn)代科學技術，對療效確切的中藥復方進行深入的機理研究，使中藥治療oa的療效在國際先進行列中占一席之地，是擺在我們面前非常重要的課題。1.2 國內(nèi)外現(xiàn)狀水平和發(fā)展趨勢近十年來，國內(nèi)外對oa進行了較深入地研究，大致歸納如下：1.2.1 流行病學研究已廣泛開展在近100種不同類型的關節(jié)疾病中，oa是影響人類健康最常見的關節(jié)疾患之一，沒有明顯的種族和地域差異，本病的患病

19、率隨年齡增加而增高，故隨著人類平均壽命的延長，患病率也有增高的趨勢。felson等報道70歲以下人群膝oa患病率為7%（男6.4%，女11.4%），80歲以上為11.2%（男5.4%，女15.8%）；而放射學膝oa70歲以上為27.4%（男30.4%，女25.1%），80歲以上為43.7%。butter等報道，44歲以下、4559歲、60歲以上人群中，放射血oa 患病率各為6.2%、21.6%和42.0%。國內(nèi)陳順樂等隊13541名鋼鐵工人的調(diào)查結果顯示，癥狀性oa患病率2.2%；無癥狀性oa患病率53%，其中3039、4049、5059歲患病率各為11%、27%和62%。汕頭大學醫(yī)學院統(tǒng)計5

20、51例，結果40歲以下、4049、5059和60歲以上各占12.2%、17.4%、26.1%和44.3%。另外不同關節(jié)oa易感性不同。美國在衛(wèi)生統(tǒng)計中心調(diào)查結果，oa患病率以手最高，以下依次為足、膝、髖。國內(nèi)陳順樂等調(diào)查結果oa是頸椎最多，以下依次為腰椎、膝、手和腕。本病性別差異在脊柱差別不大，但手、膝、髖oa均以女性較多，且女性骨關節(jié)炎的遺傳易感性較男性高。在framingham的研究中，felaon等發(fā)現(xiàn)女性體重減少11磅，骨關節(jié)炎形成的風險相應減少50%。 saase等調(diào)查結果，膝oa患病率男、女峰值分別為24.7%和54.6%。根據(jù)1994年統(tǒng)計，在美國，骨關節(jié)炎的消耗為155億美元，

21、約為類風濕關節(jié)炎的3倍，其中一半以上消耗緣于工作喪失。在我國雖未作全國大范圍的普查，但隨著老齡化社會進程的不斷加快，oa的發(fā)病率會越來越高，這必將給家庭、社會帶來沉重負擔。1.2.2 病因、發(fā)病機制有了巨大突破目前基礎研究認為軟骨的損傷與退變是oa的根本，隨著分子生物學免疫學的發(fā)展，近年來眾多學者對oa關節(jié)軟骨退行性改變的原因從不同角度進行了大量研究，其發(fā)病機制仍未完全明了，又提出了許多學說，如軟骨下骨內(nèi)高壓學說：由于骨血液動力學的改變，在骨髓腔容積不變的前提下增加內(nèi)容物引起壓力增高，即表現(xiàn)為骨內(nèi)壓力增高。骨內(nèi)高壓持續(xù)增高存在下關節(jié)滑液ph值下降，成分改變，干擾并破壞了軟骨細胞的正常代謝導致細

22、胞變性壞死，膠原纖維解聚，蛋白多糖分解，軟骨下骨破壞、修復，最終產(chǎn)生骨性關節(jié)炎。自由基學說：認為自由基對軟骨細胞dna和pg的合成具有抑制作用。自由基作用軟骨細胞后，引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化，使脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛增多，丙二醛可與dna發(fā)生交聯(lián)，自由基也可直接攻擊軟骨細胞dna即合成dna所需的酶，使dna鏈斷裂、堿基損傷從而影響了dna的合成，也造成前列腺（pg）合成障礙。骨關節(jié)炎時，滑膜、滑液、血管翳內(nèi)常有中性白細胞、巨嗜細胞浸潤，其表面受免疫復合物、補體等作用能釋放大量o2-和h2o2；細胞因子學說：細胞因子對骨關節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展起了重要作用，如白細胞介素-1（il-1）、白細胞介素-6(i

23、l-6)、腫瘤壞死因子（tnf）等在oa中水平明顯增高。il-1具有刺激軟骨細胞分泌一氧化氮、前列腺e和il-6的作用，引起滑膜炎癥和疼痛，同時il-1也是軟骨基質(zhì)降解的主要驅(qū)動因子；軟骨酶降解學說：oa軟骨細胞的基質(zhì)降解酶類的合成與分泌率明顯增加，并與關節(jié)炎的嚴重程度密切相關。參與降解基質(zhì)大分子的降解酶類可以增加達到幾倍。酸性和中性蛋白酶可以降解蛋白多糖的核心蛋白。基質(zhì)金屬蛋白酶，尤其是基質(zhì)溶素和膠原酶，參與關節(jié)軟骨的降解過程，這些酶類可以降解細胞外基質(zhì)的所有成分，與循環(huán)系統(tǒng)中的纖維蛋白溶酶和局部合成的纖溶酶原一起，快速降解軟骨。在滑膜細胞和軟骨細胞產(chǎn)生的il-1和tnf的作用下，軟骨細胞以

24、酶原的形式分泌大量的基質(zhì)金屬蛋白酶，而對金屬蛋白酶組織抑制劑無影響，使二者失衡從而增加對軟骨主要成分型膠原和蛋白聚糖合成的抑制作用，使軟骨進行性破壞；一氧化氮學說：no是一種細胞間信使分子，可介導許多生物學現(xiàn)象。nos可催化重要炎性介質(zhì)no的產(chǎn)生，oa患者血清、滑液中no含量明顯高于正常。no可通過抑制軟骨細胞增殖，促進軟骨細胞凋亡，改變蛋白多糖和膠原蛋白的合成與分泌功能，同時使軟骨細胞分泌透明質(zhì)酸減少，滑膜粘蛋白解聚，抑制軟骨細胞合成軟骨基質(zhì)，促進軟骨細胞糖酵解，使軟骨破壞。細胞凋亡學說：細胞凋亡是細胞死亡的形式之一，許多正常組織均可發(fā)現(xiàn)凋亡，但凋亡亢進與不足則會引起相關疾病，在骨關節(jié)炎患者

25、軟骨中軟骨細胞的凋亡有異常表現(xiàn)，且凋亡細胞數(shù)目與骨關節(jié)炎嚴重程度明顯相關。凋亡小體存在于軟骨細胞小孔或間隙內(nèi)，其產(chǎn)生的焦磷酸鹽能從溶液中沉積鈣，有ntpph（nucleosid triphosphate pyrophos phohydrolase）和堿性磷酸酶作用,造成余下軟骨細胞修復過程失敗，而逐漸發(fā)展成關節(jié)軟骨的完全丟失。oa軟骨細胞凋亡主要通過兩種相互獨立的途徑完成，一種是同滑膜炎癥無關的途徑,由no介導;另一種是同滑膜炎癥相關的途徑,由fas介導。典型的oa不存在明顯的炎癥反應,此時軟骨細胞凋亡以no途徑為主;當產(chǎn)生炎癥反應時,則通過as途徑加劇軟骨細胞凋亡和關節(jié)破壞。no通過兩種方式

26、造成組織及細胞損傷。一是高濃度的no能抑制多種與線粒體呼吸傳遞系統(tǒng)及檸檬酸循環(huán)有關的酶,從而抑制線粒體呼吸,造成組織損傷;二是no與超氧化陰離子2-反應,生成氧化亞硝基陰離子onoo-,在酸性條件下(如病理條件)迅速分解為oh-和no2自由基,這兩種自由基具有很強的細胞毒性,可造成組織細胞損傷。在oa患者中,受損區(qū)軟骨細胞的凋亡比例明顯高于未受損區(qū)。fas表達的結果與其相符,oa受損區(qū)的fas表達遠高于未受損區(qū),提示fas表達可誘導軟骨細胞凋亡。除no途徑和fas途徑外,還有一些因素可導致軟骨細胞凋亡、關節(jié)破壞,如il-1、il-8、tnf-、pge2、aggrecan g1區(qū)等。1.2.3

27、治療方面有了不少新方法目前中西醫(yī)治療oa的藥物較多，西藥治療oa主要有三大類，第一類為快作用藥，即非甾體藥，特點是發(fā)揮作用快，但副作用較大，對胃腸、肝腎、血小板均有較大影響，oa多為老年人，長期服用此類藥尤其不能耐受，且部分藥物價格不菲，而且由于過分的鎮(zhèn)痛，導致病人失去警惕過分運動，以致出現(xiàn)“消炎痛髖”，從長期療效來看反而不佳，最新觀點認為乙酰氨基酚應作為治療oa的首選藥，但尚有一定爭議，且同樣存在上述副作用；第二類為慢作用藥，發(fā)揮作用慢，療效不確切，價格昂貴，臨床上尚未廣泛運用；第三類為軟骨保護劑，尚未問世。關節(jié)清理術、膝關節(jié)置換術，適應癥較少，費用高，創(chuàng)傷大，病人難以接受。中哦藥治療oa的

28、研究取得了可喜的進步，但中藥治療仍存在較多共性的問題：多屬臨床經(jīng)驗，無對照組，特別是西藥對照組觀察，處方不固定。缺乏用客觀的最新的國際公認的、量化的臨床觀察指標及療效判斷標準為手段來尋找治療oa的中藥。未針對oa發(fā)病機制進行臨床及動物試驗從生化、免疫、病理、細胞分子水平來探討中藥的藥物作用機理。缺乏高效的、作用綜合、副作用小的新藥。中醫(yī)認為oa屬痹癥中的痹、痛痹、骨痹，認為其病因與年老體衰、長期勞損、外感風寒濕邪有關，明確指出肝腎虧虛、氣血不足、筋骨失養(yǎng)為oa的發(fā)病基礎，而寒濕、痰瘀為病理因素及病理產(chǎn)物。周尊謙等人在傳統(tǒng)中醫(yī)理論基礎上，闡述了膝oa骨內(nèi)高壓血瘀證氧自由基之間的密切關系；謝林等論

29、述了膝oa與血瘀證之間的內(nèi)在聯(lián)系，旨在為運用活血化淤藥治療oa提供理論依據(jù)。治療方面從古到今絕大部分醫(yī)家皆針對其病因病機采用益肝腎、強筋骨、補氣血治其本；散寒通絡、化痰勝濕治其標。獨活寄生湯是用于治療風寒濕痹、關節(jié)疼痛和腦血管后遺癥的傳統(tǒng)固防，具有補肝腎、活血通絡之功，臨床常見本方加減治療oa，療效比較肯定。朱健兒以本方加味治療262例，總有效率94.7%。單文龍等用本方加減治療骨關節(jié)炎24例，有效率為87.5%。陸智報道用本方加減治療104例，總有效率91.3%。1.2.4 實驗研究方面有了較大的進展隨著對oa發(fā)病機理的不斷深入認識，對oa的實驗研究方面也開始了向多層次多角度的方向發(fā)展。動物

30、實驗不再只局限于微循環(huán)和一般抗炎、鎮(zhèn)痛試驗，現(xiàn)已使用針對oa的動物實驗，并采用相關的指標進行檢測。目前實驗研究內(nèi)容主要有以下幾個方面，研究最多的是oa的血液流變學、氧自由基及一氧化氮含量等，這些試驗一般均可通過建立骨關節(jié)炎的模型來完成，也可通過使用其它相似的模型檢測相關指標來進行，如可建立急性血淤模型來檢查血液流變學指標，使用老齡動物通過檢測體內(nèi)sod及mda含量推斷藥物的抗氧自由基的能力等。在no對oa影響的實驗中，一般采用硝酸還原酶法來測定no含量，運用pt-pcr技術測定nos基因表達。il-1、il-6、tnf等細胞因子、軟骨降解酶尤其是基質(zhì)金屬蛋白酶、誘導關節(jié)滑膜炎癥的物質(zhì)如纖溶酶原

31、/纖溶酶原激活物和前列腺素pge2、軟骨細胞的細胞凋亡及增殖情況、性激素水平等也越來越多地被作為檢測指標使用到實驗研究中來。1.3 選題的理論和實踐依據(jù)祖國醫(yī)學并無骨關節(jié)炎的病名，從歷代文獻來看本病應歸屬于“骨痹”、“痛痹”范疇。我們認為oa病人除了肝腎虧虛，寒濕痹阻外，一般oa病人體重超重較多，也即為痰濕偏盛之體，另外脾虛生濕及寒濕痹阻日久濕聚成痰，痰淤交阻是引起膝關節(jié)腫脹畸形、活動受限的重要因素，所謂頑癥怪病皆質(zhì)之于痰淤。基于現(xiàn)代醫(yī)學對oa發(fā)病機理的深入研究，我們在補益肝腎、活血通絡基礎上，結合中藥對緩解軟骨降解，增加軟骨細胞功能，抑制滑膜增生及炎癥的研究成果，于1995年即對備急千金要方

32、中的獨活寄生湯進行化裁，重用活血化淤，加用化痰清熱之品，總結制定出了高效、藥源廣泛、安全可行的痛痹顆粒，并于1999年采用痛痹顆粒的組方治療膝oa，方中以獨活為君藥，以祛下焦與筋骨間風寒濕邪；威靈仙舒筋通絡止痹痛；淫羊藿、懷牛膝補肝腎，強筋骨，通經(jīng)絡，其中懷牛膝為引經(jīng)藥；當歸養(yǎng)血柔肝、舒筋活血；川芎則通達四肢關節(jié)，為血中氣藥；虎杖活血清熱解毒，同時防諸藥辛燥太過。諸藥合用共起補肝腎、祛風濕、化瘀痰之功，冀能消炎止痛，保護軟骨。通過36例的臨床研究、觀察，結果表明本方療效顯著且副作用小。因此有必要對痛痹顆粒治療骨性關節(jié)炎的作用機制尤其是該方對軟骨細胞的細胞凋亡與增殖機理做進一步的研究，冀能證實痛

33、痹顆粒的臨床療效，明確其作用機制，并初步探討本病發(fā)病的可能機理，為新藥問世提供客觀的依據(jù)，所以進行設計并立題。1.4本研究達到的科學技術水平，預期社會效益和應用推廣前景1.4.1繼承和發(fā)揚祖國醫(yī)學，保持中醫(yī)特色，以臨床療效為前提，以實驗研究為基礎，制造規(guī)范化大鼠的膝oa模型，從發(fā)病機理探討本藥的作用機制。本實驗采用可靠地國際公認的方法復制動物模型，并采用最新的檢測指標il-1、tnf、sod、mda、no等，總之本研究基于現(xiàn)代醫(yī)學對oa發(fā)病機制的最新研究成果，從生化、免疫等多個角度多個層次，系統(tǒng)觀察并進行歸納總結，確保本課題不但可行而且先進，冀能填補省內(nèi)外運用中藥治療oa的空白，并希望以此為基

34、礎，進一步從細胞水平（包括本藥對軟骨細胞及細胞凋亡與增殖的影響）研究中藥對oa的長久作用及影響，從而達到擠身國際先進水平的目的，讓中藥真正走向世界。1.4.2目前，中藥治療oa的方法頗多，但大多以臨床療效研究為主，大樣本、規(guī)范化的研究很少，中醫(yī)中藥治療機理的研究，雖有涉及，但大多分散且存在一定的重復性，理想的治療藥物尚未問世，具有公認療效的小兒遷延性腹瀉臨床治療方案尚未確立，其療效評價體系尚需研究確定，尤其是缺少中醫(yī)藥治療學整體研究思路與方法，使中藥復方治療oa的療效機理尚未能全面揭示，影響了該領域研究的深入。而痛痹顆粒是在中醫(yī)理論指導下選用千金要方中獨活寄生湯進行加減所得，并采用可靠的實驗模

35、型及最新的國際公認的相關指標進行實驗研究，觀察其對oa的確切療效及作用機理，這必將對oa的中醫(yī)理論產(chǎn)生較大影響，同時對臨床治療也起到更好的指導作用，從而產(chǎn)生較好的社會經(jīng)濟效益。隨著改革開放的形勢發(fā)展，以及中國加入wto與國際接軌的進程的不斷完善，祖國醫(yī)學國際地位不斷的提高，我們將從祖國醫(yī)學寶庫中發(fā)掘出的治療oa的高效藥物與現(xiàn)代新技術、新方法進行研究總結，從而為人類造福，為振興中醫(yī)事業(yè)做出應有的貢獻。2.科研假說或技術構想：主要內(nèi)容、技術關鍵目的，技術特征及創(chuàng)新之處，開發(fā)項目應說明開發(fā)規(guī)模。2.1主要內(nèi)容2.1.1探討oa的病因病機，提出新見解，發(fā)展中醫(yī)理論。2.1.2運用現(xiàn)代科學技術，開展實驗

36、研究，從分子生物學、免疫學、生理生化學等多方面來探討“痛痹顆粒”治療膝oa的療效機制及藥理毒理作用。2.2主要技術關鍵2.2.1膝oa模型的復制目前所使用的oa動物模型一般可分為兩大類，其一是誘發(fā)模型，即通過各種操作方法如制動、手術、關節(jié)內(nèi)注藥、關節(jié)內(nèi)植入軟骨碎片或微粒等誘導oa產(chǎn)生；另一類為自發(fā)模型，即不用任何外界干預，動物自發(fā)oa，如c57黑鼠等。在選擇動物模型時一般應考慮動物的種屬（包括其生活習性、關節(jié)結構、組織學及病理學特征）、不同方法的造模機制和oa模型的特點，并應參照研究目的加以選擇。在誘發(fā)模型中，常用的方法是手術造成關節(jié)的應力改變及關節(jié)腔內(nèi)注入木瓜蛋白酶， 這兩種方法都能復制出較

37、成功較高的oa模型，且操作較為簡單。具體的造模機制在于低應力可以造成軟骨厚度減少，so染色變淡，水分增加，蛋白聚糖聚集度損傷等變化，木瓜蛋白酶作為一種蛋白水解酶會引起關節(jié)軟骨的退行性改變。在具體的造模過程中我們選用以上兩種方法來分別復制動物模型。用于動物模型的動物一般有狗、兔、鼠等，我們選用大鼠做oa模型，因為該模型關節(jié)軟骨退變的組織學特征與人類相似，且動物來源較廣泛，且經(jīng)濟。2.2.2關節(jié)軟骨細胞的獲取和培養(yǎng)基于來源廣泛，操作可行的原則，目前用于體外培養(yǎng)的軟骨細胞一般均為兔關節(jié)軟骨細胞原代培養(yǎng)所得。軟骨需在嚴格無菌的條件下分離，經(jīng)過一系列的漂洗、消化等工作后獲取軟骨細胞。目前還沒有專門用于軟

38、骨細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液，國外采用的培養(yǎng)液種類繁多，有199、1640、f12、改良eagle等，國內(nèi)的有199、1640、dmem（高糖）等，其中加入胎牛血清（占15%），一般以使用dmem培養(yǎng)液居多。在培養(yǎng)液中還含有一些輔助添加劑，包括25mmol/l hepes、1mmol/l 丙酮酸鈉、2mmol/l 谷氨酰胺、50umol/l 二硫基乙醇以及10萬單位/l的青霉素和10萬單位/l的鏈霉素，ph7.4。培養(yǎng)過程中一般使用5%co237的恒溫培養(yǎng)箱。2.2.3采用的檢測手段及指標在病理組織形態(tài)學的檢查中，一般采用以下幾個觀察指標：大體肉眼觀察軟骨及滑膜表面情況；he染色觀察有關的形態(tài)變化；ma

39、sson三色染色觀察膠原的變化；sanfranin-o即沙紅o染色用于組織學評分，評分方法按mankin法；電鏡下觀察軟骨細胞內(nèi)結構形態(tài)變化及其周圍膠原纖維的變化。在細胞培養(yǎng)的相關檢測中，我們采用mtt法檢測軟骨細胞的增殖能力，用全自動生化分析儀對檢測總蛋白含量，使用細胞流式儀進行細胞凋亡的測定，對inos、no含量的測定則使用分型nos試劑盒和no試劑盒。2.3目標（達到的主要技術指標或技術經(jīng)濟指標）、技術特征及創(chuàng)新之處?，F(xiàn)代科學技術與中醫(yī)藥理論相結合，深入研究中醫(yī)藥治療oa的作用機制，為臨床應用提供更加科學有利的客觀依據(jù)，發(fā)揮中醫(yī)藥治療oa的特色和優(yōu)勢，為臨床常見、嚴重影響人類健康的oa研

40、究出有效、安全、便于推廣應用的中醫(yī)藥治療方法，使能迅速緩解癥狀，大大減輕病人痛苦，降低膝骨關節(jié)炎的致殘率和復發(fā)率，且副作用小的簡、便、廉、驗的中藥制劑問世。治療膝oa的新藥生產(chǎn)及對其在治療中所起作用機制的深入探討，既符合國情又能夠走向世界，產(chǎn)生較大的社會和經(jīng)濟效益，這必然形成高新技術產(chǎn)業(yè)進入高新領域，對促進科技進步，發(fā)展中醫(yī)藥，有著積極的作用，同時這也是中藥現(xiàn)代化研究的發(fā)展方向和新的探索。3.實驗研究方法及技術路線。3.1對實驗性大鼠骨性關節(jié)炎的防治作用 oa模型的制備：（1）取sd雄性大鼠50只，體重200220g，固定，常規(guī)備皮消毒，沿髕韌帶內(nèi)側(cè)緣切口，切斷雙后肢內(nèi)側(cè)副韌帶及膝前內(nèi)側(cè)筋膜擴

41、張部，并在斷端處修剪去除約2mm，造成雙后肢膝外翻畸形。術后第二天放造模大鼠于拖箱內(nèi)每天趕其行走30m。（2）取sd雄性大鼠50只，體重200220g，4%木瓜蛋白酶溶液與0.03mol/l半胱氨酸溶液1：1混置0.5小時后，分別在第1、3、5、7天于實驗大鼠膝關節(jié)腔內(nèi)注入混合液20ul。方法：將造模后的大鼠隨機分為模型組、陽性對照組（維骨力組）、治療組，另設正常對照組，分別灌胃給藥或蒸餾水，連續(xù)7周。七周后將動物麻醉后，立即將大鼠以仰臥位固定，頸總?cè)⊙?，接入試管中?000rmp15min離心獲取含藥血清；切開關節(jié)囊，進行大體觀察后，然后以銳利刀片切取膝關節(jié)前正中部分的滑膜組織，作he染色，

42、電鏡下觀察。再用銳利刀片切取股骨內(nèi)倮軟骨使其呈2mm×1mm全層軟骨標本，2.5%戊二醛溶液固定，電鏡下觀察。所余之股骨內(nèi)倮連同軟骨下骨一并切下，10%福爾馬林溶液固定24小時以上，分別作he、沙紅-o及masson三色染色后光鏡檢查，取樣后即可將動物處死。觀察指標：大體肉眼觀察軟骨及滑膜表面情況；he染色觀察有關的形態(tài)變化；masson三色染色觀察膠原的變化；sanfranin-o即沙紅o染色用于組織學評分，評分方法按mankin法（附評分等級表如下）；電鏡下觀察軟骨細胞內(nèi)結構形態(tài)變化及其周圍膠原纖維的變化。評分等級.結構正常 0表面結構微小不規(guī)則 1表面結構中等不規(guī)則 2表面結構

43、嚴重不規(guī)則 3過渡層出現(xiàn)裂隙 4輻射層出現(xiàn)裂隙 5鈣化層出現(xiàn)裂隙 6過渡層消失 7輻射層消失 8鈣化層消失 9結構完全破壞 10.細胞1. 切線的區(qū)域正常 0細胞腫脹 1細胞消失 22. 過渡和輻射的區(qū)域正常 0少量的細胞增多 1中等量的細胞增多 2大量的細胞增多 3少量的克隆 4中等量的克隆 5大量的克隆 6少量的細胞減少 7中等量的細胞減少 8大量的細胞減少 9細胞消失 10.變異標記 完整 0多層 1模糊 2血管的交叉 3.血管翳形成沒有 0少量 1中等量 2大量 33.2 對體外培養(yǎng)兔膝關節(jié)軟骨細胞的影響 3.2.1 兔膝軟骨細胞的原代培養(yǎng) 無菌條件下取兩周齡新西蘭白兔后肢關節(jié)，用刀片

44、取關節(jié)表面軟骨，收集在含磷酸緩沖液（pbs）的無菌小培養(yǎng)皿內(nèi)，反復清洗除去軟骨片表面的血液，以及可能勿帶之滑膜組織。漂洗完畢后，用無菌的眼科小剪刀在培養(yǎng)皿中將其細切至不大于1mm3。切碎后將其裝入10u試管內(nèi)，按1：10量加入消化酶類進行化學解離。先用0.25%胰酶消化30min，然后去除胰酶，加入0.2%膠原酶消化78小時后，1500rpm10min離心，棄上清，加入pbs，搖勻在同上離心棄上清，在加pbs反復三次，最后一次加含15%胎牛血清dmem培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打均勻，200目篩網(wǎng)過濾，放入培養(yǎng)瓶中， 5%co237培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定期換液，并觀察照相，長滿后用0.25%胰酶消化傳代。3

45、.2.2 對軟骨細胞增殖反應的作用 將在培養(yǎng)瓶中長滿的細胞消化，接入96孔培養(yǎng)板中，100ul/孔， 待細胞長成單層后，將舊液棄去，用pbs輕輕蕩洗一遍，然后加入含藥血清，100ul/孔，每組4個復孔。二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱孵育72h后，取上清液。每孔加入mtt試劑20ul（5g/l）既無血清培養(yǎng)液100ul，再孵育4h。取上清，每孔加入200ul溶甲瓚液，以主波長570nm，參比波長690nm于酶標儀上比色，讀取吸光度（a）值。3.2.3 對軟骨細胞的細胞凋亡的影響 單層細胞培養(yǎng)板制作同上，加入含藥血清，每組4個復孔，于5%co237培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，棄去舊液，用0.25%胰酶消化待細胞有變圓

46、趨勢即取出消化液，加入pbs，用吸管輕輕吹打，使成單個細胞懸液，移入離心管離心，1000rpm，5min，去掉上清液，約留0.5ml細胞懸液，用振蕩器使細胞分散，用細滴管或注射器將細胞迅速注入4冷乙醇中（乙醇終濃度為70%），用細胞流式儀檢測凋亡細胞數(shù)目，計算凋亡百分率。3.2.4 對軟骨細胞蛋白合成和no含量的影響 同樣將各組含藥血清加入已長成單層細胞的培養(yǎng)板內(nèi)，co2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，收集上清液，用全自動生化分析儀檢測總蛋白含量，用分型nos試劑盒和no試劑盒檢測各組inos、no含量。3.2.5 拆方后對軟骨細胞的影響 進行拆方實驗，篩選出補肝腎組方、祛風濕組方和化瘀痰組方三組，對

47、這三組及復方分別進行體外的軟骨細胞實驗，設立陽性對照組（維骨力組）：細胞毒性實驗 將各組方藥液用培養(yǎng)基分別配成幾個待測濃度，加入已長成單層細胞的培養(yǎng)板內(nèi)，分別觀察24h、48h、72h細胞形態(tài)的變化，選擇細胞不發(fā)生變圓、萎縮、漂浮的最大濃度為藥物對細胞的最大無毒濃度，以便繼續(xù)實驗。對軟骨細胞的細胞凋亡、增殖、no含量及inos基因表達的影響 將各組方藥液分別配置成最大無毒濃度，加入已長成單層軟骨細胞的細胞培養(yǎng)板內(nèi)，具體檢測操作則同加入含藥血清的實驗。4.現(xiàn)有工作條件和基本條件本課題主要承擔者是江蘇省中醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所。本所具有江蘇省科學技術委員會，江蘇省標準局頒布的動物飼育環(huán)境合格證書，動物質(zhì)量合格證書，人員素質(zhì)高，均擁有實驗動物從業(yè)人員崗位證書。儀器設備先進完善，擁有無菌室，能夠進行細胞培養(yǎng)及指標檢測等一系列工作，具有較強的科研能力。本組方的提供者是本院的風濕科，該科擁有?？撇》浚?0張病床）及全天