生物化學(xué)核酸化學(xué)

1、2.5 2.5 核酸的理化性質(zhì)及其應(yīng)用核酸的理化性質(zhì)及其應(yīng)用 2.5.1 2.5.2 2.5.3 2.5.4 2.5.1 rna為白色粉末，為白色粉末，dna是白色纖維狀固體，二者是白色纖維狀固體，二者均微溶于水，而不溶于一般有機溶劑中，故常用均微溶于水，而不溶于一般有機溶劑中，故常用70%乙醇從水溶液中將核酸沉淀出來。乙醇從水溶液中將核酸沉淀出來。核酸既有堿性基團，又有磷酸基團，故為兩性電核酸既有堿性基團，又有磷酸基團，故為兩性電解質(zhì)，但酸性強。介質(zhì)解質(zhì)，但酸性強。介質(zhì)ph大于大于4時，呈陰離子，電時，呈陰離子，電泳時向陽極移動。泳時向陽極移動。大多數(shù)大多數(shù)dna為線性分子，長度可達數(shù)厘米，

2、直徑為線性分子，長度可達數(shù)厘米，直徑僅為僅為2nm，故，故dna溶液粘度很高，分子極易斷裂溶液粘度很高，分子極易斷裂；rna溶液粘度較小。溶液粘度較小。2202402602800.10.20.30.4波長（波長（nmnm）光光吸吸收收123天然天然dna核苷酸總核苷酸總吸收值吸收值變性變性dna2.5.2 （max=260nm）純dna od260/od280=1.8純rna od260/od280=2.02.5.3 是是雙鏈核酸分子雙鏈核酸分子的二個重要的二個重要物理特性物理特性； 雙鏈雙鏈dnadna、rnarna雙鏈區(qū)雙鏈區(qū)、dna: rnadna: rna雜交雙雜交雙鏈鏈都有此性質(zhì)。都

3、有此性質(zhì)。 2.5.3.1 （denaturation）雙螺旋結(jié)構(gòu)打開，形成無規(guī)則線性雙螺旋結(jié)構(gòu)打開，形成無規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的過程。結(jié)構(gòu)的過程。加熱加熱部分雙螺旋解開部分雙螺旋解開 無規(guī)則線團無規(guī)則線團 鏈內(nèi)堿基配對鏈內(nèi)堿基配對化學(xué)鍵變化：化學(xué)鍵變化：氫鍵、疏水鍵斷裂，不涉及共價鍵的斷裂。氫鍵、疏水鍵斷裂，不涉及共價鍵的斷裂。結(jié)構(gòu)變化：結(jié)構(gòu)變化：改變核酸空間結(jié)構(gòu)，一級結(jié)構(gòu)不變。改變核酸空間結(jié)構(gòu)，一級結(jié)構(gòu)不變。增色效應(yīng)：增色效應(yīng)：dnadna變性后，溶液紫外吸收作用增強的效應(yīng)。變性后，溶液紫外吸收作用增強的效應(yīng)。原因：原因：在雙螺旋結(jié)構(gòu)中，有序堆積的堿基紫外吸收降在雙螺旋結(jié)構(gòu)中，有序堆積的堿基紫外吸

4、收降低，當(dāng)?shù)?，?dāng)dnadna變性后，雙鏈解開，堿基外露，變性后，雙鏈解開，堿基外露， 260nm 260nm紫外紫外吸收增大，產(chǎn)生增色效應(yīng)。吸收增大，產(chǎn)生增色效應(yīng)。l加熱加熱l極端的極端的phl有機試劑（甲醇、乙醇、尿素等）。有機試劑（甲醇、乙醇、尿素等）。 dnadna的熱變性的熱變性特點：特點： 狹窄性：狹窄性：變性溫變性溫度范圍小。度范圍小。 爆發(fā)式：爆發(fā)式：像晶體像晶體的的熔點熔點，到達變性，到達變性溫度后，溫度后，dna很快很快變性解鏈，故名變性解鏈，故名熔熔解溫度解溫度。dnadna熱變性曲線熱變性曲線熔解溫度熔解溫度（melting temperature，tm）：）：dna 分

5、子雙分子雙鏈解開鏈解開50%所需溫度所需溫度。一般一般dna的的tm值在值在80-90 c之間。之間。 t tm m值的影響因素：值的影響因素：堿基組成堿基組成：（g+c）含量越高，雙螺旋結(jié)構(gòu)的越穩(wěn)定，）含量越高，雙螺旋結(jié)構(gòu)的越穩(wěn)定，tm值越大，值越大，氫鍵數(shù)氫鍵數(shù)gc，a=t 。計算計算tm的經(jīng)驗公式的經(jīng)驗公式(在在0.2mol/l nacl溶液中溶液中) : x% x%（g+cg+c）=2.44=2.44（tm-69.3tm-69.3） 另外，另外，當(dāng)當(dāng)dna鏈堿基數(shù)鏈堿基數(shù)20： tm=4 tm=4（g+cg+c）+2+2（a+ta+t） t tm m值的影響因素：值的影響因素：dnad

6、na的均一性：的均一性：dna分子中堿基組成的均一性：分子中堿基組成的均一性：如只含有如只含有一種堿基對一種堿基對的的多核苷酸片段，多核苷酸片段，tm值范圍很窄，變性時氫鏈斷裂幾乎可值范圍很窄，變性時氫鏈斷裂幾乎可“齊同齊同”進行進行待測待測dna樣品組成的均一性：樣品組成的均一性：如樣品中只含有一種病毒如樣品中只含有一種病毒dna，其，其 tm 值范圍較窄，若混有其它來源的值范圍較窄，若混有其它來源的dna，則，則 tm值范圍較寬值范圍較寬復(fù)性復(fù)性：在一定條件下，變性：在一定條件下，變性dna單鏈間堿基重新單鏈間堿基重新配對恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，配對恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，dna的功能恢復(fù)。的功能恢復(fù)。減

7、色效應(yīng)：減色效應(yīng)：變性變性dna復(fù)性過程中，復(fù)性過程中，伴有伴有a260減小的減小的現(xiàn)象。現(xiàn)象。 2.5.3.2（renaturation)變性（加熱）變性（加熱）復(fù)性（緩慢冷卻）復(fù)性（緩慢冷卻）影響復(fù)性的因素影響復(fù)性的因素 溫度和時間溫度和時間 dnadna濃度濃度 dnadna序列的復(fù)雜度序列的復(fù)雜度溫度和時間溫度和時間 一般認為一般認為比比 tm低低25左右左右的溫度是復(fù)性的溫度是復(fù)性的最佳條件，一般為的最佳條件，一般為60 左右左右。 復(fù)性時溫度下降必須緩慢復(fù)性時溫度下降必須緩慢，若在超過，若在超過tm的溫度下迅速冷卻至低溫，復(fù)性幾乎不可的溫度下迅速冷卻至低溫，復(fù)性幾乎不可能。核酸實驗

8、中經(jīng)常以此方式保持能。核酸實驗中經(jīng)常以此方式保持dna的的變性（單鏈）狀態(tài)。變性（單鏈）狀態(tài)。dna濃度濃度 dna復(fù)性的第一步是兩個單鏈分子間的復(fù)性的第一步是兩個單鏈分子間的相互作用相互作用“成核成核”。 “成核成核”速度與速度與dna濃度的平方成正比。濃度的平方成正比。溶液中溶液中dna分子越多，相互碰撞結(jié)合分子越多，相互碰撞結(jié)合“成成核核”的機會越大。的機會越大。dna順序的復(fù)雜性順序的復(fù)雜性 簡單順序的簡單順序的dna分子，如多聚（分子，如多聚（a）和多聚（）和多聚（t）這二種單鏈序列復(fù)性時，互補堿基的配對容易。這二種單鏈序列復(fù)性時，互補堿基的配對容易。 順序復(fù)雜的順序復(fù)雜的dna，如

9、小牛，如小牛dna的非重復(fù)部分的非重復(fù)部分（一般以單拷貝存在于基因組中），這種復(fù)雜的（一般以單拷貝存在于基因組中），這種復(fù)雜的特定序列要實現(xiàn)互補，顯然要比上述簡單序列困特定序列要實現(xiàn)互補，顯然要比上述簡單序列困難得多。難得多。定義：定義：不同來源的不同來源的dna單鏈間、單鏈單鏈間、單鏈dna與與rna、rna與與rna之間存在堿基配對之間存在堿基配對區(qū)域，復(fù)性時形成區(qū)域，復(fù)性時形成雜交分子雜交分子的現(xiàn)象。的現(xiàn)象。2.5.4(簡稱雜交，簡稱雜交，hybridization) 常用的雜交方法有常用的雜交方法有:southern（dna)印跡法印跡法:利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性利用瓊脂糖凝膠電

10、泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的內(nèi)切酶消化的dna片段，將膠上的片段，將膠上的dna變性并在原位將單鏈變性并在原位將單鏈dna片段片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的標記探針進行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的標記探針進行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測特定而檢測特定dna分子的含量。分子的含量。 northern （rna)印跡法印跡法: 將將rna固定在硝酸纖維素膜上后固定在硝酸纖維素膜上后,用互補的用互補的,具有放射性標記的具有放射性標記的rna或或dna探針與其雜交探針與其雜交.2.5.4(簡稱雜交，簡稱雜交，hybridization) 本章重點本章重點五種堿基及相應(yīng)的核苷酸及脫氧核苷酸的五種堿基及相應(yīng)的核苷酸及脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)式結(jié)構(gòu)式；堿基與戊糖的；堿基與戊糖的連連接方式接方式；核苷酸殘基的；核苷酸殘基的連接方式連接方式；dna雙螺旋結(jié)構(gòu)的基本要點雙螺旋結(jié)構(gòu)的基本要點trna的結(jié)構(gòu)特點的結(jié)構(gòu)特點l一級結(jié)構(gòu)：一級結(jié)構(gòu)：由由7090個核苷酸組成單鏈；含較多的稀有堿基；個核苷酸組成單鏈；含較多的稀有堿基；5端多為端多為pg 、3端多為端多為ccaoh 。l二級結(jié)構(gòu)：二級結(jié)構(gòu)：三葉草形、四臂四環(huán)三