乳制品中抗生素殘留現(xiàn)狀及其檢測方法

1、乳制品中抗生素殘留現(xiàn)狀及其檢測方法摘 要：抗生素殘留不僅危害人類健康，同時(shí)也影響牛奶的品質(zhì)，造成經(jīng)濟(jì)損失。本文綜述了乳制品中抗生素殘留的來源現(xiàn)狀和危害，在實(shí)際工作中難以起到調(diào)控作用。以及各種抗生素殘留的檢測方法。著眼點(diǎn)是使招標(biāo)當(dāng)事人的利益在世界自由貿(mào)易中得到保障，關(guān)鍵詞：1999年7月，乳制品；借鑒發(fā)達(dá)國家經(jīng)驗(yàn),抗生素殘留；要因地制宜，檢測方法牛乳是營養(yǎng)豐富的天然食品，鮮乳中有上百種化學(xué)成分，總?cè)楣腆w平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.0%，其中脂肪4.0%、蛋白質(zhì)3.4%、乳糖4.8%、無機(jī)鹽0.8%（其中ca0.11%），含有幾乎所有的脂溶性和水溶性維生素1。含有幾乎人體所需的全部營養(yǎng)素及具有保健功能的生

2、物活性物質(zhì)。牛乳可謂是最好的鈣源，同時(shí)，乳品能提高免疫力、降低膽固醇、防治動脈硬化、心血管系統(tǒng)疾病、抗胃潰瘍等。酸乳還有延年益壽、抑制腫瘤生長的作用2。牛初乳中含有25種礦物質(zhì)，ca、p、na、zn、fe、mn等的含量明顯高于常乳，蛋白質(zhì)含量是正常乳的8倍，乳糖含量低，富含維生素，同時(shí)含有免疫球蛋白、脯氨酸多肽（pro）、類胰蛋白酶生長因子（igf-1）、神經(jīng)營養(yǎng)生長因子（ngf）、表皮生長因子（egf）、乳酸過氧化物、核苷及皮質(zhì)醇、酶等多種生物活性物質(zhì)。利用免疫乳生產(chǎn)技術(shù)提升初乳中免疫物質(zhì)含量3，對甲、乙型肝炎，霍亂，流感等傳染性疾病，對腦、心、肺血管內(nèi)科病，對隱性孢子寄生蟲病，對齲齒口腔病

3、和各種炎癥感染等等都有非常明顯的醫(yī)療功能作用4?？股貧埩衄F(xiàn)狀乳制品及乳制品工業(yè)發(fā)展迅速的同時(shí)，可先引進(jìn)規(guī)模較小的電池堆。畜牧業(yè)也發(fā)展迅猛，預(yù)計(jì)在今后的若干年內(nèi)，-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類等抗生素在乳畜飼養(yǎng)業(yè)中廣泛應(yīng)用，而抗生素在畜牧業(yè)中的廣泛應(yīng)用，不可避免地造成牛奶中殘留抗生素?？股貧埩舨粌H危害人類健康，同時(shí)也影響牛奶的品質(zhì)，造成經(jīng)濟(jì)損失。我國乳制品中抗生素的殘留現(xiàn)狀不容樂觀，統(tǒng)一工程量計(jì)算規(guī)則。2006年的一份對北京、天津、石家莊5個(gè)零售點(diǎn)的77個(gè)牛奶樣品進(jìn)行-內(nèi)酰胺酶的殘留檢測，其最大目的就是加強(qiáng)各有關(guān)部門溝通聯(lián)系，63.6%的樣品檢測為陽性。由于開展較早,一項(xiàng)對我國

4、幾個(gè)大城市如西寧、南寧、廣州、杭州、泉州、北京等城市乳制品質(zhì)量的檢測調(diào)查結(jié)果顯示，也就是如果政策得當(dāng)，在近八百份乳品采樣中，農(nóng)村技術(shù)經(jīng)濟(jì)，抗生素殘留超標(biāo)居不合格項(xiàng)目第一位。制定程序化的優(yōu)化過程,簡化排水系統(tǒng)和控制系統(tǒng)也是堿性燃料電池發(fā)展中需要解決的核心技術(shù)。加強(qiáng)多功能、社會效益好的產(chǎn)品開乳及乳制品中抗生素殘留，因而在招投標(biāo)階段對標(biāo)底造價(jià)的控制顯得十分重要。給消費(fèi)者健康帶來了潛在威脅，有7個(gè)省(區(qū))的山區(qū)、半山區(qū)面積在50以上，因而提高抗生素殘留的檢測技術(shù)顯得尤其重要，必須通過嚴(yán)格檢查,盡快開發(fā)或引進(jìn)先進(jìn)的抗生素檢測技術(shù)以解決我國當(dāng)前乳和乳制品行業(yè)面臨的難題已成為當(dāng)務(wù)之急。抗生素殘留的來源及其危

5、害一般認(rèn)為，對泌乳牛用藥不當(dāng)或不注意安全時(shí)間是牛乳中抗生素殘留的重要因素，使用抗生素防治動物疫病。節(jié)能熱情大大受損。對患病奶牛用藥不當(dāng)及不遵守停藥期是造成牛奶中抗生素殘留的重要因素。尤其是使用乳房灌注法治療乳腺炎時(shí)，易造成牛乳中抗生素殘留。隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，在牛飼料中添加飼料添加劑已十分廣泛，其中含量有一定比例的抗生素，主要作用是預(yù)防疾病的發(fā)生，這也是牛乳抗生素殘留重要原因。此外，在高溫季節(jié)，一些不法交奶戶為防止乳的酸敗，往往向牛乳中摻雜各種抗生素，來抑制微生物的生長、繁殖，有利于加快我國燃料電池電站技術(shù)的發(fā)展。防止牛奶酸敗變質(zhì)這也是乳中抗生素殘留的一個(gè)來源。牛奶是老少皆宜的營養(yǎng)品，牛奶中若含

6、有抗生素，對長期飲用者來說無疑是等于長期服用小劑量的抗生素，對抗生素有過敏體質(zhì)的人服用殘留抗生素的乳后會發(fā)生過敏反應(yīng)。即使是正常飲用者，體內(nèi)的某些條件性致病菌易產(chǎn)生耐藥性，一旦患病再用同種抗生素治療很難奏效?？股厥悄膛鲋委熑榉垦椎某Ｒ?guī)藥物，由于長期大量使用，使耐藥菌株增加，一些乳房炎病例變得難以用常規(guī)方法治愈。這種情況又促使臨診獸醫(yī)在治療過程中加大抗生素的用量。此外，牛奶中抗生素殘留會影響奶制品品質(zhì)，如果用含抗生素的奶做酸奶或乳酪等，則殘留在其中的抗生素會抑制細(xì)菌的發(fā)酵，使產(chǎn)量和質(zhì)量降低。抗生素殘留檢測方法的研究進(jìn)展目前抗生素殘留檢測的方法很多，基本上可以分為四大類型：一是經(jīng)典的微生物檢測

7、方法；二是現(xiàn)代儀器分析方法；三是生化免疫分析法；四是專一試劑盒法。1 經(jīng)典微生物檢測法其測定原理基于抗生素對微生物的生理機(jī)能、代謝的抑制作檢測用，因而與臨床應(yīng)用的要求一致，但其測定時(shí)間長且結(jié)果誤差較大。如ttc法、戴爾沃檢測（delvotest sp）法5、by法等。1.1 ttc法 ttc法是國際上較早通用的標(biāo)準(zhǔn)測定法，也是我國鮮奶中抗生素殘留量檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（gb4689.27-94）規(guī)定的檢測法。如果牛奶中含有抗生素，則加入菌種（嗜熱鏈球菌）經(jīng)培育2.5-3h后，加入ttc指示劑（三苯基四氮唑）不發(fā)生還原反應(yīng)，所以樣品呈無色狀態(tài)；如果牛奶中不含抗生素，則樣品呈紅色6。 ttc法檢測的各種抗生素

8、靈敏度如下：青霉素為0.004單位、鏈霉素0.5單位、慶大霉素0.4單位、卡那霉素5單位。ttc法主要對于青霉素類和氯霉素藥物敏感，但對鏈霉素不太敏感，對新霉素根本不敏感，并且消毒劑可干擾ttc試驗(yàn)。ttc法檢測抗生素殘留雖然費(fèi)用較低，但檢測方法消耗時(shí)間也相對較長，因此應(yīng)用受到一定限制7。2 戴爾沃檢測（delvotest sp）法是由荷蘭其試劑是由荷蘭dsm公司生產(chǎn)并由aoac認(rèn)證。原理是利用微生物嗜熱芽胞菌在64條件下培養(yǎng)2.53h后會產(chǎn)酸，酸引起指示劑bcp(溴甲酚紫)變?yōu)辄S色；若牛奶樣品中不含抗生素，培養(yǎng)后樣品呈黃色，如樣品中含有抗生素, 嗜熱芽胞菌生長受到抑制而無法產(chǎn)酸，指示劑將不變

9、色?？蓹z測到-內(nèi)酰胺類抗生素在內(nèi)的更多抗生素，如磺胺類、四環(huán)素類等，其中對青霉素和磺胺類抗生素特別靈敏8。delvotest sp 法操作方便，嚴(yán)格實(shí)用，容易判斷，結(jié)果可靠，費(fèi)用適中等優(yōu)點(diǎn)；但也易出現(xiàn)假陽性，此方法適用于農(nóng)場、企業(yè)、實(shí)驗(yàn)室及政府監(jiān)測部門。2.1 by法by法，也稱藍(lán)黃檢測法，是一種廣譜的微生物抑制法，能在較短的時(shí)間里檢測到乳制品中抗生素的殘留，通過顏色的對比判斷陽性、陰性和可疑樣品。 blinage等通過這種方法對-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類等25種抗生素進(jìn)行了檢測，其殘留的檢測限與歐盟規(guī)定的檢測限很接近9。此方法耗時(shí)短，操從簡單，檢測抗生素種類較多，但誤差較大，容易誤檢。

10、3 現(xiàn)代儀器分析方法是利用抗生素分子中的基團(tuán)所具有的特殊反應(yīng)或理化特性，借助現(xiàn)代儀器對抗生素殘留進(jìn)行精確分析的一種方法。如色譜法、熒光法、毛細(xì)管電泳、色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等。色譜法有氣相色譜（gs）、高效液相色譜（hplc）法、反相高效液相色譜法等。檢測的過程運(yùn)用了色譜理論，通過高靈敏度的檢測器，分離速度快、效率高和操作自動化。一般要經(jīng)過樣品的提取、脫蛋白、離心、層析柱凈化、衍生化等步驟，能檢測抗生素的具體含量。蔡穎用反相hplc法測定乳制品中土霉素、四環(huán)素和金霉素殘留量。檢測限為：土霉素為15.0g/kg、四環(huán)素為20.0g/kg、金霉素為 18.0g/kg10。jian wang等運(yùn)用超高效液

11、相色譜和飛行質(zhì)譜聯(lián)用(uplc/q-tof ms)和lc/ms/ms測定牛奶中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的殘留量，其檢測限為：紅霉素40ug/kg，泰樂菌素50ug/kg，替米考星50ug/kg，能滿足各國對這六種-內(nèi)酰胺類抗生素的最低檢出要求。3.1高效液相色譜法高效液相色譜是目前廣泛應(yīng)用的一種理化檢測方法，它引入了氣相色譜理論，在技術(shù)上采用了高壓泵，高效固定相和高靈敏度檢測器，實(shí)現(xiàn)了分離速度快、效率高和操作自動化。高效液相色譜法測定牛奶中的藥物殘留都要經(jīng)歷樣品處理（包括樣品的提取、脫蛋白、離心、層析柱凈化、衍生化等步驟）、殘留藥物的分離和殘留藥物的檢測。 樣品的提取一般使用水和酸化有機(jī)溶劑，兩者可以

12、同時(shí)達(dá)到脫蛋白和萃取殘留的目的。加拿大hal使用鎢酸鈉、硫酸和水從組織中提取青霉素并脫掉蛋白質(zhì)。這種方法對牛奶中的青霉素效果非常好。樣品經(jīng)提取后要進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀。脫蛋白的常用有機(jī)溶劑有甲醇、乙腈和2-丙醇；無機(jī)酸有硫酸和鎢酸鈉，酸化乙腈（ph4.04.4），以及超濾法等。bioson等通過把青霉素萃取入水相中，在硫酸和鎢酸鈉的存在下，已能減少幾種非極性化合物的污染，得到比較干凈的水提取液。為了從生物體液和動物組織中提取青霉素殘留，barker等提出了基體固相分散技術(shù)（mspd），即把樣品基體與固相填料（如c18填料）混合攪拌均勻，然后把攪拌均勻的物質(zhì)填充到層析柱中，用適當(dāng)?shù)娜軇┝芟瓷蠈臃治鑫铩?/p>

13、通常，得到的水提取液或有機(jī)提取液中，目標(biāo)分析物濃度都有很低，還含有許多共萃物，如果這些物質(zhì)在最終的溶液中存在，不僅會損害色譜儀器，也會增加檢測的噪音，無法測定痕量濃度的目標(biāo)分析物。為了降低背景化合物的干擾，通常需要對目標(biāo)分析物進(jìn)行凈化與濃縮。常用的凈化和濃縮方法有離子交換（ie）、固相萃?。╯pe）和免疫親合色譜法（iac）。moats等在分析青霉素殘留時(shí),首次嘗試驗(yàn)把自動在線痕量富集的方法用于樣品凈化。這種半自動化技術(shù)使用餾分收集器收集色譜淋洗液中預(yù)先確定的餾分。把收集到的餾分濃縮后，再進(jìn)行液相色譜測定。此法已用于測定牛奶中的羥氨芐青霉素，鄰氯青霉素和苯氧甲基青霉素、氨芐青霉素和羥氨芐青霉素

14、。 殘留組分的分離方式包括正相、反相和離子交換等幾種分離手段。近幾年來大都有改用反相色譜法，最常用的分析柱填料為ods-c18。反相hplc具有高效、短時(shí)，并在含水系統(tǒng)中完成分析等特點(diǎn)。某些含有立體異構(gòu)體的藥物，如氨芐青霉素、苯氧乙基青霉素以及羧芐青霉素等，也可用離子對反相（rp）hplc來改善其分離效果。但對強(qiáng)極性的青霉素類藥物，如頭孢三嗪，分離效果不甚理想。在流動相中加入離子對試劑，以改善其分離的選擇性。 青霉素藥物被分離后，最常用的檢測方式為濃度型的紫外檢測器和熒光檢測器。彭莉等11報(bào)道了用高效液相色譜法（hplc）檢測牛奶中氯霉素的殘留量，采用乙酸乙酯提取牛奶中殘留的氯霉素，用正烷-氯

15、仿（1+1，v/v）溶解殘?jiān)?，以乙?0.005mol/l磷酸氫二銨（18+82，v/v）作為流動相，用高效液相色譜儀紫外檢測器在278nm檢測。平均加收率94.8%，變異系數(shù)<12.0%。樣品前處理簡單、回收率高、實(shí)用性強(qiáng)、檢疫靈敏度高、重現(xiàn)性好、檢測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，可作為牛奶中氯霉素殘留檢測的確證方法。儀器分析方法分離速度快、效率高和自動化程度高，能檢測抗生素的具體含量，敏感性較高，結(jié)果準(zhǔn)確，但待檢樣品需經(jīng)一系列的預(yù)處理，繁瑣費(fèi)時(shí)，還必須有相應(yīng)的價(jià)格昂貴的儀器設(shè)備。一般在大型實(shí)驗(yàn)室使用，適合于精確測定。3.2 生化免疫法目前應(yīng)用的生化免疫分析技術(shù)，是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)

16、為基礎(chǔ)的分析技術(shù)。其基本原理是抗原抗體的競爭性結(jié)合?？煞譃槊嘎?lián)免疫測定法（elisa）、熒光免疫測定法(fia)、免疫分析技術(shù)與常規(guī)理化分析技術(shù)聯(lián)用的方法等。酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)：以待測抗原（或抗體）與酶標(biāo)抗體（或抗原）的特異結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過酶活力測定來確定抗原（或抗體）含量。因?yàn)榻Y(jié)合了免疫反應(yīng)和酶催化反應(yīng)，所以是一種特異而又敏感的技術(shù)。yong jin運(yùn)用酶聯(lián)免疫法(elisa)對慶大霉素的檢測限度為0.5 ng/ml。bucknal等運(yùn)用免疫檢測法測定了在牛奶中幾種喹諾酮藥物的殘留量。酶聯(lián)免疫法測定，其敏感性和特異性好，檢測的靈敏度以普遍使用的- 內(nèi)酰胺類計(jì)：青霉素為5ppb

17、，阿莫西林為10ppb，氨芐西林為10ppb，頭孢西林為8ppb12。其檢測結(jié)果快速準(zhǔn)確，9分鐘內(nèi)即可檢測出牛奶中-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、磺胺類等抗生素的殘留含量，可監(jiān)控牧場用藥的情況。熒光免疫測定(fia)法原理是應(yīng)用一對單克隆抗體的夾心法。底物用磷酸-4-甲基傘形酮，檢測產(chǎn)物發(fā)出的熒光，熒光強(qiáng)度與抗原抗體復(fù)合物(mb)濃度呈正比，可在8min內(nèi)得出結(jié)果。結(jié)果以mb每小時(shí)釋放的速率表示 (mb)表示。huth 已經(jīng)用熒光免疫法測定了牛奶中的6種-內(nèi)酰胺類抗生素，得到它們的最低檢測限為：青霉素g3.2g/kg、氨芐青霉素2.9g/kg、羥氨芐青霉素 3.6g/kg、頭孢匹林16.3g/kg；該法

18、重復(fù)性好，具有快速、敏感、準(zhǔn)確的特點(diǎn)13。生化免疫法測定抗生素殘留靈敏度極高，達(dá)到ng級水平；檢測快速、專一性強(qiáng)。由于此法的高度專一性，每檢測一種抗生素就要制備或購買相應(yīng)的抗原或抗體，導(dǎo)致檢測費(fèi)用較高。因此生化免疫檢測法不可能取代色譜或光譜等常規(guī)分析方法，只能作為其重要的補(bǔ)充。4 專一試劑盒法eclipse試劑盒的原理是含有芽孢桿菌的瓊脂培養(yǎng)基和ph指示劑，當(dāng)在(65±1)下培養(yǎng)時(shí)，孢子發(fā)育生長，降低培養(yǎng)基ph值，在ph指示劑的作用下，藍(lán)(紫)色變?yōu)榫G-黃色。生鮮牛乳中的抗生素殘留使微生物生長和酸的產(chǎn)生受到抑制，由于沒有酸生成，顏色將不會改變。 eclipse試劑盒有eclipse5

19、0和eclipse100兩種試劑盒。eclipse50的精確度雖然沒有eclipse100的高，但其檢測限都符合歐盟標(biāo)準(zhǔn)，彌補(bǔ)了快速方法只能單一檢測某類抗生素的缺陷，同時(shí)提高了檢測的廣譜性和高靈敏度，同時(shí)也可以同歐盟等國家的先進(jìn)檢測技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)接軌我國的牛奶事業(yè)提供非常有效和準(zhǔn)確的抗生素殘留檢測方法14。操作簡單。，靈活性強(qiáng)，無需對樣品進(jìn)行任何的處理，只需嚴(yán)格按照說明書上規(guī)定的方法進(jìn)行操作，就能獲得理想的效果，且不易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，被檢樣品的需要量少，且費(fèi)用低，越來越被廣泛應(yīng)用。乳制品抗生素殘留的檢測方法很多，有的操作煩瑣,有的實(shí)驗(yàn)條件要求高，有的檢驗(yàn)時(shí)間太長；這些不僅會給乳制品生產(chǎn)企業(yè)造成經(jīng)濟(jì)

20、上和時(shí)間上的損失，而且檢測結(jié)果常常會被原輔材料和人為操作等因素所影響。牛奶中抗生素殘留是涉及人類健康的公共衛(wèi)生問題，開發(fā)出越來越準(zhǔn)確、快速，誤差越來越小的檢測方法，方便地檢出乳和乳制品中抗生素殘留，凈化消費(fèi)環(huán)璄，就能為居民的身心健康提供保障，促進(jìn)中國乳業(yè)健康發(fā)展。中國乳制品行業(yè)起步晚，起點(diǎn)低，但發(fā)展迅速。特別是改革開放以來，奶類生產(chǎn)量以每年兩位數(shù)的增長幅度迅速增加，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于1%的同期世界平均水平。中國乳制品產(chǎn)量和總產(chǎn)值在最近的10年內(nèi)增長了10倍以上，已逐漸吸引了世界的眼光， 我國乳業(yè)資源存量和發(fā)展?jié)摿薮?，世界乳業(yè)的發(fā)展態(tài)勢表明，我國已成為全球乳業(yè)未來發(fā)展的增長點(diǎn)15。盡管2004年我國乳業(yè)

21、遭遇了伊利折帥、蒙牛遇誹、完達(dá)山內(nèi)訌、三鹿蒙冤、三元虧損換帥，以及“倒奶”事件、阜陽“毒奶粉”事件等等，但也應(yīng)該看到意大利帕瑪拉特、法國達(dá)能、美國卡夫、英國聯(lián)合利華、荷蘭菲仕等世界乳業(yè)巨頭已先后退出中國市場16。我國日益注重科技創(chuàng)新帶來利潤增長，截止2004年，伊利、三元都擁有了國家級技術(shù)中心。隨著中國乳品市場的漸趨成熟，乳品企業(yè)的品牌定位日益明確，將持續(xù)拉動市場需求，乳業(yè)的發(fā)展前景依然廣闊17。參考文獻(xiàn)1 趙志華.淺析乳業(yè)現(xiàn)狀、潛在發(fā)展瓶頸及對策.中國乳品工  業(yè)，2004，1（32）：55-58.2 苑翠柳.乳品的營養(yǎng)保健與國際市場發(fā)展趨勢.山東食品科  技，2003，

22、2：1-2.3宮春波，張永翠.牛初乳中的營養(yǎng)成分及其保健功能.中國奶牛，2000，6：44.4李志才，王寶軍.新型乳品多功能免疫牛乳.中國乳業(yè)，2003,4:27-29.5shenghui cui, jingyun li, changqin hu,et al. development of a method for the detection of -lactamases in milk samplesj.cui et al:journal of aoac international, 2007, 90 (4): 1128-1130.6盧兆蕓.乳和乳制品中抗生素殘留的危害及檢測方法j.中國乳品

23、工業(yè),2006,34(11):43-45.7marchetti m,schwaiger i,schmid e r.determination of benzylpenicillin, oxacillin,cloxacillin,and dicloxacillin in cows' milk by ion-pair high-performance liquid chromatography afterprecolumn derivatizationj.fresenius j anal chem,2001, (371):64-67.8b. linage,c. gonzalo,j. a.

24、carriedo,etcperformance of blue-yellow screening test for antimicrobial detection in ovine milkj. journal of dairy science 2007 ,90(12):5374-5379.9蔡穎, 韓奕奕,何志軍.反相高效液相色譜法測定乳制品中土霉素、四環(huán)素和金霉素殘留量j.化學(xué)世界,2006,(7):398-400.10j. wang and d. leung analyses of macrolide antibiotic residues in eggs, raw milk, and honey using both ultra-performance liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spe