第五章2酵母基因工程927

1、二、酵母基因工程二、酵母基因工程酵母菌作為外源基因表達受體菌的特征酵母菌作為外源基因表達受體菌的特征酵母菌的宿主系統(tǒng)酵母菌的宿主系統(tǒng)酵母菌的載體系統(tǒng)酵母菌的載體系統(tǒng)酵母菌的轉化系統(tǒng)酵母菌的轉化系統(tǒng)酵母菌的表達系統(tǒng)酵母菌的表達系統(tǒng)利用重組酵母生產乙肝疫苗利用重組酵母生產乙肝疫苗1996 完成第一個真核生物完成第一個真核生物-釀酒酵母全基因組測序。釀酒酵母全基因組測序。1974 clarck-walker和和miklos發(fā)現(xiàn)在多數(shù)釀酒酵母發(fā)現(xiàn)在多數(shù)釀酒酵母 中存在質粒。中存在質粒。1978 hinnen將來自一株釀酒酵母的將來自一株釀酒酵母的leu2基因導入基因導入 另一株釀酒酵母，彌補了后者另一

2、株釀酒酵母，彌補了后者leu2的缺陷，的缺陷， 標志著酵母表達系統(tǒng)建立。標志著酵母表達系統(tǒng)建立。1981 hitzeman用釀酒酵母成功表達人用釀酒酵母成功表達人ifn。1983 我國首次用酵母菌表達我國首次用酵母菌表達hbv hbsag基因?；?。（一）酵母菌作為外源基因表達受體菌的特征（一）酵母菌作為外源基因表達受體菌的特征 酵母菌酵母菌(yeast)是一群以芽殖或裂殖方式是一群以芽殖或裂殖方式進行無性繁殖的單細胞真核生物。進行無性繁殖的單細胞真核生物。 如果說如果說e.coli是外源基因最成熟的是外源基因最成熟的原核生物表達系統(tǒng)，原核生物表達系統(tǒng)，yeast則是則是最成熟最成熟的真核生物

3、表達系統(tǒng)的真核生物表達系統(tǒng)。酵母菌表達外源基因的優(yōu)勢：酵母菌表達外源基因的優(yōu)勢：全基因組測序，基因表達調控機理清楚，遺傳全基因組測序，基因表達調控機理清楚，遺傳操作簡便。操作簡便。具有真核生物蛋白翻譯后加工修飾系統(tǒng)。具有真核生物蛋白翻譯后加工修飾系統(tǒng)。大規(guī)模發(fā)酵工藝簡單、成本低廉。大規(guī)模發(fā)酵工藝簡單、成本低廉。不含特異性病毒、不產毒素，被美國不含特異性病毒、不產毒素，被美國fda認定為認定為安全的基因工程受體系統(tǒng)。安全的基因工程受體系統(tǒng)。能將外源基因表達產物分泌至培養(yǎng)基中。能將外源基因表達產物分泌至培養(yǎng)基中。 表達產物的糖基化位點和結構特點表達產物的糖基化位點和結構特點與高等真核生物有差距。與

4、高等真核生物有差距。酵母菌表達外源基因的缺點：酵母菌表達外源基因的缺點：（二）酵母菌的宿主系統(tǒng)（二）酵母菌的宿主系統(tǒng)用作模式真核生物的酵母宿主菌用作模式真核生物的酵母宿主菌用于外源基因表達的酵母宿主菌用于外源基因表達的酵母宿主菌提高重組蛋白表達產率的突變宿主菌提高重組蛋白表達產率的突變宿主菌抑制超糖基化作用的突變宿主菌抑制超糖基化作用的突變宿主菌減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌1、用作模式真核生物的酵母宿主菌、用作模式真核生物的酵母宿主菌基因表達調控機理與高等真核類似?；虮磉_調控機理與高等真核類似。釀酒酵母釀酒酵母(saccharomyces ce

5、reviasiae)：無性繁殖（芽殖或裂殖）、單細胞、無性繁殖（芽殖或裂殖）、單細胞、真核生物；真核生物；繁殖方式與原核類似，易于操作；繁殖方式與原核類似，易于操作；釀酒酵母釀酒酵母(saccharomyces cerevisiae)：最成熟的真核細胞表達系統(tǒng)；最成熟的真核細胞表達系統(tǒng)；表達水平低；表達水平低；產物過度糖基化。產物過度糖基化。2、用于外源基因表達的酵母宿主菌、用于外源基因表達的酵母宿主菌巴斯德畢赤酵母巴斯德畢赤酵母 (pichia pastoris)多形漢遜酵母多形漢遜酵母 (hansenula polymorpha)甲醇酵母：甲醇酵母：可利用甲醇作為唯一碳源；可利用甲醇作為唯

6、一碳源；表達水平高；表達水平高；產物糖基化更合理。產物糖基化更合理。 特點：特點：乳酸克魯維酵母乳酸克魯維酵母(kluyveromyces lactis)非洲酒裂殖酵母非洲酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)其它酵母：其它酵母： 已有已有60多種酵母菌建立了轉化系統(tǒng)。多種酵母菌建立了轉化系統(tǒng)。 釀酒酵母的遺傳學和分子生物學釀酒酵母的遺傳學和分子生物學研究最詳盡，但研究最詳盡，但巴斯德畢赤酵母巴斯德畢赤酵母表達表達外源基因最理想。外源基因最理想。3、提高外源蛋白表達產率的突變宿主菌、提高外源蛋白表達產率的突變宿主菌能提高外源基因表達或分泌的突變類型能提高外源基因表達或

7、分泌的突變類型改善外源蛋白分泌改善外源蛋白分泌 提高外源基因表達提高外源基因表達提高外源基因表達提高外源基因表達提高外源基因表達提高外源基因表達改善外源蛋白分泌改善外源蛋白分泌提高外源基因表達提高外源基因表達 突變類型突變類型 生物效應生物效應 作用位點作用位點ssc1 ssc2 rgr1ose1ssc11 rho鈣離子依賴型鈣離子依賴型atp酶酶轉錄后加工轉錄后加工轉錄水平轉錄水平轉錄水平轉錄水平羧肽酶羧肽酶y轉錄水平轉錄水平如如： rho突變株突變株中人溶菌酶表達量提高中人溶菌酶表達量提高10倍。倍。4、抑制超糖基化的突變宿主菌、抑制超糖基化的突變宿主菌措施：措施：構建超糖基化缺陷突變株。

8、構建超糖基化缺陷突變株。 酵母菌普遍擁有蛋白質糖基化系統(tǒng)，酵母菌普遍擁有蛋白質糖基化系統(tǒng)，但野生型酵母菌對外源蛋白的糖基化反應但野生型酵母菌對外源蛋白的糖基化反應很難控制，呈很難控制，呈超糖基化超糖基化傾向。傾向。 抑制超糖基化的突變類型抑制超糖基化的突變類型mnn 甘露糖生物合成缺陷甘露糖生物合成缺陷alg asn側鏈糖基化缺陷側鏈糖基化缺陷och 外側糖鏈添加缺陷外側糖鏈添加缺陷突變類型突變類型 生物效應生物效應如：如：人人 1-抗胰蛋白酶、人抗胰蛋白酶、人tpa在釀酒酵母在釀酒酵母 mnn9和和och1突變株中高活性表達。突變株中高活性表達。5、減少泛素依賴型蛋白降解的突變宿主菌、減少泛

9、素依賴型蛋白降解的突變宿主菌泛素介導的蛋白質降解作用泛素介導的蛋白質降解作用hooc泛素泛素 76aa lys靶蛋白靶蛋白lys靶蛋白靶蛋白泛素連接酶泛素連接酶e3lys靶蛋白靶蛋白泛素連接酶泛素連接酶e3蛋白蛋白酶體酶體靶蛋白降解靶蛋白降解泛素釋放泛素釋放酵母菌泛素依賴型蛋白降解系統(tǒng)的編碼基因：酵母菌泛素依賴型蛋白降解系統(tǒng)的編碼基因：ubi1 編碼泛素編碼泛素-羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白52 對數(shù)生長期表達對數(shù)生長期表達 穩(wěn)定期關閉穩(wěn)定期關閉ubi2 編碼泛素編碼泛素-羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白52 對數(shù)生長期表達對數(shù)生長期表達 穩(wěn)定期關閉穩(wěn)定期關閉ubi3 編碼泛素編碼泛素-羧基延伸蛋白羧基延

10、伸蛋白76 對數(shù)生長期表達對數(shù)生長期表達 穩(wěn)定期關閉穩(wěn)定期關閉ubi4 編碼泛素五聚體編碼泛素五聚體 對數(shù)生長期關閉對數(shù)生長期關閉 穩(wěn)定期表達穩(wěn)定期表達酵母菌有酵母菌有4個泛素編碼基因個泛素編碼基因：酵母菌有酵母菌有7個泛素連接酶基因個泛素連接酶基因：ubc1、ubc2、ubc3、ubc4、ubc5、ubc6、ubc7泛素降解途徑衰減的釀酒酵母泛素降解途徑衰減的釀酒酵母ubi4缺陷型：缺陷型： 在釀酒酵母菌中，泛素主要由在釀酒酵母菌中，泛素主要由ubi4基因基因表達。表達。 ubi4突變株能正常生長，但細胞內游離突變株能正常生長，但細胞內游離泛素分子的濃度比野生株低得多，是外源基泛素分子的濃度

11、比野生株低得多，是外源基因表達的理想受體。因表達的理想受體。uba1缺陷型：缺陷型： uba1編碼泛素激活酶編碼泛素激活酶e1，是一種看，是一種看家基因。家基因。 uba1突變株是致死性的，但其等位突變株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，且能削弱泛素介基因缺陷是非致死性的，且能削弱泛素介導的蛋白降解。導的蛋白降解。ubc4-ubc5雙突變型：雙突變型： ubc4-ubc5雙突變型雙突變型能能大幅度大幅度削弱泛削弱泛素介導的蛋白降解。素介導的蛋白降解。 7個泛素連接酶基因的突變對衰減蛋白個泛素連接酶基因的突變對衰減蛋白降解作用同樣有效。降解作用同樣有效。（三）（三） 酵母菌的載體系統(tǒng)酵母

12、菌的載體系統(tǒng)酵母附加型質粒（酵母附加型質粒（yep）酵母復制型質粒（酵母復制型質粒（yrp）酵母著絲粒質粒（酵母著絲粒質粒（ycp)酵母人工染色體（酵母人工染色體（yac）酵母整合型質粒（酵母整合型質粒（yip）2 質粒（釀酒酵母質粒（釀酒酵母）人工構建質粒：人工構建質粒：野生型質粒：野生型質粒：釀酒酵母中的釀酒酵母中的2 環(huán)狀質粒：環(huán)狀質粒：rafrep1stborirep2flpirira野生型，雙鏈、環(huán)狀，野生型，雙鏈、環(huán)狀，6kb，拷貝數(shù)拷貝數(shù)50-100。同源重組同源重組birs: 反向重復序列，同源重組反向重復序列，同源重組flp: 編碼產物驅動編碼產物驅動irs同源重組同源重組r

13、ep: 編碼產物控制質粒穩(wěn)定性編碼產物控制質粒穩(wěn)定性stb: rep結合位點結合位點含有多個單一酶切位點，便于克隆操作；含有多個單一酶切位點，便于克隆操作；人工構建酵母質粒的共同特點：人工構建酵母質粒的共同特點：含有含有e.coli質粒復制起點，便于克隆操作；質粒復制起點，便于克隆操作；含有在酵母和含有在酵母和e.coli中進行選擇的雙標記；中進行選擇的雙標記；除除yip型質粒外均為穿梭載體。型質粒外均為穿梭載體。yep質粒：質粒：復制子：源自復制子：源自2 質粒；質粒；拷貝數(shù)：拷貝數(shù)：50-100；不穩(wěn)定：培養(yǎng)幾代后不穩(wěn)定：培養(yǎng)幾代后，質粒丟失率高達，質粒丟失率高達50-70%，主要由于，主

14、要由于分配不均勻所致。分配不均勻所致。yrp質粒：質粒：不穩(wěn)定：培養(yǎng)幾代后，不穩(wěn)定：培養(yǎng)幾代后，質粒丟失率高達質粒丟失率高達50-70%，主要由分配不均，主要由分配不均勻所致。勻所致。復制子：源自酵母染色體的復制子：源自酵母染色體的ars； ars: auto replication sequence拷貝數(shù)：拷貝數(shù)：50-100；ycp質粒：質粒：拷貝數(shù)：拷貝數(shù)：1-5。在在yrp中引入中引入cen；cen：著絲粒，源自酵母：著絲粒，源自酵母3號染色體，有絲分裂穩(wěn)號染色體，有絲分裂穩(wěn)定，拷貝數(shù)低。定，拷貝數(shù)低。復制子：源自酵母染色體復制子：源自酵母染色體 的的ars；yac質粒：質粒：用于大型

15、基因文庫用于大型基因文庫構建。構建。在在ycp中引入中引入tel；tel：端粒，：端粒，酵母酵母染色體染色體末 端 序 列 ， 利 于 線 性末 端 序 列 ， 利 于 線 性dna末端穩(wěn)定；末端穩(wěn)定；穩(wěn)定性穩(wěn)定性隨著插入隨著插入dna片片段的增大而增加；段的增大而增加；yip質粒：質粒：拷貝數(shù)：通常為拷貝數(shù)：通常為1只有只有e.coli的復制子；的復制子；引入酵母基因組的同源引入酵母基因組的同源序列：以標記基因序列：以標記基因his3 5和和3端作同源序列；端作同源序列；載體以同源重組方式，載體以同源重組方式，整合整合入酵母基因組；入酵母基因組；（四）酵母菌的轉化系統(tǒng)（四）酵母菌的轉化系統(tǒng)轉

16、化質粒在酵母細胞中的命運轉化質粒在酵母細胞中的命運酵母菌的轉化方法酵母菌的轉化方法用于轉化子篩選的標記基因用于轉化子篩選的標記基因酵母菌的轉化方法酵母菌的轉化方法原生質體轉化法原生質體轉化法堿金屬離子介導轉化法堿金屬離子介導轉化法電擊轉化法電擊轉化法原生質體轉化法原生質體轉化法 在在ca2+和和peg存在下，轉化子可達原生質存在下，轉化子可達原生質體總數(shù)的體總數(shù)的1-2%。對線型和環(huán)狀對線型和環(huán)狀dna的吸收沒有特異性。的吸收沒有特異性。1個受體細胞可同時接納多個質粒分子，這種個受體細胞可同時接納多個質粒分子，這種共轉化共轉化的原生質體占轉化子總數(shù)的的原生質體占轉化子總數(shù)的25-33%；特點：

17、特點：原生質體轉化法的缺點原生質體轉化法的缺點：轉化率受原生質再生率的嚴重制約。轉化率受原生質再生率的嚴重制約。操作周期長；操作周期長；2）堿金屬離子介導轉化法）堿金屬離子介導轉化法 酵母菌酵母菌完整細胞完整細胞經堿金屬離子經堿金屬離子(如如li+)、peg、熱休克處理后，可高效吸收質粒、熱休克處理后，可高效吸收質粒dna。吸收線型吸收線型dna的能力明顯大于環(huán)狀的能力明顯大于環(huán)狀dna，二者相差二者相差80倍。倍。共轉化現(xiàn)象極為罕見；共轉化現(xiàn)象極為罕見；特點：特點：3）電擊轉化法）電擊轉化法適用范圍廣。適用范圍廣。 酵母菌酵母菌完整細胞完整細胞或或原生質體原生質體可在可在電擊下吸收質粒電擊下

18、吸收質粒dna。特性：特性：轉化率高；轉化率高；操作方便；操作方便；轉化質粒在酵母細胞中的命運轉化質粒在酵母細胞中的命運1）單、雙鏈）單、雙鏈dna均可轉化酵母菌，單鏈的均可轉化酵母菌，單鏈的轉化率是雙鏈的轉化率是雙鏈的10-30倍。倍。2）含復制子含復制子的單鏈質粒進入細胞后，能準的單鏈質粒進入細胞后，能準確地轉化為雙鏈并復制。確地轉化為雙鏈并復制。3）不含復制子不含復制子的單鏈質粒進入細胞后，能的單鏈質粒進入細胞后，能高效地同源整合入染色體，這對體內定點高效地同源整合入染色體，這對體內定點突變酵母基因組極有利。突變酵母基因組極有利。4）克隆在整合型質粒）克隆在整合型質粒yip上的外源基因，

19、若上的外源基因，若含受體細胞染色體含受體細胞染色體dna的同源序列，會發(fā)生的同源序列，會發(fā)生高頻同源整合，整合子占轉化子的高頻同源整合，整合子占轉化子的50-80%。用于轉化子篩選的標記基因用于轉化子篩選的標記基因營養(yǎng)缺陷型互補基因營養(yǎng)缺陷型互補基因顯性基因顯性基因宿主菌：宿主菌：氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突變氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突變 如：如：leu-、trp-、his-、ura-營養(yǎng)缺陷型互補基因營養(yǎng)缺陷型互補基因載體：載體：攜帶相應的合成基因攜帶相應的合成基因 如：如：leu1/leu2、trp1、his3/his4、ura3選擇壓力：選擇壓力：不完全培養(yǎng)基不完全培養(yǎng)基 如：如：

20、ynb、無機鹽培養(yǎng)基、無機鹽培養(yǎng)基顯性標記基因編碼產物主要是毒性物質的抗性蛋白。顯性標記基因編碼產物主要是毒性物質的抗性蛋白。顯性標記基因顯性標記基因氨基糖苷轉移酶氨基糖苷轉移酶 抗抗g418氯霉素乙酰轉移酶氯霉素乙酰轉移酶 抗氯霉素抗氯霉素二氫葉酸還原酶二氫葉酸還原酶 抗氨甲喋呤和磺胺抗氨甲喋呤和磺胺銅離子螯合物銅離子螯合物 耐受銅離子耐受銅離子蔗糖轉化酶蔗糖轉化酶 耐受高濃度蔗糖耐受高濃度蔗糖乙酰乳糖合成酶乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草劑抗硫酰脲除草劑標記基因標記基因 編碼產物編碼產物 遺傳表型遺傳表型 aph cat dhfr cup1 suc2 ilv2 （五）酵母菌的表達系統(tǒng)（五）酵母

21、菌的表達系統(tǒng)釀酒酵母表達系統(tǒng)釀酒酵母表達系統(tǒng)甲醇酵母表達系統(tǒng)甲醇酵母表達系統(tǒng)1、釀酒酵母表達系統(tǒng)、釀酒酵母表達系統(tǒng)釀酒酵母系統(tǒng)啟動子釀酒酵母系統(tǒng)啟動子釀酒酵母密碼子的偏愛性釀酒酵母密碼子的偏愛性釀酒酵母分泌系統(tǒng)釀酒酵母分泌系統(tǒng)釀酒酵母糖基化系統(tǒng)釀酒酵母糖基化系統(tǒng)釀酒酵母表達系統(tǒng)存在的問題釀酒酵母表達系統(tǒng)存在的問題1）釀酒酵母系統(tǒng)啟動子）釀酒酵母系統(tǒng)啟動子uas：上游激活序列：上游激活序列 tata盒盒：富含：富含at urs：上游阻遏序列：上游阻遏序列 das：下游激活序列：下游激活序列uasurstata起始起始位點位點編碼序列編碼序列mrna40-120bp20-40bp100-1400b

22、pdas甘油醛甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因磷酸脫氫酶基因(gapdh)磷酸甘油激酶基因磷酸甘油激酶基因(pkg)乙醇脫氫酶基因乙醇脫氫酶基因(adh)釀酒酵母表達系統(tǒng)常用啟動子：釀酒酵母表達系統(tǒng)常用啟動子： 糖酵解途徑中關鍵酶的強啟動子，受糖酵解途徑中關鍵酶的強啟動子，受葡萄糖誘導：葡萄糖誘導： 半乳糖激酶啟動子半乳糖激酶啟動子(gal1)野生型野生型gal4表達水平低，產物活性可被表達水平低，產物活性可被glal80產物產物完全抑制，半乳糖誘導效果差。完全抑制，半乳糖誘導效果差。gal1gal7gal10uasgal4gal80gal1、gal7和和gal10基因連鎖在一起，獨立轉錄，基因連鎖

23、在一起，獨立轉錄，共同調控；共同調控；gal4產物與產物與uas結合，促進轉錄；結合，促進轉錄；gal80產物抑制產物抑制gal4產物的活性，阻遏轉錄；產物的活性，阻遏轉錄；半乳糖誘導半乳糖誘導gal4高表達，不受高表達，不受gal80產物抑制，產物抑制，激活激活gal1、gal7、gal10等高效轉錄。等高效轉錄。pgal10gal1gal7gal10uasgal4gal80將將gal4的啟動子換成的啟動子換成gal10的誘導型強啟動子；的誘導型強啟動子；pho5啟動子在培養(yǎng)基磷酸鹽耗盡時，啟動轉錄；啟動子在培養(yǎng)基磷酸鹽耗盡時，啟動轉錄；pho4ts 溫度敏感，溫度敏感，35時失活，時失活，

24、pho5關閉；關閉；pho4ts-pho5啟動子通過啟動子通過降溫降溫(23)誘導誘導表達。表達。pho4基因編碼產物是基因編碼產物是pho5啟動子的正調控因子；啟動子的正調控因子； pho4ts-pho5啟動子啟動子2）酵母菌對密碼子的偏愛性）酵母菌對密碼子的偏愛性 甘油醛甘油醛-3-磷酸脫氫酶磷酸脫氫酶(gapdh)磷酸甘油激酶磷酸甘油激酶(pkg)乙醇脫氫酶乙醇脫氫酶(adh) 在釀酒酵母中，高豐度蛋白質在釀酒酵母中，高豐度蛋白質96%以上以上的氨基酸由的氨基酸由25個密碼子編碼，個密碼子編碼，如：如：性結合因子：性結合因子：mf- 酸性磷酸酯酶：酸性磷酸酯酶：pho5蔗糖酶：蔗糖酶：s

25、uc2殺手毒素因子：殺手毒素因子：kil3）釀酒酵母分泌系統(tǒng)）釀酒酵母分泌系統(tǒng)釀酒酵母系統(tǒng)常用分泌信號肽來源：釀酒酵母系統(tǒng)常用分泌信號肽來源：釀酒酵母釀酒酵母信號肽特點：信號肽特點：保守性低，大多異源宿主系統(tǒng)的信號肽保守性低，大多異源宿主系統(tǒng)的信號肽不能互用；不能互用；信號肽結構：信號肽結構： 正電荷區(qū)正電荷區(qū) 疏水區(qū)疏水區(qū)極性區(qū)極性區(qū)met 目的蛋白目的蛋白信號肽剪切位點信號肽剪切位點mf- 信號肽：信號肽：88個殘基組成。個殘基組成。 met目的蛋白目的蛋白-lys-arg-glu-ala-glu-ala-kex2dapdapdap：ste13編碼的二肽酶編碼的二肽酶分泌效率高；分泌效率高

26、；在酵母系統(tǒng)具有通用性；在酵母系統(tǒng)具有通用性；對對thr/ser的羥基氧進行糖基化。的羥基氧進行糖基化。 4）釀酒酵母糖基化系統(tǒng)）釀酒酵母糖基化系統(tǒng)糖基化位點：糖基化位點：asn天冬酰胺天冬酰胺-x-thr/ser （x代表任何氨基酸）代表任何氨基酸） 對對asn的酰胺氮進行糖基化，對蛋白質的的酰胺氮進行糖基化，對蛋白質的折疊、穩(wěn)定性及活性較重要。折疊、穩(wěn)定性及活性較重要。n型糖基化型糖基化：o型糖基化型糖基化： o型糖鏈僅由甘露糖組成（哺乳動物細胞型糖鏈僅由甘露糖組成（哺乳動物細胞的還含唾液酸基團）。的還含唾液酸基團）。酵母菌糖基化特點：酵母菌糖基化特點： n型或型或o型糖基的外鏈進一步形成

27、龐大的、型糖基的外鏈進一步形成龐大的、由甘露糖組成的復雜分支結構，會增加免疫原由甘露糖組成的復雜分支結構，會增加免疫原性、影響活性和藥代穩(wěn)定性。性、影響活性和藥代穩(wěn)定性。過糖基化：過糖基化：糖鏈組成：糖鏈組成：5）釀酒酵母表達系統(tǒng)的缺陷）釀酒酵母表達系統(tǒng)的缺陷不能利用簡單的無機培養(yǎng)基進行高密度發(fā)酵。不能利用簡單的無機培養(yǎng)基進行高密度發(fā)酵。表達載體傳代不穩(wěn)定（表達載體傳代不穩(wěn)定（yep、yrp）；）；所采用的強啟動子調控不嚴謹；所采用的強啟動子調控不嚴謹； 表達水平普遍不高：表達水平普遍不高： 表達產物過糖基化。表達產物過糖基化。2、甲醇酵母表達系統(tǒng)、甲醇酵母表達系統(tǒng)甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子甲

28、醇酵母與甲醇氧化酶啟動子甲醇酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點甲醇酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點甲醇酵母表達系統(tǒng)操作原理甲醇酵母表達系統(tǒng)操作原理甲醇酵母系統(tǒng)高效表達影響因素與對策甲醇酵母系統(tǒng)高效表達影響因素與對策1）甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子）甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子甲醇酵母甲醇酵母（methylotrophic yeast)： 可利用甲醇作為單一碳源的一類酵母?？衫眉状甲鳛閱我惶荚吹囊活惤湍?。巴斯德畢赤酵母巴斯德畢赤酵母（pichia pastoris)多形漢遜酵母多形漢遜酵母（hansenula ploymorpha)博伊丁假絲酵母博伊丁假絲酵母（candia boidinii) 畢赤酵母畢赤酵母/假絲酵母假

29、絲酵母 漢遜酵母漢遜酵母 醇氧化酶醇氧化酶 甲醇氧化酶甲醇氧化酶alcohol oxidase, aox methanol oxidase, mox aox1、aox2 mox 名稱和拷貝數(shù)不同。名稱和拷貝數(shù)不同。甲醇氧化酶：甲醇氧化酶：甲醇代謝關鍵酶，占可溶蛋白的甲醇代謝關鍵酶，占可溶蛋白的30%以上；以上；aox1占主導地位，負責占主導地位，負責aox 99%以上活性。以上活性。aox1與與aox2：畢赤酵母和假絲酵母基因組中存在畢赤酵母和假絲酵母基因組中存在2個個aox基因：基因：aox1、aox2；aox1與與aox2基因基因97%同源；同源；甲醇氧化酶啟動子：甲醇氧化酶啟動子：目前已

30、發(fā)現(xiàn)的、最強的真核啟動子；目前已發(fā)現(xiàn)的、最強的真核啟動子；aox1：葡萄糖和甘油阻遏、甲醇誘導：葡萄糖和甘油阻遏、甲醇誘導mox：葡萄糖阻遏、甘油脫阻遏、甲醇誘導：葡萄糖阻遏、甘油脫阻遏、甲醇誘導 嚴謹調控型啟動子：嚴謹調控型啟動子： 當甘油被消耗盡時，加入甲醇，誘導重組當甘油被消耗盡時，加入甲醇，誘導重組蛋白的表達。蛋白的表達。 畢赤酵母的發(fā)酵過程：畢赤酵母的發(fā)酵過程：成長期成長期：誘導期誘導期：過渡期過渡期：以甘油為碳源，目的是收獲一定的菌量。以甘油為碳源，目的是收獲一定的菌量。 不加碳源，目的是消耗掉甘油，解除其對不加碳源，目的是消耗掉甘油，解除其對aox1啟動子的阻遏。啟動子的阻遏。優(yōu)

31、點：優(yōu)點：aox1啟動子啟動子是目前最強、調控機理最嚴格的是目前最強、調控機理最嚴格的啟動子之一，啟動子之一，甲醇甲醇可嚴格調控外源基因表達可嚴格調控外源基因表達；2）甲醇酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點）甲醇酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點表達水平高；表達水平高；產物可產物可翻譯后修飾：糖基化、磷酸化、脂?；?；翻譯后修飾：糖基化、磷酸化、脂?；?；實驗室和工業(yè)操作簡單。實驗室和工業(yè)操作簡單。產物可正確折疊和高效分泌；產物可正確折疊和高效分泌；過糖基化程度比釀酒酵母少（過糖基化程度比釀酒酵母少（8-15個個vs100-150個甘露糖）；個甘露糖）；可利用簡單無機鹽培養(yǎng)基高密度發(fā)酵；可利用簡單無機鹽培養(yǎng)基高密度發(fā)酵；不能

32、滿足結構要求嚴格的糖基化；不能滿足結構要求嚴格的糖基化；缺點：缺點：載體在受體細胞有絲分裂時顯示出不穩(wěn)定性。載體在受體細胞有絲分裂時顯示出不穩(wěn)定性。3）甲醇酵母表達系統(tǒng)操作原理）甲醇酵母表達系統(tǒng)操作原理宿主菌株與標記基因宿主菌株與標記基因甲醇酵母系統(tǒng)的整合事件甲醇酵母系統(tǒng)的整合事件胞內表達與分泌表達載體胞內表達與分泌表達載體宿主菌株與標記基因宿主菌株與標記基因二大宿主系統(tǒng)主要特點二大宿主系統(tǒng)主要特點畢赤酵母畢赤酵母 漢遜酵母漢遜酵母最適溫度最適溫度 30 37最適最適ph值值 4.5 4.5甘油阻遏甘油阻遏 是是 否否糖基化糖基化 部分過度部分過度 較正常較正常高密度發(fā)酵高密度發(fā)酵 100g/

33、l 100g/l 二大宿主系統(tǒng)主要選擇標記二大宿主系統(tǒng)主要選擇標記宿主宿主 選擇標記選擇標記畢赤酵母畢赤酵母 his4、g418、zeocin、cu2+漢遜酵母漢遜酵母 leu2、his3、ura3、g418畢赤酵母系統(tǒng)畢赤酵母系統(tǒng)主要宿主菌主要宿主菌宿主株宿主株 特特 點點y11430 野生型、野生型、mut+gs115 his4- 、mut+km71 his4-、aox1:arg4(aox1-)、muts smd1168 his4-、胞外蛋白酶缺陷，高分泌、胞外蛋白酶缺陷，高分泌mc1003 his4-、aox1-、aox2-，mut-mut表型與甲醇利用率表型與甲醇利用率mut aox1

34、基因基因 aox2基因基因 表型表型mut+ 存在存在 存在存在 正常型正常型muts 缺失缺失 存在存在 緩慢型緩慢型mut- 缺失缺失 缺失缺失 負型負型甲醇酵母系統(tǒng)的整合事件甲醇酵母系統(tǒng)的整合事件yrp型載體：型載體： 傳代不穩(wěn)定，傳代過程同源或非同源重傳代不穩(wěn)定，傳代過程同源或非同源重組，高選擇壓力迫使高拷貝數(shù)整合，可達組，高選擇壓力迫使高拷貝數(shù)整合，可達100拷貝?？截?。主要為單拷貝整合，主要為單拷貝整合，1-10%為多拷貝整合。為多拷貝整合。 yip型載體：型載體：在靶序列處線性化載體在靶序列處線性化載體dna，誘導同源重組；，誘導同源重組；有兩種整合模式：有兩種整合模式：插入插入

35、、取代取代；畢赤畢赤酵母系統(tǒng)酵母系統(tǒng)模式模式表達載體表達載體5aox1啟動子片段含啟動子片段含aox1啟動子，啟動子，在甲醇誘導下可啟動外源基因表達；在甲醇誘導下可啟動外源基因表達；mcs為外源基因的插入位點；為外源基因的插入位點；信號肽信號肽序列使外源蛋白分泌到發(fā)酵序列使外源蛋白分泌到發(fā)酵上清中，便于純化；上清中，便于純化；tt提供轉錄終止和提供轉錄終止和polya修飾信號；修飾信號；his4為營養(yǎng)缺陷型篩選標志，能與為營養(yǎng)缺陷型篩選標志，能與酵母染色體酵母染色體his4基因同源重組；基因同源重組；3aox1基因片段能與酵母染色體基因片段能與酵母染色體aox1基因同源重組；基因同源重組；am

36、p為載體在為載體在e.coli中的篩選標志；中的篩選標志；f1 ori為絲狀噬菌體的復制起點。為絲狀噬菌體的復制起點。 aox1位點插入位點插入 載體的載體的3aox1區(qū)與酵母基因組區(qū)與酵母基因組aox1基因的基因的末端發(fā)生整合重組。末端發(fā)生整合重組。 his4位點插入位點插入 載體的載體的his4區(qū)與酵母基因組區(qū)與酵母基因組his4基因的末端基因的末端發(fā)生整合重組。發(fā)生整合重組。 多基因插入事件（串聯(lián)整合）多基因插入事件（串聯(lián)整合） 基因取代（基因取代（gs115，aox1+）甲醇酵母系統(tǒng)甲醇酵母系統(tǒng)胞內表達胞內表達載體載體表達載體類型需帶入需帶入atg單位點單位點胞內表達與分泌表達載體胞內

37、表達與分泌表達載體甲醇酵母系統(tǒng)甲醇酵母系統(tǒng)胞內表達胞內表達載體載體表達載體類型需帶入需帶入atg多位點多位點甲醇酵母系統(tǒng)甲醇酵母系統(tǒng)分泌表達分泌表達載體載體信號肽：信號肽：pho1甲醇酵母系統(tǒng)甲醇酵母系統(tǒng)分泌表達分泌表達載體載體信號肽：信號肽：mf- ppic9載體的信號肽序列和多克隆位點載體的信號肽序列和多克隆位點4）甲醇酵母系統(tǒng)高效表達影響因素與對策）甲醇酵母系統(tǒng)高效表達影響因素與對策載體穩(wěn)定性載體穩(wěn)定性基因劑量基因劑量整合位點整合位點甲醇利用表型甲醇利用表型mrna 5端端at含量分泌信號含量分泌信號表達產物穩(wěn)定性表達產物穩(wěn)定性 載體穩(wěn)定性載體穩(wěn)定性采用采用yip型載體型載體: 更易實現(xiàn)

38、整合、整合位點清楚。更易實現(xiàn)整合、整合位點清楚。 同拷貝數(shù)時，整合型比自主復制型表達水平高。同拷貝數(shù)時，整合型比自主復制型表達水平高。yrp型載體的穩(wěn)定化：型載體的穩(wěn)定化： 選擇選擇-非選擇培養(yǎng)交替數(shù)十代可得穩(wěn)定的整非選擇培養(yǎng)交替數(shù)十代可得穩(wěn)定的整合子，但費時、整合位點不確定。合子，但費時、整合位點不確定。 基因劑量基因劑量構建高拷貝整合型表達載體。構建高拷貝整合型表達載體。外源基因表達存在基因劑量效應。外源基因表達存在基因劑量效應。篩選多拷貝整合子篩選多拷貝整合子 載體引入載體引入g418/zeocin抗性標記，整合子拷抗性標記，整合子拷貝數(shù)與抗性成正相關，采用高貝數(shù)與抗性成正相關，采用高g

39、418/zeocin抗性抗性轉化子。轉化子。體外串聯(lián)多個表達盒，直接獲多拷貝整合子；體外串聯(lián)多個表達盒，直接獲多拷貝整合子；采用采用yrp型載體穩(wěn)定化技術，獲高拷貝整合子型載體穩(wěn)定化技術，獲高拷貝整合子； 整合位點整合位點畢赤酵母中個別情況整合于畢赤酵母中個別情況整合于his4位點的比位點的比aox1位點的低。位點的低。外源基因表達盒整合于外源基因表達盒整合于aox/mox或標記或標記基因處，均可高效表達；基因處，均可高效表達； 甲醇利用表型甲醇利用表型 在分泌表達情況下，甲醇利用慢型在分泌表達情況下，甲醇利用慢型（muts）更利于表達。）更利于表達。 mrna 5端端應盡量避免在應盡量避免在

40、utr區(qū)出現(xiàn)區(qū)出現(xiàn)aug和次級結構。和次級結構。mrna 5端非翻譯區(qū)（端非翻譯區(qū)（utr）的組成與長度）的組成與長度應盡量與應盡量與aox1/mox的一致；的一致； aox1基因基因5-utr長長114nt，富含，富含a+u，其編碼的乙醇氧化酶表達量極高。其編碼的乙醇氧化酶表達量極高。 基因序列的基因序列的at含量含量 at含量越高，越容易出現(xiàn)類似于終止子含量越高，越容易出現(xiàn)類似于終止子的結構。的結構。 對對a+t含量豐富的基因，最好重新設計序含量豐富的基因，最好重新設計序列，使其列，使其(a+t)含量在含量在30-55范圍內。這種方范圍內。這種方法使人血清白蛋白法使人血清白蛋白(has)的

41、表達量提高的表達量提高50倍。倍。 分泌信號分泌信號可采用釀酒酵母來源的可采用釀酒酵母來源的mf- 、pho或或suc等的信號肽，或野生型信號肽，但要比較分等的信號肽，或野生型信號肽，但要比較分析適用性。析適用性。分泌表達效率與所用信號肽密切相關；分泌表達效率與所用信號肽密切相關；采用采用蛋白酶缺陷宿主株蛋白酶缺陷宿主株： 如如p.pastoris smd1168。 表達產物穩(wěn)定性表達產物穩(wěn)定性 分泌表達時，胞外蛋白酶是要影響因素。分泌表達時，胞外蛋白酶是要影響因素。降低培養(yǎng)基降低培養(yǎng)基ph值值： 蛋白酶在酸性條件下活性較低。蛋白酶在酸性條件下活性較低。向培養(yǎng)基中向培養(yǎng)基中添加蛋白胨添加蛋白胨

42、或或酪蛋白水解物酪蛋白水解物： 競爭性抑制蛋白酶活性。競爭性抑制蛋白酶活性。 目前，目前，20余種重組蛋白在余種重組蛋白在巴斯德畢赤酵母巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中成功表達，如：人血清白蛋白系統(tǒng)中成功表達，如：人血清白蛋白(hsa)、乙型肝炎表面抗原乙型肝炎表面抗原(hbsag)、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子(tnf)、表皮生長因子、表皮生長因子(egf)等。等。 數(shù)種重組蛋白在數(shù)種重組蛋白在多形漢遜酵母多形漢遜酵母表達系統(tǒng)中表達系統(tǒng)中成功表達，如成功表達，如hbsag。（六）利用重組酵母生產乙肝疫苗（六）利用重組酵母生產乙肝疫苗乙肝病毒的結構與性質乙肝病毒的結構與性質產乙肝表面抗原的重組釀酒酵母產乙肝表面抗原的重組釀酒酵母產乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母產乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母 由由乙肝病毒乙肝病毒（hbv）感染引起的急慢）感染引起的急慢性乙型肝炎是一種嚴重傳染病，每年約性乙型肝炎是一種嚴重傳染病，每年約200萬萬病人死亡，病人死亡，3億億人成為人成為hbv攜帶者，其中攜帶者，其中相當一部分人可能轉化為肝硬化或肝癌。相當一部分人可能轉化為肝硬化或肝癌。 利用酵母大規(guī)模利用酵母大規(guī)模生產乙肝疫苗為其應生產乙肝疫苗為其應用提供了保證