細(xì)胞工程植物細(xì)胞培養(yǎng)2

1、工業(yè)化植物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)主要有兩大類(lèi)：工業(yè)化植物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)主要有兩大類(lèi)： 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和固定化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和固定化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng) 植物細(xì)胞植物細(xì)胞植物細(xì)胞制備 機(jī)械法機(jī)械法 酶法酶法 愈傷組織誘導(dǎo)法愈傷組織誘導(dǎo)法 不斷繼代培養(yǎng)愈傷組織，通過(guò)流體剪切不斷繼代培養(yǎng)愈傷組織，通過(guò)流體剪切力和振動(dòng)，使植物細(xì)胞從結(jié)構(gòu)非常松散的愈傷力和振動(dòng)，使植物細(xì)胞從結(jié)構(gòu)非常松散的愈傷組織中釋放出來(lái)，得到懸浮的植物細(xì)胞組織中釋放出來(lái)，得到懸浮的植物細(xì)胞植物細(xì)胞分離植物細(xì)胞分離 -懸浮培養(yǎng)系建立懸浮培養(yǎng)系建立 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基組分調(diào)節(jié)培養(yǎng)基組分 疏松的愈傷組織疏松的愈傷組織 在液體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)若干次在液體

2、培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)若干次 建立穩(wěn)定的懸浮培養(yǎng)植物細(xì)胞系建立穩(wěn)定的懸浮培養(yǎng)植物細(xì)胞系 植物細(xì)胞特性植物細(xì)胞特性葉綠體葉綠體液泡液泡細(xì)胞核細(xì)胞核細(xì)胞膜細(xì)胞膜內(nèi)網(wǎng)質(zhì)膜內(nèi)網(wǎng)質(zhì)膜線粒體線粒體高爾基體高爾基體特特 性性微微 生生 物物植植 物物 細(xì)細(xì) 胞胞尺尺 寸寸2 2 u u m m 1 1 0 0 u u m m對(duì)對(duì) 剪剪 切切 力力 敏敏 感感程程 度度不不 敏敏 感感敏敏 感感含含 水水 量量7 7 5 5 % % 9 9 0 0 % %倍倍 增增 時(shí)時(shí) 間間 1 1 h h o o u u r rd d a a y y s s通通 氣氣 量量1 1 - - 2 2 v v v v m m（ 每每

3、 分分 鐘鐘 每每 培培 養(yǎng)養(yǎng)基基 體體 積積 的的 通通 氣氣 量量 ）0 0 . . 3 3 v v v v m m發(fā)發(fā) 酵酵 （ 或或 培培養(yǎng)養(yǎng) ） 時(shí)時(shí) 間間d d a a y y s sw w e e e e k k s s產(chǎn)產(chǎn) 物物 積積 累累 場(chǎng)場(chǎng) 所所培培 養(yǎng)養(yǎng) 基基液液 泡泡遺遺 傳傳 變變 種種 性性 能能可可 能能需需 要要培培 養(yǎng)養(yǎng) 基基 費(fèi)費(fèi) 用用( ( $ $ ) )8 8 - - 9 9 / / m m6 6 5 5 - - 7 7 0 0 / / m m與微生物的比較與微生物的比較植物細(xì)胞培養(yǎng)的人工環(huán)境植物細(xì)胞培養(yǎng)的人工環(huán)境物理因素物理因素 光光 ：光照時(shí)間與光

4、照強(qiáng)度視具體的植物光照時(shí)間與光照強(qiáng)度視具體的植物細(xì)胞的生理特性而定細(xì)胞的生理特性而定 溫度溫度：通常在：通常在25 c-28 c之間之間 ph ：56之間之間 氧：氧：好氧好氧 溶氧溶氧 ：溶氧濃度往往有最適范圍：溶氧濃度往往有最適范圍 碳源碳源 ：蔗糖作為碳源。：蔗糖作為碳源。 氮源氮源 ：含無(wú)機(jī)氮，如硝酸鹽和銨鹽等。有的細(xì)胞株還需要加入：含無(wú)機(jī)氮，如硝酸鹽和銨鹽等。有的細(xì)胞株還需要加入有機(jī)氮，如酵母提取液。有機(jī)氮，如酵母提取液。 植物激素植物激素：調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和次生物質(zhì)代謝，：調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和次生物質(zhì)代謝，iaa和和2,4-d 其它成分其它成分：如金屬離子和有機(jī)添加物：如金屬離子

5、和有機(jī)添加物植物細(xì)胞培養(yǎng)的人工環(huán)境植物細(xì)胞培養(yǎng)的人工環(huán)境化學(xué)因素化學(xué)因素植物細(xì)胞培養(yǎng)與次生代謝植物細(xì)胞培養(yǎng)與次生代謝 類(lèi)似于青霉素的生產(chǎn)，大多植物有效成分積累類(lèi)似于青霉素的生產(chǎn)，大多植物有效成分積累與細(xì)胞生長(zhǎng)非關(guān)聯(lián)，而往往在細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)平衡與細(xì)胞生長(zhǎng)非關(guān)聯(lián)，而往往在細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)平衡時(shí)開(kāi)始時(shí)開(kāi)始 次生代謝物積累于細(xì)胞胞內(nèi)的液泡中，分離提次生代謝物積累于細(xì)胞胞內(nèi)的液泡中，分離提取首先需要破碎細(xì)胞取首先需要破碎細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)基 一、無(wú)機(jī)鹽一、無(wú)機(jī)鹽 二、碳源二、碳源 三、植物生長(zhǎng)激素三、植物生長(zhǎng)激素 四、有機(jī)氮源四、有機(jī)氮源 五、有機(jī)酸五、有機(jī)酸 六、復(fù)合物質(zhì)六、復(fù)合物質(zhì) 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 mediummu

6、rashige-skoog(1962)white(1963)heller(1953)schenk hildebrandt (1972)mgso4 7h2o370720250400na2so4-200-kc1-65750-cac12 2h2o440-75200nano3-600-kno31,90080-2,500ca(no3)2 4h2o-300-nh4no31,650-nah2po4 h2o-16.5125-nh4h2po4-300kh2po4170-_-sucrose(g)30202030大量元素大量元素主碳源主碳源myo-inositol100-1,000nicotinic acid0.5

7、0.5-0.5pyridoxine hc10.50.1-0.5thiamine hc10.1-10.115ca-pantothenate-1-glycine23-微量有機(jī)物或氨基酸微量有機(jī)物或氨基酸組分組分murashige-skoog(1962)white(1963)heller(1953)schenk hildebrandt (1972) feso4 7h2)27.8-15na2edta37.3-20mnso4 4h2o22.370.110 znso4 7h2o8.6310.1cuso4 5h2o0.025-0.030.2fe2(so4)3-2.5-nic12 6h2o-0.03-coc1

8、2 6h2o0.025-0.1a1c13-0.03-fec13 6h2o-1-k10.830.750.011.0h3bo36.21.515na2m0o4 2h2o0.25-0.1微量無(wú)機(jī)鹽微量無(wú)機(jī)鹽組分組分murashige-skoog(1962)white(1963)heller(1953)schenk hildebrandt (1972)植物生長(zhǎng)激素 2,4-d ： 10 to 50 m naa ：1 to 50 m kinetin ：0.1 to 10 m iaa：0.1 to 10 m 植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)反應(yīng)器植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)反應(yīng)器反應(yīng)器類(lèi)型反應(yīng)器類(lèi)型 植物細(xì)胞體系植物細(xì)胞體系攪拌式反應(yīng)

9、器攪拌式反應(yīng)器catharanthus roseus（長(zhǎng)春花）；（長(zhǎng)春花）；daucus carotadigitalis lanta（毛地黃）；（毛地黃）；dioscorea deltoideamorinda citrifolia（海巴戢）；（海巴戢）；nicotiana tabacum（煙草）（煙草）鼓泡柱反應(yīng)器鼓泡柱反應(yīng)器glycine max；nicotiana tabacum氣升式反應(yīng)器氣升式反應(yīng)器berberis wilsone；catharanthus roseus；tirptergium wildordii（雷公藤）（雷公藤）轉(zhuǎn)鼓式反應(yīng)器轉(zhuǎn)鼓式反應(yīng)器lithospermum er

10、ythrorhizon （紫草）；（紫草）；vinca rosea傳統(tǒng)反應(yīng)器傳統(tǒng)反應(yīng)器轉(zhuǎn)筒反應(yīng)器轉(zhuǎn)筒反應(yīng)器適合于慢反應(yīng)適合于慢反應(yīng)abc大規(guī)模植物細(xì)胞培養(yǎng)大規(guī)模植物細(xì)胞培養(yǎng)提高次生代謝物產(chǎn)量的策略提高次生代謝物產(chǎn)量的策略 高產(chǎn)細(xì)胞系的建立和選擇 ： 克隆選擇、抗性選擇和誘導(dǎo)選擇克隆選擇、抗性選擇和誘導(dǎo)選擇 組織化培養(yǎng) ： 根系培養(yǎng)根系培養(yǎng) 固定化細(xì)胞技術(shù)： 凝膠包埋法、吸附法凝膠包埋法、吸附法 產(chǎn)物促進(jìn)釋放技術(shù) ： 改變培養(yǎng)基組成、電刺激法、二甲基亞砜（改變培養(yǎng)基組成、電刺激法、二甲基亞砜（dmso）類(lèi)物質(zhì)的化學(xué)滲透法、由培養(yǎng)基與萃取劑組成的雙液類(lèi)物質(zhì)的化學(xué)滲透法、由培養(yǎng)基與萃取劑組成的雙液相

11、培養(yǎng)相培養(yǎng) 原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的制備去除細(xì)胞壁的植物細(xì)胞去除細(xì)胞壁的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體細(xì)胞融合育種體細(xì)胞融合育種用途用途功能功能繁殖繁殖代謝代謝分化分化 1960年英國(guó)諾丁漢大學(xué)年英國(guó)諾丁漢大學(xué)cocking 教授領(lǐng)導(dǎo)的小組率先利用教授領(lǐng)導(dǎo)的小組率先利用真菌纖維素酶，成功地制備出了大量具有高度活性可再生的真菌纖維素酶，成功地制備出了大量具有高度活性可再生的番茄幼根細(xì)胞原生質(zhì)體番茄幼根細(xì)胞原生質(zhì)體, 開(kāi)辟了原生質(zhì)體融合研究的新階段。開(kāi)辟了原生質(zhì)體融合研究的新階段。 植物細(xì)胞雜交的主要過(guò)程如下：植物細(xì)胞雜交的主要過(guò)程如下： 1. 原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的制備 2. 原生質(zhì)體的融合原

12、生質(zhì)體的融合 3. 雜合體的鑒別與篩選雜合體的鑒別與篩選 原生質(zhì)體的應(yīng)用原生質(zhì)體的應(yīng)用植物細(xì)胞雜交植物細(xì)胞雜交細(xì)胞育種細(xì)胞育種 誘導(dǎo)突變，篩選新品系、新品種誘導(dǎo)突變，篩選新品系、新品種次生代謝產(chǎn)物生成次生代謝產(chǎn)物生成 從培養(yǎng)的植物細(xì)胞中提取所需的代謝產(chǎn)物。從培養(yǎng)的植物細(xì)胞中提取所需的代謝產(chǎn)物。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 比栽培原料作物更易控制最佳生產(chǎn)條件；比栽培原料作物更易控制最佳生產(chǎn)條件； 培養(yǎng)物為無(wú)菌、無(wú)蟲(chóng)材料，能保證產(chǎn)品質(zhì)量；培養(yǎng)物為無(wú)菌、無(wú)蟲(chóng)材料，能保證產(chǎn)品質(zhì)量； 工藝操作較為簡(jiǎn)單，可減少勞動(dòng)費(fèi)用，提高工藝操作較為簡(jiǎn)單，可減少勞動(dòng)費(fèi)用，提高 生產(chǎn)率。生產(chǎn)率。植物細(xì)胞植物細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)的應(yīng)用的應(yīng)用化合物化合

13、物植物品系植物品系得率得率 (% 干重干重)培養(yǎng)類(lèi)型培養(yǎng)類(lèi)型細(xì)胞培養(yǎng)植物植物紫草寧紫草寧紫草紫草201.5s人參皂甙人參皂甙西洋參西洋參panax ginseng274.5c蒽醌蒽醌morinda citrifolia180.3sajmalicine長(zhǎng)春花長(zhǎng)春花catharanthus roseus1.00.3srosmarinic acidcoleus blumeii153subiquinone-10nicotiana tabacum0.0360.003sdiosgenindioscorea deltoides22sbenzylisoquinoline alkaloidscoptis jap

14、onica115 - 10sberberinethalictrum minor100.01sberberinecoptis japonica102 - 4santhraquinonesgalium verum5.41.2santhraquinonesgalium aparine3.80.2s尼古丁尼古丁 煙草煙草nicotiana tabacum3.42.0cbisoclaurinestephania cepharantha2.30.8stripdiolidetripteryqium wilfordii0.050.001s* s = suspension; c = callus植物細(xì)胞產(chǎn)生的次

15、生代謝物植物細(xì)胞產(chǎn)生的次生代謝物植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物 藥品及生物活性物質(zhì)藥品及生物活性物質(zhì) 生物堿生物堿alkaloids 嗎啡楠堿嗎啡楠堿morphinan alkaloids 小檗堿小檗堿 berbeirine 莨菪烷莨菪烷tropane alkaloids 強(qiáng)心苷強(qiáng)心苷cardinolides* 毛地黃毒苷是一種強(qiáng)心苷類(lèi)。毛地黃細(xì)胞培養(yǎng)物能夠進(jìn)行植毛地黃毒苷是一種強(qiáng)心苷類(lèi)。毛地黃細(xì)胞培養(yǎng)物能夠進(jìn)行植 株所不能夠或能株所不能夠或能 極微量進(jìn)行的生物合成過(guò)程。極微量進(jìn)行的生物合成過(guò)程。 抗癌化合物抗癌化合物（antitumor compounds） 喜樹(shù)堿喜樹(shù)堿camptothe

16、cin homoharringtonine 鬼臼毒鬼臼毒podophyllotoxin 紫杉醇（紫杉醇（taxol） 西洋參（西洋參（ginseng）* 迷迭香酸迷迭香酸rosmarinic acid 對(duì)苯二酚葡糖苷對(duì)苯二酚葡糖苷arbutin植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物 食品添加劑食品添加劑food additives 色素色素 pigments 紫草寧紫草寧 shikonin compounds* 花青素花青素 anthocyanins $1,250-2,000/kg 紅花黃色素，紅花素紅花黃色素，紅花素carthamin 是其主要成分是其主要成分 藏紅花藏紅花saffron saff

17、ron 茜草色素茜草色素madder colorantsmadder colorants 其它其它 糖膠樹(shù)膠糖膠樹(shù)膠chiclechicle （口香糖樹(shù)膠）（口香糖樹(shù)膠） 香豆素香豆素紫草寧的生產(chǎn)（紫草寧的生產(chǎn)（1）8種衍生物的總稱(chēng)種衍生物的總稱(chēng)傳統(tǒng)中藥與天然色素傳統(tǒng)中藥與天然色素懸浮紫草細(xì)胞的制備懸浮紫草細(xì)胞的制備 采用種子萌動(dòng)法誘導(dǎo)紫草愈傷組織采用種子萌動(dòng)法誘導(dǎo)紫草愈傷組織 紫草種子在紫草種子在2525 c c黑暗中萌動(dòng)，然后轉(zhuǎn)移于黑暗中萌動(dòng)，然后轉(zhuǎn)移于lsls培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基進(jìn)行固體培養(yǎng)，激素水平為固體培養(yǎng)，激素水平為2,4-d102,4-d10-6-6mol/lmol/l，kt 10k

18、t 10-5-5mol/lmol/l。一星期后在芽的下端產(chǎn)生了乳黃色愈傷組織。一星期后在芽的下端產(chǎn)生了乳黃色愈傷組織。 紫草寧分泌紫草寧分泌 愈傷組織若在固體愈傷組織若在固體lsls培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，并將激素培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，并將激素改為添加改為添加iaaiaa，4 4周后可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變?yōu)樯罴t色，此物質(zhì)即周后可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變?yōu)樯罴t色，此物質(zhì)即紫草寧紫草寧 懸浮細(xì)胞系建立懸浮細(xì)胞系建立 將愈傷組織繼代培養(yǎng)在液體將愈傷組織繼代培養(yǎng)在液體lsls培養(yǎng)基中，經(jīng)多次培養(yǎng)后培養(yǎng)基中，經(jīng)多次培養(yǎng)后可得到懸浮的小顆粒細(xì)胞（幾個(gè)到幾十個(gè)細(xì)胞聚集團(tuán)）可得到懸浮的小顆粒細(xì)胞（幾個(gè)到幾十個(gè)細(xì)胞聚集團(tuán)）紫草寧的生產(chǎn)（

19、紫草寧的生產(chǎn)（2）ls 細(xì)細(xì)胞生長(zhǎng)胞生長(zhǎng)white 紫草寧積累紫草寧積累兩階段兩階段ls-white培養(yǎng)培養(yǎng)改進(jìn)的優(yōu)化兩階改進(jìn)的優(yōu)化兩階段培養(yǎng)基段培養(yǎng)基m5-m9發(fā)根系發(fā)根系培養(yǎng)培養(yǎng)高密度流高密度流加培養(yǎng)加培養(yǎng)紫草寧的生產(chǎn)（紫草寧的生產(chǎn)（2）發(fā)展與開(kāi)發(fā)歷史發(fā)展與開(kāi)發(fā)歷史 日本三井石油公司日本三井石油公司 ： 確定生長(zhǎng)確定生長(zhǎng)-生產(chǎn)兩階段培養(yǎng)生產(chǎn)兩階段培養(yǎng) 流加高密度培養(yǎng)流加高密度培養(yǎng) 育種，高產(chǎn)細(xì)胞株篩選育種，高產(chǎn)細(xì)胞株篩選 1983年年750 l氣升式反應(yīng)器氣升式反應(yīng)器 1987年，年，1m3的轉(zhuǎn)鼓式反應(yīng)器的轉(zhuǎn)鼓式反應(yīng)器 中國(guó)：中國(guó)： 南京大學(xué)生物系南京大學(xué)生物系 浙江大學(xué)材料與化工學(xué)院浙江

20、大學(xué)材料與化工學(xué)院 人參（人參（panax ginseng ）細(xì)胞）細(xì)胞 有效成分有效成分 皂甙（皂甙（saponins ）和皂甙配基（）和皂甙配基（ sapogenins ） 研究與開(kāi)發(fā)歷史研究與開(kāi)發(fā)歷史 1 日本日本meiji seika kaisha 1973年專(zhuān)利年專(zhuān)利 大規(guī)模培養(yǎng)反應(yīng)大規(guī)模培養(yǎng)反應(yīng)器器 后放棄后放棄 2 美國(guó)美國(guó)university of minnesota 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)2,4-d 和和 kinetin對(duì)細(xì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)與次生代謝有著不同的調(diào)節(jié)作用胞生長(zhǎng)與次生代謝有著不同的調(diào)節(jié)作用 3 日本日本nitto denko corporation 80年代中期年代中期 20 立方米立方米罐罐 細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)量達(dá)細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)量達(dá) 700 mg/l/day in 1988, 被被the ministry of welfare and health in japan準(zhǔn)許以食品添加劑（酒、湯、飲料和草藥提取液）準(zhǔn)許以食品添加劑（酒、湯、飲料和草藥提取液）生產(chǎn)西洋參細(xì)胞質(zhì)生產(chǎn)西洋參細(xì)胞