對羥基苯甲酸酯的HPLC分析2016

1、對羥基苯甲酸酯同系物的對羥基苯甲酸酯同系物的HPLC分分析析毛偵軍 2一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)高效液相色譜儀器的基本使用方法。理解和掌握高效液相色譜分離分析基本原理。學(xué)會用外標(biāo)法和校正歸一化法進行色譜定量分析。二、二、HPLC 簡介簡介1967年，高效液相色譜法年，高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography，HPLC)正式問世。正式問世。 高壓：流動相為液體，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓，300600105 Pa。高速：分析速度快、通常分析一個樣品在1530分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時。高效：分離效能高?？?/p>

2、選擇固定相和流動相以達到最佳分離最佳分離效果效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。高靈敏度：紫外檢測器可達10-9gmL，熒光檢測器可達10-11g mL 。4HPLC應(yīng)用廣泛應(yīng)用廣泛 由于HPLC分離分析的高靈敏度、定量的準(zhǔn)確性，特適于非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定定組分的分析，因此，在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、生命科學(xué)、化工、環(huán)保等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用。 如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、藥品、多糖、高聚物、農(nóng)藥、抗生素、膽固醇、金屬有機物等分析，大多是通過HPLC來完成的。各種HPLC方法的應(yīng)用范圍及對象5液相色譜（液相色譜（HPLC）氣相色譜（氣相色譜（GC）相同點色譜柱可反

3、復(fù)使用，分離效能高，高靈敏度，進樣量小，分析速度快，使用范圍廣分析對象高沸點、不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物、生物大分子、高分子化合物、離子型樣品氣體、沸點較低、熱穩(wěn)定性好的化合物流動相不同極性的液體（有一定親和作用）惰性氣體（無親和性，只起運載作用）溫度一般室溫較高檢測器紫外吸收檢測器（光電二極管陣列檢測器），熒光檢測器，電化學(xué)檢測器，蒸發(fā)光散射檢測器，質(zhì)譜檢測器，示差折光檢測器氫火焰離子化檢測器（FID），熱導(dǎo)檢測器（TCD)，氮磷檢測器（NPD），火焰光度檢測器（FPD），電子捕獲檢測器（ECD)等類HPLC與與GC的比較的比較Agilent 1100儀器結(jié)構(gòu)圖三、三、Agilent-1100 液相色

4、譜儀液相色譜儀高壓輸液系統(tǒng)：單元、雙元、 四元泵 進樣系統(tǒng)：手動、自動 分離系統(tǒng)：C18、C8色譜柱檢測系統(tǒng)：檢測器71、高壓輸液系統(tǒng)l儲液器： 0.5L2L的玻璃瓶（白色、棕色）。l脫氣裝置： 將氣體從溶劑中除去，離線脫氣和在線真空脫氣。l高壓輸液泵：恒壓泵、恒流泵恒流泵使用最廣泛，有單活塞和雙活塞往復(fù)泵。流量準(zhǔn)確、可調(diào)，流速為0.52 mL/min，泵最大流量范圍為510mL/min（排氣泡排氣泡）。流動相流動相nHPLC HPLC 級級溶劑n水為超純水n過濾 (最大0.45 m, 0.2 m最好)n脫氣，尤其在低流速時n相溶9液相色譜手動進樣器2、進樣系統(tǒng)10準(zhǔn)備時，流動相直接進柱，進樣

5、口1與定量管連接，樣品充滿定量管后，多余樣品從2流出。進樣時，泵將流動相壓入定量管，將樣品全部攜帶進入色譜柱分析。注射器注射器11氣氣相色譜注射器的針頭為相色譜注射器的針頭為尖尖，液液相色譜的注射器針頭為相色譜的注射器針頭為平平，兩者不能混用。兩者不能混用。色譜柱是液相色譜的色譜柱是液相色譜的心臟部件心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。，它包括柱管與固定相兩部分。柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑16 mm，柱長，柱長0 30 cm，固定相固定相粒徑粒徑 5 10m 。發(fā)展趨勢是發(fā)展趨勢是減小填料粒度減小填料粒度和和柱徑柱徑以提高柱效。以提高柱效。色譜柱色譜柱3 3、色譜柱色譜柱

6、 反相柱反相柱-固定相通常是以硅膠為基質(zhì)，固定相通常是以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有表面鍵合有極性相對較弱官能團極性相對較弱官能團的鍵合相。的鍵合相。樣品流出色譜柱的順序是樣品流出色譜柱的順序是極性較強的組分最極性較強的組分最先被沖洗出先被沖洗出，而極性弱的組分會在色譜柱上，而極性弱的組分會在色譜柱上有更強的保留。有更強的保留。常用的反向填料有：常用的反向填料有：C C1818（ODSODS）、）、C C8 8（MOSMOS）、）、C C4 4（ButylButyl）、）、C C6 6H H5 5（PhenylPhenyl）等。）等。 正相柱正相柱-固定相通常為硅膠以及其他固定相通常為硅膠以及其他具

7、有具有極性官能團極性官能團胺基團，如（胺基團，如（NHNH2 2）和氰基）和氰基團（團（CNCN）的鍵合相填料。）的鍵合相填料。 由于硅膠表面的硅羥基（由于硅膠表面的硅羥基（SiOHSiOH）或其）或其他極性基團極性較強，因此，分離的次序他極性基團極性較強，因此，分離的次序是依據(jù)樣品中各組分的極性大小，即是依據(jù)樣品中各組分的極性大小，即極性極性較弱的組份最先被沖洗出色譜柱較弱的組份最先被沖洗出色譜柱。14 手性色譜柱手性色譜柱-是由具有光學(xué)活性的單體，固定在硅膠或其它聚合物上制成手性固定相，來實現(xiàn)外消旋物的廣泛分離。特點：具有專一性、通用性不廣。價格較貴。 紫外吸收檢測器（Ultraviole

8、t Visible Detector，UVD） 目前在HPLC中應(yīng)用最廣泛的檢測器。包括： 可變波長紫外檢測器（VWD） 二極管陣列檢測器（DAD） 熒光檢測器（Fluorescence Detector，F(xiàn)D） 示差折光檢測器（Refractive Index Detector，RID）4、液相色譜檢測器液相色譜檢測器下列優(yōu)良下列優(yōu)良/常規(guī)實驗操作能夠延長儀器壽命常規(guī)實驗操作能夠延長儀器壽命：l流動相和樣品進行過濾。l保證溶劑的相溶性。l儀器使用完畢，沖洗整個系統(tǒng)，去掉鹽份，防止污染。l對儀器進行定期維護和保養(yǎng)。l定期使用甲醇或異丙醇沖洗系統(tǒng)。色譜過程色譜過程：在有互不相溶的兩相流動相和固定

9、相的體系中，當(dāng)兩相作相對運動時，第三組分（即溶質(zhì)或吸附質(zhì)）連續(xù)不斷地在兩相之間進行分配分配的過程。 由于流動相、固定相以及溶質(zhì)混合物性質(zhì)性質(zhì)的不同，在色譜過程中溶質(zhì)混合物中的各組分表現(xiàn)出不同的色譜行為色譜行為，從而使各組分彼此相互分離相互分離。 18四、四、基本分離原理基本分離原理色譜分析法的實質(zhì)色譜分析法的實質(zhì)：不同溶質(zhì)分子因結(jié)構(gòu)不同而與流動相及固定相的相互作用力相互作用力不同，從而引起在色譜柱內(nèi)運行過程中作用機理的差異。經(jīng)過柱內(nèi)多次作用的疊加后在宏觀上引起其在柱內(nèi)停留時間柱內(nèi)停留時間（保留時間保留時間）的差異，形成事實上的分離。19基本分離原理基本分離原理 分配色譜： 液液分配色譜（Liq

10、uid-liquid partition chromatography） 化學(xué)鍵合相色譜（Chemically bounded phase chromatography, CBPC） 反相離子對色譜 液-固吸附色譜 （Liquid-solid adsorption chromatography, LSAC） 離子交換色譜（Ion-exchange chromatography） 空間排阻色譜（Size-exclusion chromatography） 親和色譜法（Affinity chromatography）分配色譜 反相分配色譜：流動相極性固定相極性 正相分配色譜：流動相極性固定相極性反

11、相：固定相：C18, C8 流動相：水，甲醇，乙腈等極性溶劑的混合溶劑 適合極性小的芳香族化合物正相：固定相：-CN, -NH2 流動相：烷烴，異丙醇，四氫呋喃等的混合溶劑 適合于極性差異大的化合物2223液相色譜流動相液相色譜流動相 液相色譜分析中，在紫外區(qū)有明顯吸收紫外區(qū)有明顯吸收，可以利用紫外檢測器進行檢測，其工作原理是Lambert-Beer定律。24五、五、基本檢測原理基本檢測原理定性定量分析的原理定性定量分析的原理 用標(biāo)準(zhǔn)物比對法定性用標(biāo)準(zhǔn)物比對法定性：特定組分在同色譜條件下有不變的保留值(時間、體積等)，可將之與已知純物質(zhì)的相應(yīng)保留值相應(yīng)保留值作比對的方法進行定性分析。25三聚氰

12、胺三聚氰酸豬肉中三聚氰胺和三聚氰酸的分析 用外標(biāo)法定量用外標(biāo)法定量：以不同量標(biāo)準(zhǔn)樣品進樣得到峰面積，然后作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程，得到相關(guān)系數(shù)。然后進樣得到被測試樣的峰面積從曲線中查到含量。 方法適用于樣品復(fù)雜，但只對部分組分感興趣時。 26定性定量分析的原理定性定量分析的原理 校正歸一化法定量校正歸一化法定量：因不同組分的紫外吸收情況不同，等量樣品的吸光度值不相等。因而需要采用校正歸一化法定量: 方法適用于樣品不很復(fù)雜，且部分組分都能流出色譜柱并在檢測器上有響應(yīng)時。 27定性定量分析的原理定性定量分析的原理100%iiiiif APf AisisiW AfW A Agilent-1100

13、液相色譜儀：28四元高壓泵 C18色譜柱手動進樣器可變波長紫外檢測器色譜工作站六、實驗內(nèi)容六、實驗內(nèi)容實驗步驟I 打開計算機啟動“bootp”文件，然后打開儀器電源建立計算機和儀器的連接。啟動工作站（online），調(diào)整好流動相流量和檢測波長，等待基線平直。29前期準(zhǔn)備前期準(zhǔn)備實驗步驟II 在甲醇:水=80:20、70:30、65:35的不同配比流動相中分別取未知試樣25L進樣分析，記錄保留時間和各組分間的分離度，以分離度大于1.5且保留時間最短為原則選定最佳流動相配比。 注意：每次更換流動相都需等待5min左右以平衡色譜系統(tǒng)。30條件試驗條件試驗 I流動相配比流動相配比實驗步驟III 在最佳

14、流動相配比條件下，以0.8、1.0、1.2 mL/min不同的流動相流速下取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液25L進樣分析，以同樣原則選定最佳流動相流速。 問題I：每次更換流動相還需等待每次更換流動相還需等待5min嗎？嗎？ 問題問題II：可以利用本步驟實驗數(shù)據(jù)進行定：可以利用本步驟實驗數(shù)據(jù)進行定量校正因子的確認(rèn)嗎？量校正因子的確認(rèn)嗎？31條件試驗條件試驗 II流動相流速流動相流速實驗步驟IV 在最佳實驗條件下，分別取純甲酯、丙酯、丁酯各10L進樣，記錄各色譜峰保留時間，與步驟步驟III所得結(jié)果相比較，進行定性分析。 32定性分析定性分析實驗步驟V 在最佳實驗條件下，分別取25 L混合標(biāo)樣進樣，以峰面積對濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 要求該曲線的相關(guān)系數(shù)大于0.99，如果不滿足則可對明顯偏離的實驗進行重測。33標(biāo)準(zhǔn)曲線制作標(biāo)準(zhǔn)曲線制作實驗步驟VI 取25L 未知試樣進樣分析（重復(fù)3次），外標(biāo)法定量。 結(jié)束：用100%甲醇沖