目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離課件

1、目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離1第二篇第二篇 目標產(chǎn)品的分離與純化目標產(chǎn)品的分離與純化第五章第五章 細胞破碎、蛋白質復性和固液分離細胞破碎、蛋白質復性和固液分離目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離2細胞破碎細胞破碎固液分離固液分離初級分離初級分離( (粗粗) )純化精制純化精制 下游技術基本過程下游技術基本過程目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離3下游加工技術的重要性下游加工技術的重要性 1.1.產(chǎn)品分離純化是最終獲得商業(yè)產(chǎn)品分離純化是最終獲得商業(yè)產(chǎn)品的環(huán)節(jié)。產(chǎn)品的環(huán)節(jié)。 2.2.投資費用高（抗生素、乙醇、投資費用高（抗生素、乙醇、檸檬酸占檸檬酸占60

2、%60%）。）。 3.3.分離純化技術落后會阻礙發(fā)酵分離純化技術落后會阻礙發(fā)酵工程技術的發(fā)展。工程技術的發(fā)展。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離4 幾種產(chǎn)品在發(fā)酵液中的濃度幾種產(chǎn)品在發(fā)酵液中的濃度 產(chǎn)品產(chǎn)品 典型濃度（典型濃度（g/lg/l） 抗生素抗生素 2525 氨基酸氨基酸 100100 酒精酒精 100100 有機酸有機酸 100100 酶酶 2020 蛋白質蛋白質 1010目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離5下游加工技術的特點下游加工技術的特點 1. 1. 發(fā)酵液的復雜性造成分離上的困難性。發(fā)酵液的復雜性造成分離上的困難性。 2. 2. 欲提取的產(chǎn)物通常濃

3、度低且很不穩(wěn)定。欲提取的產(chǎn)物通常濃度低且很不穩(wěn)定。 3. 3. 多為分批操作，各批發(fā)酵液不盡相同，多為分批操作，各批發(fā)酵液不盡相同，要求下游加工有一定彈性。要求下游加工有一定彈性。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離6 產(chǎn)物提純過程的不同決定于：產(chǎn)物提純過程的不同決定于： 對象材料、目標產(chǎn)物特性及對對象材料、目標產(chǎn)物特性及對其純度的要求其純度的要求第一節(jié)第一節(jié) 概述概述目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離7基因工程生物制品分離純化基因工程生物制品分離純化: :工程菌經(jīng)過大規(guī)模培養(yǎng)后，工程菌經(jīng)過大規(guī)模培養(yǎng)后，產(chǎn)生的有效成分含量很低，產(chǎn)生的有效成分含量很低，雜質含量卻很高雜

4、質含量卻很高分離純化分離純化極其重要極其重要基因工程藥物從轉化細基因工程藥物從轉化細胞、生產(chǎn)，對產(chǎn)品的純胞、生產(chǎn)，對產(chǎn)品的純度要求高于傳統(tǒng)產(chǎn)品。度要求高于傳統(tǒng)產(chǎn)品。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離8發(fā)酵液發(fā)酵液細胞分離細胞分離胞內產(chǎn)物胞內產(chǎn)物胞外產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細胞破碎細胞破碎固液分離固液分離包涵體包涵體細胞碎片分離細胞碎片分離變性變性復性復性濃縮濃縮 初步分離初步分離 高度純化高度純化 制劑制劑 產(chǎn)品產(chǎn)品 基因工程制品分離純化的一般流程基因工程制品分離純化的一般流程目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離9初級分離初級分離：分離細胞和培養(yǎng)液，破碎細分離細胞和培養(yǎng)液，破碎細

5、胞釋放產(chǎn)物，溶解包含體（包涵體），復胞釋放產(chǎn)物，溶解包含體（包涵體），復原蛋白質，濃縮產(chǎn)物，去除大部分雜質等原蛋白質，濃縮產(chǎn)物，去除大部分雜質等過程。過程。主要決定產(chǎn)物的得率主要決定產(chǎn)物的得率。純化精制純化精制：初級分離基礎上，用各種高初級分離基礎上，用各種高選擇性手段，主要是各種層析技術，將目選擇性手段，主要是各種層析技術，將目標產(chǎn)物和干擾雜質盡可能分開，使產(chǎn)物的標產(chǎn)物和干擾雜質盡可能分開，使產(chǎn)物的純度達到有關要求。純度達到有關要求。主要決定產(chǎn)物的純度主要決定產(chǎn)物的純度。產(chǎn)物提純過程包括兩個基本階段：產(chǎn)物提純過程包括兩個基本階段：目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離10第二節(jié)第二

6、節(jié) 細胞破碎細胞破碎 目的：目的：釋放細胞內含物釋放細胞內含物。 分類：分類：按照是否存在外加作用力分按照是否存在外加作用力分為機械法和非機械法。為機械法和非機械法。 問題：問題： 破碎率是否越高越好？破碎率是否越高越好？以大腸桿菌為以大腸桿菌為宿主藥物多為宿主藥物多為胞內產(chǎn)物胞內產(chǎn)物目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離11細胞破碎方法分類圖細胞破碎方法分類圖目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離121 1、高壓勻漿法、高壓勻漿法 組成組成：高壓泵和勻漿閥高壓泵和勻漿閥 作用機理作用機理：高壓泵將電機的旋轉運動轉變高壓泵將電機的旋轉運動轉變成勻漿閥柱桿的直線運動，從高壓室

7、（幾成勻漿閥柱桿的直線運動，從高壓室（幾十兆帕）壓出細胞懸浮液，經(jīng)過碰撞環(huán)的十兆帕）壓出細胞懸浮液，經(jīng)過碰撞環(huán)的撞擊后改變方向從出口管噴出，使撞擊后改變方向從出口管噴出，使細胞經(jīng)細胞經(jīng)歷較高的流速下的剪切碰撞發(fā)生較大的變歷較高的流速下的剪切碰撞發(fā)生較大的變形，從而達到破碎細胞的目的形，從而達到破碎細胞的目的。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離13高壓勻漿閥結構示意圖高壓勻漿閥結構示意圖進液口進液口出液口出液口閥座閥座碰撞環(huán)碰撞環(huán)閥桿閥桿高壓勻漿器高壓勻漿器目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離1419.6-25.4mpa 適用于酵母和大多數(shù)細菌細胞的破碎適用于酵母和大多

8、數(shù)細菌細胞的破碎目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離15高壓勻漿法動力學方程高壓勻漿法動力學方程 破碎效率與勻破碎效率與勻漿閥結構、操作壓力和破碎次數(shù)漿閥結構、操作壓力和破碎次數(shù)有關：有關：ln(rln(rm m/(r/(rm m-r)=knp-r)=knpa ar r：單位生物量釋放出的產(chǎn)物量（：單位生物量釋放出的產(chǎn)物量（mg/g)mg/g)r rm m：r r的最大值；的最大值；k k：破碎速率常數(shù)；：破碎速率常數(shù)；n n：破碎次數(shù)；：破碎次數(shù)；p p：操作壓力；：操作壓力；a:a:與微生物性質有關的指數(shù)系數(shù)。與微生物性質有關的指數(shù)系數(shù)。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與

9、固液分離16 破碎率破碎率-操作壓力操作壓力-溫度控制溫度控制-能耗能耗溫度對活性物質的失活作用溫度對活性物質的失活作用提高壓力需增加能耗：提高壓力需增加能耗：3.5kw/100mpa3.5kw/100mpa移走熱量需付出代價：移走熱量需付出代價：23.8/100mpa23.8/100mpa高壓勻漿一般需多級操作，每次循環(huán)前往往進行級間冷卻高壓勻漿一般需多級操作，每次循環(huán)前往往進行級間冷卻勻漿過程中產(chǎn)生的熱勻漿過程中產(chǎn)生的熱蛋白質和酶的失活蛋白質和酶的失活溫控和能耗溫控和能耗目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離17 堵塞（不適合團塊狀或絲狀真菌），質地堵塞（不適合團塊狀或絲狀真菌）

10、，質地堅硬者如包含體易損傷勻漿閥，也不適用堅硬者如包含體易損傷勻漿閥，也不適用 溫度高易失活，能耗大。溫度高易失活，能耗大。存在的問題存在的問題目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離182 2、高速珠磨法、高速珠磨法 原理原理：細胞和極細的研磨劑在攪拌槳細胞和極細的研磨劑在攪拌槳作用下充分混合，珠子之間及珠子與作用下充分混合，珠子之間及珠子與細胞之間互相細胞之間互相剪切、碰撞剪切、碰撞，促使細胞，促使細胞壁破裂，釋放內含物。壁破裂，釋放內含物。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離19幾種常見珠磨器幾種常見珠磨器目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離20動力學方程

11、動力學方程 間歇操作間歇操作: :ln(rln(rm m/(r/(rm m-r)=ln(d)=kt-r)=ln(d)=kt 其中，其中，d=(1+kd=(1+k1 1 /j)/j)j j 連續(xù)操作：連續(xù)操作：ln(rln(rm m/(r/(rm m-r)=kv/f=k-r)=kv/f=k上式中，上式中，t t是破碎時間；是破碎時間；k k、k k1 1、kk是破碎速是破碎速度常數(shù)；度常數(shù)；v v是破碎室內懸浮液的體積；是破碎室內懸浮液的體積；f f是是進料速度；進料速度； 是平均停留時間；是平均停留時間；j j是破碎時是破碎時全混釜的數(shù)目，反映破碎室內懸浮液的流全混釜的數(shù)目，反映破碎室內懸浮液

12、的流動狀況。動狀況。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離21 采用夾套冷卻的方式實現(xiàn)溫控采用夾套冷卻的方式實現(xiàn)溫控, ,效果較好效果較好; ; 能耗與細胞破碎率成正比能耗與細胞破碎率成正比; ; 問題：問題： 高壓勻漿比珠磨法破碎細胞的效果好？高壓勻漿比珠磨法破碎細胞的效果好？溫控和能耗溫控和能耗目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離22高壓勻漿法與高速珠磨法的比較高壓勻漿法與高速珠磨法的比較項目項目高壓勻漿法高壓勻漿法高速珠磨法高速珠磨法操作參數(shù)操作參數(shù)少少多，液體損耗大多，液體損耗大連續(xù)操作時連續(xù)操作時配備熱換器進行級配備熱換器進行級間冷卻間冷卻兼具破碎和冷卻，兼具破

13、碎和冷卻，減少產(chǎn)物失活減少產(chǎn)物失活達到較高破碎率達到較高破碎率需循環(huán)需循環(huán)2-42-4次次一次操作一次操作適用范圍適用范圍團狀、絲狀真菌、團狀、絲狀真菌、較小革蘭陽性菌不較小革蘭陽性菌不宜，包含體不宜宜，包含體不宜幾乎所有的微生物幾乎所有的微生物細胞，包括含有包細胞，包括含有包含體的基因工程菌含體的基因工程菌的破壁的破壁目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離23x-pressx-press擠壓機，把濃縮的細胞懸液冷擠壓機，把濃縮的細胞懸液冷卻至卻至-25-25-30-30，形成冰晶，用，形成冰晶，用500mpa500mpa以以上的高壓沖擊，使冷凍細胞從高壓閥孔中上的高壓沖擊，使冷凍細

14、胞從高壓閥孔中擠出，冰晶體磨損和包埋在冰中的細胞變擠出，冰晶體磨損和包埋在冰中的細胞變形引起細胞破碎。其優(yōu)點是細胞碎片粉碎形引起細胞破碎。其優(yōu)點是細胞碎片粉碎程度低，生物活性保持較好。程度低，生物活性保持較好。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離243 3、超聲破碎、超聲破碎 機理：機理：聲頻高于聲頻高于151520khz20khz的超聲波在高強的超聲波在高強度聲能輸入時可以進行細胞破碎，破碎機理度聲能輸入時可以進行細胞破碎，破碎機理尚未清楚，可能與尚未清楚，可能與引起的沖擊波和引起的沖擊波和剪切力有關。剪切力有關。 破碎效率破碎效率與聲頻、聲能、處理時間、細胞濃與聲頻、聲能、處理

15、時間、細胞濃度及菌種類型等因素有關。度及菌種類型等因素有關。 優(yōu)點優(yōu)點：操作簡便，液量損失少操作簡便，液量損失少 存在問題存在問題：使敏感物質變性失活，噪聲大，使敏感物質變性失活，噪聲大，大容量時效率低，應用潛力有限。大容量時效率低，應用潛力有限。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離25 空化現(xiàn)象空化現(xiàn)象：在強聲波作用下，引在強聲波作用下，引起氣泡形成，脹大和破碎的現(xiàn)象。起氣泡形成，脹大和破碎的現(xiàn)象。錫箔紙測試空化強度與空化密度錫箔紙測試空化強度與空化密度看得到的空化現(xiàn)象看得到的空化現(xiàn)象目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離26超聲波破碎儀超聲波破碎儀大功率大功率超聲波破

16、碎儀超聲波破碎儀目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離274 4、化學滲透法、化學滲透法 作用機理作用機理：某些某些有機溶劑，抗生素，表有機溶劑，抗生素，表面活性劑，金屬螯合劑，變性劑面活性劑，金屬螯合劑，變性劑等化學等化學藥品都可以改變細胞壁或膜的通透性，從藥品都可以改變細胞壁或膜的通透性，從而使內容物有選擇地滲透出來，這種處理而使內容物有選擇地滲透出來，這種處理方法叫方法叫滲透法滲透法。 問題問題：edtaedta、甲苯、甲苯、triton x-100triton x-100、鹽、鹽酸胍和脲的作用機理？酸胍和脲的作用機理？p70p70目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分

17、離28edtaedta：破壞細胞的外層膜：破壞細胞的外層膜甲苯甲苯：溶解細胞膜的磷脂層：溶解細胞膜的磷脂層triton x-100triton x-100：溶解內膜的雙磷脂層：溶解內膜的雙磷脂層鹽酸胍和脲鹽酸胍和脲：削弱溶質分子間的疏水：削弱溶質分子間的疏水作用，使疏水性化合物溶于水溶液作用，使疏水性化合物溶于水溶液目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離29優(yōu)點（相對機械破碎）優(yōu)點（相對機械破碎）：對產(chǎn)物釋出有一定的選擇性；對產(chǎn)物釋出有一定的選擇性；細胞保持完整，碎片少，利于進一步提取；細胞保持完整，碎片少，利于進一步提?。缓怂後尫帕可?，黏度低，便于進一步分離。核酸釋放量少，黏度低，

18、便于進一步分離。缺陷缺陷：時間長，效率低；時間長，效率低；化學試劑有毒；化學試劑有毒； 通用性差通用性差目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離305 5、酶溶法、酶溶法 機理機理：利用生物酶將細胞壁和細胞膜消化溶解。利用生物酶將細胞壁和細胞膜消化溶解。 常用的溶酶常用的溶酶：溶菌酶溶菌酶(lysozyme)(lysozyme)、-1,3-1,3-葡聚葡聚糖酶糖酶(glucanase)(glucanase)、-1-1，6-6-葡聚糖酶、蛋白酶葡聚糖酶、蛋白酶（protease)protease)、甘露糖酶、甘露糖酶(mannanase)(mannanase)、肽鏈內切、肽鏈內切酶（酶（

19、endopeptidase)endopeptidase)、殼多糖酶、殼多糖酶(chitinase)(chitinase)、細、細胞壁溶解酶（幾種酶的復合物）等。胞壁溶解酶（幾種酶的復合物）等。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離31 優(yōu)點優(yōu)點： 一定的選擇性；一定的選擇性； 細胞外形完整，核酸釋放少，有利于進一細胞外形完整，核酸釋放少，有利于進一步分離過程步分離過程 缺點缺點：（只能用于實驗室（只能用于實驗室） 產(chǎn)物抑制造成效率低下；產(chǎn)物抑制造成效率低下； 溶酶價格高；溶酶價格高； 通用性差，通用性差， 不易確定最佳條件；不易確定最佳條件；目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固

20、液分離326 6、微波加熱法、微波加熱法 機理機理：微波加熱導致細胞內極微波加熱導致細胞內極性物質，尤其是水分子吸收微波性物質，尤其是水分子吸收微波能，產(chǎn)生大量熱量，使胞內溫度能，產(chǎn)生大量熱量，使胞內溫度迅速上升，液態(tài)水汽化產(chǎn)生的壓迅速上升，液態(tài)水汽化產(chǎn)生的壓力將細胞膜和細胞壁沖裂，形成力將細胞膜和細胞壁沖裂，形成微小孔洞，進一步加熱可導致細微小孔洞，進一步加熱可導致細胞內部和細胞壁水分減少，細胞胞內部和細胞壁水分減少，細胞收縮，表面出現(xiàn)裂紋。收縮，表面出現(xiàn)裂紋。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離33 優(yōu)點優(yōu)點： 微波穿透性強，選擇性高、加熱效率高。微波穿透性強，選擇性高、加熱效

21、率高。 缺陷：缺陷： 一般只適合對熱穩(wěn)定物質的分離；一般只適合對熱穩(wěn)定物質的分離； 被處理的物料要具有良好的吸水性；被處理的物料要具有良好的吸水性； 不適于富含淀粉和樹膠等的天然植物不適于富含淀粉和樹膠等的天然植物目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離34機械破碎法與非機械破碎法的比較機械破碎法與非機械破碎法的比較比較項目比較項目機械法機械法非機械法非機械法破碎機理破碎機理切碎細胞切碎細胞溶解局部壁膜溶解局部壁膜碎片大小碎片大小碎片細小碎片細小細胞碎片較大細胞碎片較大內含物釋放內含物釋放全部全部部分部分黏度黏度高（核酸多）高（核酸多）低（核酸少）低（核酸少）時間，效率時間，效率時間短

22、，效率高時間短，效率高時間長，效率低時間長，效率低設備設備需專用設備需專用設備不需專用設備不需專用設備通用性通用性強強差差經(jīng)濟經(jīng)濟成本低成本低成本高成本高應用范圍應用范圍實驗室，工業(yè)范圍實驗室，工業(yè)范圍實驗室范圍實驗室范圍目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離35克隆表達的產(chǎn)物克隆表達的產(chǎn)物基因工程細胞基因工程細胞蛋白質蛋白質沒有活性，一級結構正確，立體構型沒有活性，一級結構正確，立體構型錯誤，無生物學活性！錯誤，無生物學活性！包涵體包涵體第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質復性蛋白質復性難溶于水，只有在變性劑溶液中才能溶解。難溶于水，只有在變性劑溶液中才能溶解。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復

23、性與固液分離36病毒在增殖的過程病毒在增殖的過程中，常使寄主細胞中，常使寄主細胞內形成一種蛋白質內形成一種蛋白質性質的病變結構性質的病變結構包涵體包涵體sem of e. coli containing inclusion bodiessem of isolated washed inclusion bodies目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離37 包含體形成原因包含體形成原因：（比較復雜，目前尚不完全清楚。）比較復雜，目前尚不完全清楚。） 缺少某些協(xié)助因子缺少某些協(xié)助因子（分子伴侶？）（分子伴侶？）或或者由于周圍物理環(huán)境（溫度等）不適，者由于周圍物理環(huán)境（溫度等）不適，使其難

24、以連續(xù)進行次級鍵的形成，中間使其難以連續(xù)進行次級鍵的形成，中間產(chǎn)物相互凝集而積累形成包含體。產(chǎn)物相互凝集而積累形成包含體。 應該考慮的事應該考慮的事：設法減少包含體的形成！設法減少包含體的形成！目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離38 減少包涵體形成的策略減少包涵體形成的策略1、 降低重組菌的生長溫度降低重組菌的生長溫度 降低培養(yǎng)溫降低培養(yǎng)溫度是減少包涵體形成的最常用的方法，較低度是減少包涵體形成的最常用的方法，較低的生長溫度的生長溫度降低了無活性聚集體形成的速率降低了無活性聚集體形成的速率和疏水相互作用，從而可減少包涵體的形成。和疏水相互作用，從而可減少包涵體的形成。目標產(chǎn)品的分

25、離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離39培養(yǎng)培養(yǎng)e.colie.coli時添加時添加高濃度的多醇類、蔗糖或非代高濃度的多醇類、蔗糖或非代謝糖謝糖可以阻止分泌的蛋白質聚集反應，在最適濃度可以阻止分泌的蛋白質聚集反應，在最適濃度范圍內添加這些添加劑不會影響細胞的生長、蛋白范圍內添加這些添加劑不會影響細胞的生長、蛋白質的合成或運輸，其它促重組蛋白質可溶性表達的質的合成或運輸，其它促重組蛋白質可溶性表達的生長添加劑還有生長添加劑還有乙醇乙醇（誘導熱休克蛋白的表達）、（誘導熱休克蛋白的表達）、低分子量的低分子量的巰基或二硫化合物巰基或二硫化合物（影響細胞周質的還（影響細胞周質的還原態(tài)，從而影響二硫鍵的形

26、成）和原態(tài)，從而影響二硫鍵的形成）和naclnacl。3 3、供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳培養(yǎng)條件供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳培養(yǎng)條件如供氧、如供氧、phph等。等。2 2、添加可促進重組蛋白質可溶性表達的生長添加添加可促進重組蛋白質可溶性表達的生長添加劑劑 目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離40 蛋白質的復性蛋白質的復性：包含體蛋白質包含體蛋白質溶解溶解于于變性劑溶液中，呈變性狀態(tài)，所有變性劑溶液中，呈變性狀態(tài)，所有的氫鍵、疏水鍵全部被破壞，疏水側的氫鍵、疏水鍵全部被破壞，疏水側鏈完全暴露，但一級結構和共價鍵不鏈完全暴露，但一級結構和共價鍵不被破壞，當除去變性劑后，一部分蛋被破壞，

27、當除去變性劑后，一部分蛋白質可以自動折疊成具有活性的正確白質可以自動折疊成具有活性的正確構型，這一構型，這一折疊過程折疊過程稱為稱為蛋白質復性蛋白質復性。如何使包涵體的構型復原成正確狀態(tài)？如何使包涵體的構型復原成正確狀態(tài)？目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離41包含體的分離及溶解包含體的分離及溶解 分離包含體：分離包含體：對培養(yǎng)收集的細胞進行對培養(yǎng)收集的細胞進行破碎破碎 ( (高壓勻漿結合溶菌酶處理高壓勻漿結合溶菌酶處理) )，然后，然后離心離心( (500020000g/r)500020000g/r)，可使大部分包涵體沉淀，可使大部分包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離。與可溶性蛋白分離

28、。 洗滌：洗滌：除去除去包涵體沉淀的包涵體沉淀的脂類和膜蛋白，脂類和膜蛋白，一一般加般加去污劑去污劑（triton x-100triton x-100或脫氧膽酸鈉）和或脫氧膽酸鈉）和低濃度變性劑低濃度變性劑（2mol/l2mol/l尿素或鹽酸胍等）。尿素或鹽酸胍等）。以以避免避免包涵體溶解和復性的過程中包涵體溶解和復性的過程中重組蛋白質的重組蛋白質的降解。降解。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離42溶解：溶解： 包涵體的溶解必須用包涵體的溶解必須用很強的很強的變性劑變性劑，通過，通過離子間的相互作用離子間的相互作用破壞包涵體蛋白間的破壞包涵體蛋白間的氫鍵氫鍵而增溶蛋白。以而增溶蛋

29、白。以異氰鹽酸胍異氰鹽酸胍的增溶效果最強，的增溶效果最強，尿素稍差；尿素稍差； 去污劑去污劑（如（如sdssds）可以破壞蛋白內的）可以破壞蛋白內的疏水鍵疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白，但由于無法徹底可以增溶幾乎所有的蛋白，但由于無法徹底去除而不允許用在制藥行業(yè)中去除而不允許用在制藥行業(yè)中； 酸酸（如（如70%70%甲酸）可以破壞蛋白的甲酸）可以破壞蛋白的次級鍵次級鍵從而增溶蛋白，這種方法只適合少數(shù)蛋白質。從而增溶蛋白，這種方法只適合少數(shù)蛋白質。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離43對于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶時應對于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶時應加入加入還原劑還原劑（如（如d

30、ttdtt、gshgsh、-me-me）打開蛋）打開蛋白質中所有二硫鍵，對于沒有二硫鍵的目白質中所有二硫鍵，對于沒有二硫鍵的目標蛋白有時也應使用還原劑，因為含二硫標蛋白有時也應使用還原劑，因為含二硫鍵的雜蛋白會影響包涵體的溶解。鍵的雜蛋白會影響包涵體的溶解。同時還應加入同時還應加入金屬螯合劑金屬螯合劑，如，如edtaedta或或egtaegta，用來螯合，用來螯合cucu2+2+、fefe3+3+等金屬離子以等金屬離子以防止其與還原狀態(tài)的巰基發(fā)生氧化反應。防止其與還原狀態(tài)的巰基發(fā)生氧化反應。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離44蛋白質的折疊機理蛋白質的折疊機理 目前有多種不同的假

31、設，但很多學目前有多種不同的假設，但很多學者認為有一個者認為有一個“熔球態(tài)熔球態(tài)”的的中間狀中間狀態(tài)態(tài)，在，在“熔球態(tài)熔球態(tài)”中，蛋白質的二中，蛋白質的二級結構已經(jīng)基本形成，其空間結構級結構已經(jīng)基本形成，其空間結構也初具規(guī)模，再做一些局部調整就也初具規(guī)模，再做一些局部調整就可形成正確的立體結構?？尚纬烧_的立體結構。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離45蛋白質的具體步驟可用下式描述：蛋白質的具體步驟可用下式描述： 伸展態(tài)伸展態(tài)中間體中間體后期中間體后期中間體天天然態(tài)體然態(tài)體聚集體聚集體目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離46核糖核酸酶的變性和復性示意圖核糖核酸酶的變性

32、和復性示意圖(a)(a)天然核糖核酸酶天然核糖核酸酶(b)(b)變性失活變性失活(c)“(c)“錯亂錯亂”核糖核酸酶核糖核酸酶目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離47 錯誤發(fā)生的機制錯誤發(fā)生的機制復性過程中，部分折疊中間體的疏水簇復性過程中，部分折疊中間體的疏水簇外露，分子間的疏水相互作用會導致蛋白外露，分子間的疏水相互作用會導致蛋白質聚集。質聚集。伸展肽鏈折疊為天然活性結構的過程受伸展肽鏈折疊為天然活性結構的過程受到周圍環(huán)境的影響，如溫度、到周圍環(huán)境的影響，如溫度、phph值、離子值、離子強度、復性時間等因素的影響。強度、復性時間等因素的影響。 目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質

33、復性與固液分離48不同條件下具體復性方式不同條件下具體復性方式1 1、透析、稀釋和超濾復性法透析、稀釋和超濾復性法：最傳統(tǒng)、應用：最傳統(tǒng)、應用最普遍，原理最普遍，原理-使變性劑濃度降低到蛋白質能使變性劑濃度降低到蛋白質能恢復折疊的濃度恢復折疊的濃度。 缺點：缺點：復性活性回收率低，而且難與雜蛋白分復性活性回收率低，而且難與雜蛋白分離。離。稀釋法稀釋法大大增加溶液體積，不利于后續(xù)的大大增加溶液體積，不利于后續(xù)的分離純化，且處理量太大，不利于工業(yè)放大分離純化，且處理量太大，不利于工業(yè)放大 ；透析法透析法耗時長，易形成無活性蛋白質聚集體；耗時長，易形成無活性蛋白質聚集體；超濾法超濾法在膜上聚集變性，

34、易造成膜污染。在膜上聚集變性，易造成膜污染。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離492 2、高蛋白濃度下的復性方法：、高蛋白濃度下的復性方法：（一個成功的復性過程在于能夠在高蛋白濃度下仍一個成功的復性過程在于能夠在高蛋白濃度下仍能得到較高的復性率。能得到較高的復性率。緩慢地連續(xù)或不連續(xù)地將變性蛋白加入到緩慢地連續(xù)或不連續(xù)地將變性蛋白加入到復性緩沖液中復性緩沖液中, ,使得蛋白質在加入過程中或使得蛋白質在加入過程中或加入階段之間有足夠的時間進行折疊復性。加入階段之間有足夠的時間進行折疊復性。因為完全折疊的蛋白通常不會與正在折疊因為完全折疊的蛋白通常不會與正在折疊的蛋白一起聚集。的蛋白

35、一起聚集。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離50溫度跳躍策略溫度跳躍策略：變性蛋白在變性蛋白在低溫低溫下復性折疊下復性折疊以減少聚集，直到易聚集的以減少聚集，直到易聚集的中間體大都轉化為中間體大都轉化為不易聚集的不易聚集的后期中間體后后期中間體后，溫度快速升高溫度快速升高來促來促進后期中間體快速折疊為蛋白的天然構象。進后期中間體快速折疊為蛋白的天然構象。復性在中等的變性劑濃度下進行復性在中等的變性劑濃度下進行，變性，變性劑濃度應劑濃度應高到高到足以有效防止聚集，同時又必足以有效防止聚集，同時又必須須低到低到能夠引發(fā)正確復性。能夠引發(fā)正確復性。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性

36、與固液分離513 3、添加促進劑的復性方法添加促進劑的復性方法： 包涵體蛋白質折疊復性促進劑的促包涵體蛋白質折疊復性促進劑的促進作用可以分為：進作用可以分為：穩(wěn)定正確穩(wěn)定正確折疊蛋白質折疊蛋白質的天然結構、的天然結構、改變錯誤改變錯誤折疊蛋白質的穩(wěn)折疊蛋白質的穩(wěn)定性、定性、增加增加折疊復性折疊復性中間體中間體的溶解性、的溶解性、增加非折疊蛋白質的溶解性增加非折疊蛋白質的溶解性。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離52常用促進劑常用促進劑：a、共溶劑共溶劑：如通過與中間體特異的形成非聚集復合物，阻止蛋如通過與中間體特異的形成非聚集復合物，阻止蛋白質分子間的相互碰撞機會，減少蛋白質的聚

37、集；白質分子間的相互碰撞機會，減少蛋白質的聚集；b、去污劑及表面活性劑去污劑及表面活性劑：如如trition x-100trition x-100、chapschaps、磷、磷脂、磺基甜菜堿等對蛋白質復性有促進作用，但它們能與蛋白質脂、磺基甜菜堿等對蛋白質復性有促進作用，但它們能與蛋白質結合，很難去除；結合，很難去除；c、氧化氧化- -還原劑還原劑：對于含有二硫鍵的蛋白，復性過程中應加對于含有二硫鍵的蛋白，復性過程中應加入氧化還原體系，通過促進不正確形成的二硫鍵快速交換反應，入氧化還原體系，通過促進不正確形成的二硫鍵快速交換反應，提高了正確配對的二硫鍵的產(chǎn)率；提高了正確配對的二硫鍵的產(chǎn)率；d、

38、小分子的添加劑小分子的添加劑：如鹽酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺如鹽酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺類等，都可阻止蛋白聚集。類等，都可阻止蛋白聚集。e、0.40.6m l-arg：l-argl-arg能使得不正確折疊的蛋白質結構能使得不正確折疊的蛋白質結構以及不正確連接的二硫鍵變得不穩(wěn)定，使折疊向正確方向進行，以及不正確連接的二硫鍵變得不穩(wěn)定，使折疊向正確方向進行，可大幅度地提高包涵體蛋白質的折疊效率?？纱蠓鹊靥岣甙w蛋白質的折疊效率。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離53f、添加分子伴侶和折疊酶添加分子伴侶和折疊酶g、人工伴侶人工伴侶h、單克隆抗體單克隆抗體i、其它其它：多聚離子

39、化合物、甘油等。多聚離子化合物、甘油等。此外，有：此外，有：目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離544、液相色譜（液相色譜（lclc）復性法：）復性法： 疏水相互作用色譜（疏水相互作用色譜（hichic）、離子交換色譜）、離子交換色譜（ieciec）、凝膠排阻色譜（）、凝膠排阻色譜（secsec）、親和色譜）、親和色譜（afcafc）已成功的對變性蛋白進行了復性。其）已成功的對變性蛋白進行了復性。其中中hichic的分離效果較理想的分離效果較理想；secsec最差；最差；鹽酸鹽酸胍會在胍會在ieciec柱上保留，與蛋白一起洗脫下來；柱上保留，與蛋白一起洗脫下來；afcafc使用范圍

40、窄、所需時間長、價格昂貴，使用范圍窄、所需時間長、價格昂貴，。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離55 變性蛋白在變性蛋白在hichic上的復性機理上的復性機理： 當?shù)鞍踪|、變性劑和雜蛋白進入當?shù)鞍踪|、變性劑和雜蛋白進入hichic系統(tǒng)后，系統(tǒng)后，變性劑在柱上的作用力較弱，變性蛋白質變性劑在柱上的作用力較弱，變性蛋白質的作用力較強的作用力較強，變性劑首先同變性的蛋白，變性劑首先同變性的蛋白質分離，隨流動相一起流出色譜柱。隨著質分離，隨流動相一起流出色譜柱。隨著流動相的不斷變化，變性蛋白質不斷地在流動相的不斷變化，變性蛋白質不斷地在固定相表面上進行固定相表面上進行吸附吸附- -解吸附

41、解吸附- -再吸附再吸附，并在此過程中逐漸被復性，形成與天然蛋并在此過程中逐漸被復性，形成與天然蛋白質構象相同的蛋白質，并流出色譜柱白質構象相同的蛋白質，并流出色譜柱。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離56液相色譜復性的優(yōu)點：液相色譜復性的優(yōu)點：（與傳統(tǒng)的稀釋法和透析法相比）與傳統(tǒng)的稀釋法和透析法相比）在進樣后在進樣后可很快除去變性劑可很快除去變性劑；色譜固定相對變性蛋白質的吸附可明顯的減色譜固定相對變性蛋白質的吸附可明顯的減少、甚至完全消除變性蛋白質分子在脫離變性少、甚至完全消除變性蛋白質分子在脫離變性劑環(huán)境后的分子聚集，從而劑環(huán)境后的分子聚集，從而避免了沉淀的產(chǎn)生，避免了沉淀

42、的產(chǎn)生，提高蛋白質復性的質量和活性回收率提高蛋白質復性的質量和活性回收率；在蛋白質復性同時，可使目標蛋白質與雜蛋在蛋白質復性同時，可使目標蛋白質與雜蛋白分離達到純化的目的，白分離達到純化的目的，使復性和純化同時進使復性和純化同時進行行；便于回收變性劑，降低廢水處理成本便于回收變性劑，降低廢水處理成本。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離575、反膠束復性法反膠束復性法：表面活性劑的極表面活性劑的極 性頭朝內，疏水性頭朝內，疏水 的尾部向外，中的尾部向外，中 間形成極性的間形成極性的“核核”有機溶劑有機溶劑極性極性“頭頭”極性的極性的“核核”非極性非極性“尾尾”蛋白質在反膠束內水相中

43、可以蛋白質在反膠束內水相中可以保持其構象和活性，這樣可使保持其構象和活性，這樣可使蛋白質相互分離，減少了蛋白蛋白質相互分離，減少了蛋白質折疊過程中的聚集作用。質折疊過程中的聚集作用。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離58第四節(jié)第四節(jié) 固液分離固液分離 分離細胞、細胞碎片、包含體、沉淀分離細胞、細胞碎片、包含體、沉淀物等的手段，物等的手段，不僅應用于初級階段，不僅應用于初級階段，而且也應用于精制階段而且也應用于精制階段。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離59一、離心沉降一、離心沉降 根據(jù)固體和液體之間的根據(jù)固體和液體之間的密度差密度差, ,利用離心機利用離心機提供的離

44、心力實現(xiàn)固液分離。提供的離心力實現(xiàn)固液分離。 優(yōu)點：技術易掌握；結果重復性好優(yōu)點：技術易掌握；結果重復性好 沉降的難易取決于固體物質和液體的密度沉降的難易取決于固體物質和液體的密度差差, ,同時還取決于固體和液體的其他性質以同時還取決于固體和液體的其他性質以及離心機的離心能力及離心機的離心能力.(.(可以顆?？梢灶w粒沉降速度沉降速度表示表示) )目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離60 斯托克斯公式斯托克斯公式(stokes):(stokes): uc=d uc=d2 2( (s s- -l l)r)r2 2/18/18ucuc顆粒沉降速度顆粒沉降速度; ;dd顆粒直徑顆粒直徑(

45、(假定為球形假定為球形) )ss固體密度固體密度ll液體密度液體密度rr離心半徑離心半徑; ; 角速度角速度; ; (r(r2 2: :離心力離心力) )液體粘度液體粘度目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離61 分離因數(shù)分離因數(shù): : a= (ra= (r2 2: :離心力離心力)/g)/g aa衡量離心力的大小衡量離心力的大小主要指標主要指標, ,應應該主要是增大角速度而不是直徑。該主要是增大角速度而不是直徑。 提高離心效果可通過提高離心效果可通過增加轉速和延長增加轉速和延長時間時間來取得。來取得。 (r(r2 2: :離心力離心力):):固液分離最重要的影響因素固液分離最重要的

46、影響因素目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離62轉筒常規(guī)工業(yè)用離心機轉筒常規(guī)工業(yè)用離心機（-張家港華大離心機公司）張家港華大離心機公司） sscssc型離心機為三足式上型離心機為三足式上部人工卸料沉降離心機，部人工卸料沉降離心機，該系列離心機裝鼓壁上無該系列離心機裝鼓壁上無孔，屬沉降型轉鼓，操作孔，屬沉降型轉鼓，操作維修方便。主要適用于維修方便。主要適用于固固相顆粒細小，懸浮液粘性相顆粒細小，懸浮液粘性較大，過濾介質再生困難，較大，過濾介質再生困難，且含量較少的懸浮液的固且含量較少的懸浮液的固液分離。液分離。 目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離63管式工業(yè)用離心機管式

47、工業(yè)用離心機（-張家港華大離心機公司）張家港華大離心機公司） 懸浮液從進料管進入轉鼓，懸浮液從進料管進入轉鼓，固相顆粒在離心力場作用下固相顆粒在離心力場作用下受到離心力的加速沉降至轉受到離心力的加速沉降至轉鼓內壁，沉降的顆粒在螺旋鼓內壁，沉降的顆粒在螺旋輸送器葉片的推動下，從輸送器葉片的推動下，從（直筒段）沉降區(qū)通過（錐（直筒段）沉降區(qū)通過（錐段）干燥區(qū)至固相出口排出；段）干燥區(qū)至固相出口排出；經(jīng)澄清的液相從溢流孔溢出。經(jīng)澄清的液相從溢流孔溢出。從而實現(xiàn)固、液相自動、連從而實現(xiàn)固、液相自動、連續(xù)的分離。續(xù)的分離。 可應用于脫水、濃縮、分級可應用于脫水、濃縮、分級澄清等不同場合。澄清等不同場合。

48、目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離64目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離65刮刀卸料工業(yè)用離心機刮刀卸料工業(yè)用離心機（-張家港華大離心機公司）張家港華大離心機公司）主電機帶動套裝的內外轉鼓全主電機帶動套裝的內外轉鼓全速旋轉，物料由進料管引入轉速旋轉，物料由進料管引入轉鼓，在離心力作用下，液相物鼓，在離心力作用下，液相物穿過濾布和內轉鼓壁濾孔排出穿過濾布和內轉鼓壁濾孔排出內轉鼓，匯集到內外轉鼓間的內轉鼓，匯集到內外轉鼓間的間隙內，穿過到虹吸室的通孔間隙內，穿過到虹吸室的通孔進入虹吸室，再由虹吸裝置抽進入虹吸室，再由虹吸裝置抽走排出機外。固相物截留在內走排出機外。固相物

49、截留在內轉鼓形成環(huán)形濾餅層。進料達轉鼓形成環(huán)形濾餅層。進料達到預定容積后停止進料，進一到預定容積后停止進料，進一步分離，此時可進行洗滌。洗步分離，此時可進行洗滌。洗滌、分離結束，刮刀自動旋轉，滌、分離結束，刮刀自動旋轉，將固相物刮下經(jīng)輸料螺旋排出將固相物刮下經(jīng)輸料螺旋排出機外，然后自動洗網(wǎng)，開始下機外，然后自動洗網(wǎng)，開始下一個循環(huán)。一個循環(huán)。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離66二、微孔膜過濾二、微孔膜過濾根據(jù)根據(jù)流體各組分尺寸大小的不同流體各組分尺寸大小的不同，利利用用高分子聚合膜，過濾分離高分子聚合膜，過濾分離微米級的微米級的細胞、細胞碎片和生物大分子的過程。細胞、細胞碎片和

50、生物大分子的過程。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離67切割分子量切割分子量? ?mwco 微濾（微濾（0.10.1 1010 m)m)：分離固體顆粒分離固體顆粒 超濾超濾（0.0010.001 0.10.1 m)m)：濃縮大分子物質濃縮大分子物質 反滲透（反滲透（0.0010.001 m)m)：從小分子中脫除水分從小分子中脫除水分微孔膜過濾的微孔膜過濾的3 3種方式：種方式：目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離68缺點：缺點：技術難以掌握，影響因素多；技術難以掌握，影響因素多；穩(wěn)定性和重復性不好；穩(wěn)定性和重復性不好； 膜堵塞問題難以解決！膜堵塞問題難以解決！優(yōu)點：優(yōu)

51、點：容易做到封閉式操作，不受環(huán)境污染容易做到封閉式操作，不受環(huán)境污染設備投資少，操作安全；設備投資少，操作安全；加工量可大可小，十分方便；加工量可大可小，十分方便； 有利于分離密度差小而難以離心的固體，有利于分離密度差小而難以離心的固體，可直接用于下游的層析過程?？芍苯佑糜谙掠蔚膶游鲞^程。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離69微濾技術要點：微濾技術要點： 選擇選擇合適的膜合適的膜：不與蛋白質、脂類等發(fā)生吸附；不與蛋白質、脂類等發(fā)生吸附；孔徑合適?？讖胶线m。不銹鋼板式過濾器不銹鋼板式過濾器不銹鋼杯式過濾器不銹鋼杯式過濾器正壓過濾器正壓過濾器機電一體式微機電一體式微濾過濾系統(tǒng)濾過濾系

52、統(tǒng) 目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離70微濾技術要點：微濾技術要點：2.2.選擇合適的操作條件：選擇合適的操作條件： 過濾方程（達西公式）：過濾方程（達西公式）：v= =p/p/(rc+rm)(rc+rm)v：過濾速度，：過濾速度，p p：壓力差，：壓力差，：濾液粘度，：濾液粘度，rcrc：濾餅阻力，：濾餅阻力，rmrm：過濾介質（膜）的阻力。：過濾介質（膜）的阻力。p p恒定，恒定，rcrc增加，增加，v降低降低 保持保持v不變則需阻止濾餅生成或不增厚。若不變則需阻止濾餅生成或不增厚。若rmrm和和不變，不變，則則v恒定，因為恒定，因為p p增加會加大增加會加大rcrc。目標

53、產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離713.3.膜材料的新發(fā)展膜材料的新發(fā)展無機陶瓷膜無機陶瓷膜優(yōu)點優(yōu)點：（機械強度大、惰性更大）（機械強度大、惰性更大） 孔徑均勻，過濾效果好；孔徑均勻，過濾效果好； 耐蒸氣消毒、耐酸堿和有機溶劑；耐蒸氣消毒、耐酸堿和有機溶劑； 堅固耐用，使用壽命長；堅固耐用，使用壽命長； 可以加壓反向沖洗可以加壓反向沖洗缺點缺點：造價高；過濾面積??；表現(xiàn)對蛋白質一定的吸附；造價高；過濾面積??；表現(xiàn)對蛋白質一定的吸附；目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離72各種微孔膜柱及設備各種微孔膜柱及設備目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離73各種微孔膜柱

54、及設備各種微孔膜柱及設備目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離74操作方式操作方式 切向流過濾切向流過濾：（懸浮液沿與濾膜水平的方向流動，因此過濾（懸浮液沿與濾膜水平的方向流動，因此過濾過程中不斷帶走堆積在介質表面的固體物過程中不斷帶走堆積在介質表面的固體物質，不會形成濾餅層而使膜堵塞。質，不會形成濾餅層而使膜堵塞。 ）一種維持恒壓下高過濾速度的技術。一種維持恒壓下高過濾速度的技術。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離75原理原理：當移走固體與固體沉積速率相：當移走固體與固體沉積速率相同時，過濾速度就保持恒定，控制不同的切同時，過濾速度就保持恒定，控制不同的切向流速度就可

55、以得到不同的過濾速度。向流速度就可以得到不同的過濾速度。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離76sartocon slicesartocon slice整體整體型型切向流過濾切向流過濾系統(tǒng)系統(tǒng)德國德國sartorius vivaflow 50 sartorius vivaflow 50 回旋流回旋流/ /切向流超濾器切向流超濾器目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離77在膜表面加以攪拌造成流動在膜表面加以攪拌造成流動目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離78使膜相對于懸浮液運動（將使膜相對于懸浮液運動（將膜附于圓筒上高速旋轉）膜附于圓筒上高速旋轉）目標產(chǎn)品的分離

56、與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離79目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離80切向流過濾的缺點切向流過濾的缺點產(chǎn)生的剪切力使蛋白質產(chǎn)物失活，流速產(chǎn)生的剪切力使蛋白質產(chǎn)物失活，流速越快，失活越嚴重；越快，失活越嚴重；懸浮液在流動過程中有壓力損失，能耗懸浮液在流動過程中有壓力損失，能耗消耗大；消耗大；不能避免膜的污染和堵塞，當膜的阻力不能避免膜的污染和堵塞，當膜的阻力增大時，無法防止過濾速度的下降；增大時，無法防止過濾速度的下降；目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離81、脈沖反洗切向流過濾、脈沖反洗切向流過濾 原理原理：在切向流過濾中在切向流過濾中間歇地在膜的背間歇地在膜的

57、背面加一反壓面加一反壓，迫使部分濾液反透過膜以，迫使部分濾液反透過膜以沖掉膜上的固體沉積和膜孔中的堵塞物，沖掉膜上的固體沉積和膜孔中的堵塞物，使過濾速度保持在比較高的水平。使過濾速度保持在比較高的水平。目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離82目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離83、調整生化懸浮液的性質、調整生化懸浮液的性質 調整調整phph值和離子強度；值和離子強度； 加入絮凝劑；加入絮凝劑； 加入過濾助劑（硅藻土系列）加入過濾助劑（硅藻土系列）目標產(chǎn)品的分離與純化細胞破碎蛋白質復性與固液分離84三、雙水相萃取三、雙水相萃取 原理原理：利用利用被提取物在二相中的分配不同實被提取物在二相中的分配不同實現(xiàn)分離目的。現(xiàn)分離目的。由于蛋白質在有機相中容易失活，由于蛋白質在有機相中容易失活，因此采用的二相均為親水相，如因此采用的二相均為親水相，如peg/peg