第六章動(dòng)物繁殖技術(shù)

1、一、卵子和胚胎冷凍保存的意義一、卵子和胚胎冷凍保存的意義 采取特殊的保護(hù)措施和降溫程序，使胚胎或采取特殊的保護(hù)措施和降溫程序，使胚胎或卵母細(xì)胞在卵母細(xì)胞在-196下停止代謝，而升溫后又下停止代謝，而升溫后又不失去代謝能力的一種長(zhǎng)期保存胚胎和卵母不失去代謝能力的一種長(zhǎng)期保存胚胎和卵母細(xì)胞的技術(shù)。細(xì)胞的技術(shù)。（一）定義（一）定義1. 建立優(yōu)良品種的胚胎庫(kù)或基因庫(kù)，保存動(dòng)物品種、品系和稀有突變體；建立優(yōu)良品種的胚胎庫(kù)或基因庫(kù)，保存動(dòng)物品種、品系和稀有突變體；2. 運(yùn)輸胚胎代替活畜的運(yùn)輸，節(jié)省運(yùn)輸費(fèi)用和檢疫費(fèi)用，減少疾病傳播；運(yùn)輸胚胎代替活畜的運(yùn)輸，節(jié)省運(yùn)輸費(fèi)用和檢疫費(fèi)用，減少疾病傳播；3. 控制品種

2、內(nèi)的遺傳穩(wěn)定性和維持某些近交系動(dòng)物的遺傳一致性，節(jié)省大量時(shí)控制品種內(nèi)的遺傳穩(wěn)定性和維持某些近交系動(dòng)物的遺傳一致性，節(jié)省大量時(shí)間和資金；間和資金；凍胚移植還有鮮胚移植所不可比擬的優(yōu)越性。凍胚移植還有鮮胚移植所不可比擬的優(yōu)越性。（二）卵子和胚胎冷凍保存的意義（二）卵子和胚胎冷凍保存的意義v19521952年，年，smithsmith報(bào)道用甘油作保護(hù)劑，對(duì)兔的受報(bào)道用甘油作保護(hù)劑，對(duì)兔的受精卵進(jìn)行慢速冷凍。但當(dāng)時(shí)無(wú)法判定該技術(shù)是否精卵進(jìn)行慢速冷凍。但當(dāng)時(shí)無(wú)法判定該技術(shù)是否成熟。成熟。v19721972年，年，whittinghamwhittingham等首次實(shí)現(xiàn)了小鼠胚胎的等首次實(shí)現(xiàn)了小鼠胚胎的超低

3、溫冷凍保存，凍胚解凍后移植，產(chǎn)出正常后超低溫冷凍保存，凍胚解凍后移植，產(chǎn)出正常后代。這種方法已廣泛應(yīng)用于牛、綿羊、山羊、馬代。這種方法已廣泛應(yīng)用于牛、綿羊、山羊、馬、家兔、豬等其它哺乳動(dòng)物的胚胎超低溫保存。、家兔、豬等其它哺乳動(dòng)物的胚胎超低溫保存。v1985年，年， rall和和fahy率先將玻璃化冷凍技術(shù)應(yīng)用于率先將玻璃化冷凍技術(shù)應(yīng)用于鼠胚胎的冷凍保存。鼠胚胎的冷凍保存。v所謂所謂玻璃化玻璃化是指利用物理學(xué)原理，將高濃度的冷凍是指利用物理學(xué)原理，將高濃度的冷凍保護(hù)劑急速降溫后，使其由液態(tài)轉(zhuǎn)化為外形似玻璃保護(hù)劑急速降溫后，使其由液態(tài)轉(zhuǎn)化為外形似玻璃狀的穩(wěn)定且透明的非晶體化固態(tài)，但并沒(méi)有改變其狀

4、的穩(wěn)定且透明的非晶體化固態(tài)，但并沒(méi)有改變其在液態(tài)時(shí)的分子和離子分布。玻璃化可避免在細(xì)胞在液態(tài)時(shí)的分子和離子分布。玻璃化可避免在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生傷害。內(nèi)形成冰晶而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生傷害。p冷凍和解凍處理盡管對(duì)胚胎有一定的損傷，但將冷凍和解凍處理盡管對(duì)胚胎有一定的損傷，但將解凍胚胎在體外培養(yǎng)一段時(shí)間后可恢復(fù)正常的形解凍胚胎在體外培養(yǎng)一段時(shí)間后可恢復(fù)正常的形態(tài)。目前，牛冷凍胚胎移植后的妊娠率與鮮胚移態(tài)。目前，牛冷凍胚胎移植后的妊娠率與鮮胚移植的妊娠率相似。植的妊娠率相似。p卵母細(xì)胞體積大，不易充分脫水，故冷凍不易成卵母細(xì)胞體積大，不易充分脫水，故冷凍不易成功。功。 vwhittingham（197

5、7）首次成功地冷凍保）首次成功地冷凍保存小鼠卵母細(xì)胞以來(lái)，人們?cè)诖朔矫孢M(jìn)行存小鼠卵母細(xì)胞以來(lái)，人們?cè)诖朔矫孢M(jìn)行了大量的研究。玻璃化法冷凍的小鼠成熟了大量的研究。玻璃化法冷凍的小鼠成熟卵母細(xì)胞體外受精及胚胎移植后產(chǎn)仔率已卵母細(xì)胞體外受精及胚胎移植后產(chǎn)仔率已達(dá)達(dá)20%38%。p目前已有關(guān)于人、小鼠、牛等卵母細(xì)胞冷凍目前已有關(guān)于人、小鼠、牛等卵母細(xì)胞冷凍成功的報(bào)道，但其成功率較低。成功的報(bào)道，但其成功率較低。p于永存等（于永存等（2002）報(bào)道，用玻璃化法冷凍保）報(bào)道，用玻璃化法冷凍保存牛存牛gv期卵母細(xì)胞，解凍后其體外成熟率期卵母細(xì)胞，解凍后其體外成熟率、體外受精率和卵裂率分別為、體外受精率和卵裂

6、率分別為21.6%、15.1%和和11.1%，顯著高于程序冷凍法和超，顯著高于程序冷凍法和超快速冷凍法的效果?？焖倮鋬龇ǖ男Ч?。 當(dāng)生物細(xì)胞在水溶液中冷卻時(shí)，細(xì)胞和培養(yǎng)液均先處于過(guò)冷當(dāng)生物細(xì)胞在水溶液中冷卻時(shí)，細(xì)胞和培養(yǎng)液均先處于過(guò)冷狀態(tài)，然后才發(fā)生凍結(jié)。在大多數(shù)情況下，細(xì)胞的過(guò)冷程度比狀態(tài)，然后才發(fā)生凍結(jié)。在大多數(shù)情況下，細(xì)胞的過(guò)冷程度比周圍溶液更深，細(xì)胞外溶液先結(jié)冰，使溶質(zhì)濃縮，導(dǎo)致細(xì)胞外周圍溶液更深，細(xì)胞外溶液先結(jié)冰，使溶質(zhì)濃縮，導(dǎo)致細(xì)胞外環(huán)境滲透壓升高。若降溫足夠慢，可通過(guò)脫水來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境滲透壓升高。若降溫足夠慢，可通過(guò)脫水來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境滲透壓平衡；但是降溫過(guò)慢，細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間處

7、于高滲環(huán)境中環(huán)境滲透壓平衡；但是降溫過(guò)慢，細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間處于高滲環(huán)境中易產(chǎn)生滲透休克；若降溫過(guò)快，細(xì)胞內(nèi)水分來(lái)不及移到細(xì)胞外易產(chǎn)生滲透休克；若降溫過(guò)快，細(xì)胞內(nèi)水分來(lái)不及移到細(xì)胞外而形成冰晶。胞漿內(nèi)結(jié)冰過(guò)多會(huì)破壞細(xì)胞器，刺破細(xì)胞膜，導(dǎo)而形成冰晶。胞漿內(nèi)結(jié)冰過(guò)多會(huì)破壞細(xì)胞器，刺破細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。通過(guò)凍前在稀釋液中加入一定濃度的低溫保護(hù)劑，致細(xì)胞死亡。通過(guò)凍前在稀釋液中加入一定濃度的低溫保護(hù)劑，讓細(xì)胞在保護(hù)劑中平衡并適當(dāng)脫水，可降低其損傷。讓細(xì)胞在保護(hù)劑中平衡并適當(dāng)脫水，可降低其損傷。v一般卵子或胚胎在冷凍過(guò)程中不可避免要形一般卵子或胚胎在冷凍過(guò)程中不可避免要形成細(xì)胞內(nèi)冰晶，但只要不形成大冰晶，而

8、是成細(xì)胞內(nèi)冰晶，但只要不形成大冰晶，而是維持微晶（冰核）狀態(tài)，細(xì)胞將不受傷害。維持微晶（冰核）狀態(tài)，細(xì)胞將不受傷害。v胚胎在冷凍過(guò)程中，大約在胚胎在冷凍過(guò)程中，大約在-10以上細(xì)胞內(nèi)以上細(xì)胞內(nèi)不結(jié)冰，而在不結(jié)冰，而在-10以下時(shí)，過(guò)冷胞質(zhì)就形成以下時(shí)，過(guò)冷胞質(zhì)就形成冰晶。冰晶。v冷凍可引起卵母細(xì)胞冷凍可引起卵母細(xì)胞zp收縮，破壞細(xì)胞骨架，損傷收縮，破壞細(xì)胞骨架，損傷細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的完整性，還能損傷細(xì)胞整細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的完整性，還能損傷細(xì)胞整體，阻礙極體產(chǎn)生，增加體，阻礙極體產(chǎn)生，增加dna不穩(wěn)定性而導(dǎo)致染色不穩(wěn)定性而導(dǎo)致染色體異常。體異常。v為避免此類現(xiàn)象的發(fā)生，一般于為避免此類現(xiàn)

9、象的發(fā)生，一般于-7時(shí)采用植冰法時(shí)采用植冰法及時(shí)啟動(dòng)脫水過(guò)程，從而在較高的溫度下誘導(dǎo)形成及時(shí)啟動(dòng)脫水過(guò)程，從而在較高的溫度下誘導(dǎo)形成結(jié)晶，逐漸擴(kuò)散至整個(gè)溶液，避免冰晶突然形成。結(jié)晶，逐漸擴(kuò)散至整個(gè)溶液，避免冰晶突然形成。 v胚胎和卵子在冷凍和解凍過(guò)程中兩次通過(guò)冰晶形胚胎和卵子在冷凍和解凍過(guò)程中兩次通過(guò)冰晶形成危險(xiǎn)區(qū)（成危險(xiǎn)區(qū)（-15-50），采取適當(dāng)冷凍方法和），采取適當(dāng)冷凍方法和低溫保護(hù)劑，使其安全通過(guò)危險(xiǎn)溫區(qū)。低溫保護(hù)劑，使其安全通過(guò)危險(xiǎn)溫區(qū)。v進(jìn)行冷凍處理前，向保存液中加入保護(hù)劑（如甘進(jìn)行冷凍處理前，向保存液中加入保護(hù)劑（如甘油），改變細(xì)胞膜滲透性和溶液滲透壓，防止溶油），改變細(xì)胞膜滲透

10、性和溶液滲透壓，防止溶液效應(yīng)和滲透壓差異，減少降溫和復(fù)溫過(guò)程冰晶液效應(yīng)和滲透壓差異，減少降溫和復(fù)溫過(guò)程冰晶的形成。的形成。v常規(guī)冷凍保存胚胎是在胚胎脫水前誘導(dǎo)結(jié)晶，然常規(guī)冷凍保存胚胎是在胚胎脫水前誘導(dǎo)結(jié)晶，然后緩慢降溫脫水，解凍時(shí)快速?gòu)?fù)溫到常溫。后緩慢降溫脫水，解凍時(shí)快速?gòu)?fù)溫到常溫。v玻璃化法玻璃化法使用的玻璃化液是一種粘稠的玻璃態(tài)物使用的玻璃化液是一種粘稠的玻璃態(tài)物質(zhì)，低溫時(shí)不結(jié)晶就可固化。胚胎在此溶液中脫質(zhì)，低溫時(shí)不結(jié)晶就可固化。胚胎在此溶液中脫水到一定程度，可引起內(nèi)源性大分子和已滲入的水到一定程度，可引起內(nèi)源性大分子和已滲入的保護(hù)劑濃縮，從而使細(xì)胞在急劇降溫過(guò)程中得以保護(hù)劑濃縮，從而使細(xì)

11、胞在急劇降溫過(guò)程中得以保護(hù)。保護(hù)。（一）抗凍劑的種類（一）抗凍劑的種類1. 低分子滲透型冷凍保護(hù)劑低分子滲透型冷凍保護(hù)劑甘油（甘油（gl）、二甲基亞砜（）、二甲基亞砜（dmso）、丙二醇（）、丙二醇（pg）、乙二醇（）、乙二醇（eg）、）、1，3丁二醇（丁二醇（bg）、甲基溶纖劑（）、甲基溶纖劑（mc）、乙酰胺（）、乙酰胺（ac）、聚乙二醇（）、聚乙二醇（peg）等。等。（一）抗凍劑的種類（一）抗凍劑的種類 抗凍物質(zhì)一般為小分子物質(zhì)，在抗凍物質(zhì)一般為小分子物質(zhì)，在0以上很容易通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。加入以上很容易通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。加入保護(hù)劑后，細(xì)胞內(nèi)部冰晶形成溫度顯著降低。此外，保護(hù)劑與水分

12、子結(jié)合形成氫保護(hù)劑后，細(xì)胞內(nèi)部冰晶形成溫度顯著降低。此外，保護(hù)劑與水分子結(jié)合形成氫鍵，從而降低凍結(jié)部分電解質(zhì)濃度，減少對(duì)細(xì)胞的損傷。鍵，從而降低凍結(jié)部分電解質(zhì)濃度，減少對(duì)細(xì)胞的損傷。（1）小分子物質(zhì)）小分子物質(zhì) 單糖（如葡萄糖），雙糖（如蔗單糖（如葡萄糖），雙糖（如蔗糖、海藻糖），三糖（如棉子糖）和其它糖類。糖、海藻糖），三糖（如棉子糖）和其它糖類。（2）高分子物質(zhì)）高分子物質(zhì) 聚乙烯吡咯烷酮（聚乙烯吡咯烷酮（pvp）、白蛋）、白蛋白、左旋糖苷、聚乙烯醇（白、左旋糖苷、聚乙烯醇（pva）、羥乙基淀粉）、羥乙基淀粉和蛋黃等。和蛋黃等。 主要通過(guò)改變滲透壓，引起細(xì)胞脫水，從而發(fā)揮主要通過(guò)改變滲透壓

13、，引起細(xì)胞脫水，從而發(fā)揮非特異性保護(hù)作用，又稱為細(xì)胞外冷凍保護(hù)劑。非特異性保護(hù)作用，又稱為細(xì)胞外冷凍保護(hù)劑。2. 2. 非滲透型冷凍保護(hù)劑非滲透型冷凍保護(hù)劑v不論是細(xì)胞滲透性還是細(xì)胞非滲透性的保護(hù)劑都主要不論是細(xì)胞滲透性還是細(xì)胞非滲透性的保護(hù)劑都主要是為了給細(xì)胞造成脫水狀態(tài)，但脫水的同時(shí)不能影響是為了給細(xì)胞造成脫水狀態(tài)，但脫水的同時(shí)不能影響到細(xì)胞的生存；減少細(xì)胞外大冰晶的形成對(duì)細(xì)胞造成到細(xì)胞的生存；減少細(xì)胞外大冰晶的形成對(duì)細(xì)胞造成的損害也是冷凍應(yīng)注意的方面之一。的損害也是冷凍應(yīng)注意的方面之一。v業(yè)已證實(shí)，單純就低溫保存而言，影響細(xì)胞冷凍保存業(yè)已證實(shí)，單純就低溫保存而言，影響細(xì)胞冷凍保存的關(guān)鍵因

14、素，是細(xì)胞冷凍和復(fù)溫過(guò)程中，必須兩次經(jīng)的關(guān)鍵因素，是細(xì)胞冷凍和復(fù)溫過(guò)程中，必須兩次經(jīng)過(guò)冰晶形成和重結(jié)晶的中間損傷溫度區(qū)。在冷凍過(guò)程過(guò)冰晶形成和重結(jié)晶的中間損傷溫度區(qū)。在冷凍過(guò)程中，如果含水量過(guò)多，細(xì)胞可能毀于過(guò)度冰晶形成。中，如果含水量過(guò)多，細(xì)胞可能毀于過(guò)度冰晶形成。但脫水過(guò)度，細(xì)胞也可能死亡。但脫水過(guò)度，細(xì)胞也可能死亡。v理想的冷凍方案理想的冷凍方案是：找到細(xì)胞含水過(guò)多和脫水過(guò)是：找到細(xì)胞含水過(guò)多和脫水過(guò)度之間的平衡點(diǎn)；合適劑量的冷凍保護(hù)劑，既可度之間的平衡點(diǎn)；合適劑量的冷凍保護(hù)劑，既可以取代細(xì)胞質(zhì)膜周圍的水分子，又避免以取代細(xì)胞質(zhì)膜周圍的水分子，又避免“溶質(zhì)效應(yīng)溶質(zhì)效應(yīng)”；合適的冷凍速率。

15、；合適的冷凍速率。 單一保護(hù)劑很難達(dá)到胚胎或卵子的冷凍要求。在常單一保護(hù)劑很難達(dá)到胚胎或卵子的冷凍要求。在常規(guī)冷凍方法中，一般選擇一種保護(hù)劑（如甘油或乙規(guī)冷凍方法中，一般選擇一種保護(hù)劑（如甘油或乙二醇）。二醇）。在快速冷凍和玻璃化冷凍中常采用多種保護(hù)劑組成在快速冷凍和玻璃化冷凍中常采用多種保護(hù)劑組成的混合保護(hù)劑，如甘油和乙二醇、甘油和丙二醇、的混合保護(hù)劑，如甘油和乙二醇、甘油和丙二醇、丙二醇和乙二醇、乙二醇和二甲基亞砜等，再輔以丙二醇和乙二醇、乙二醇和二甲基亞砜等，再輔以糖類。糖類。3.3.混合保護(hù)劑混合保護(hù)劑低溫保護(hù)劑的選擇一般要考慮保護(hù)效果、低溫保護(hù)劑的選擇一般要考慮保護(hù)效果、胚胎毒性和脫

16、除是否容易，要求所用冷凍胚胎毒性和脫除是否容易，要求所用冷凍保護(hù)劑的效果好，毒性低且解凍后易于脫保護(hù)劑的效果好，毒性低且解凍后易于脫除。除。3.3.混合保護(hù)劑混合保護(hù)劑scholander等（等（1957）報(bào)道，北極魚(yú)可以在）報(bào)道，北極魚(yú)可以在-18的水中生存，它的血清的凝固點(diǎn)大約的水中生存，它的血清的凝固點(diǎn)大約比這一溫度高比這一溫度高1，從這種動(dòng)物體內(nèi)分離一，從這種動(dòng)物體內(nèi)分離一種抗凍蛋白（種抗凍蛋白（afp）。目前，在植物、昆）。目前，在植物、昆蟲(chóng)、細(xì)菌和真菌都發(fā)現(xiàn)并分離出蟲(chóng)、細(xì)菌和真菌都發(fā)現(xiàn)并分離出afp。4. 抗凍蛋白（抗凍蛋白（afp）afp是一種具有特殊功能的蛋白質(zhì)，在低溫是一種具

17、有特殊功能的蛋白質(zhì)，在低溫（4）和超低溫（）和超低溫（-130-168）下，）下，能與細(xì)胞膜相互作用而保護(hù)細(xì)胞，抑制冰能與細(xì)胞膜相互作用而保護(hù)細(xì)胞，抑制冰晶的生長(zhǎng)，增強(qiáng)生物體抵御寒冷的能力。晶的生長(zhǎng)，增強(qiáng)生物體抵御寒冷的能力。4. 抗凍蛋白（抗凍蛋白（afp）rubinsky等（等（1992）在冷凍液中加入）在冷凍液中加入afp，對(duì)小鼠，對(duì)小鼠2-細(xì)胞階段胚胎進(jìn)行冷凍保存，解凍后囊胚發(fā)育率細(xì)胞階段胚胎進(jìn)行冷凍保存，解凍后囊胚發(fā)育率高達(dá)高達(dá)82.5%。應(yīng)用魚(yú)的應(yīng)用魚(yú)的afp已經(jīng)成功地玻璃化冷凍了牛和羊的胚已經(jīng)成功地玻璃化冷凍了牛和羊的胚胎及豬的卵細(xì)胞。胎及豬的卵細(xì)胞。費(fèi)云標(biāo)等（費(fèi)云標(biāo)等（1995

18、）報(bào)道，使用植物）報(bào)道，使用植物afp可提高豬胚可提高豬胚胎冷凍保存后的成活率。胎冷凍保存后的成活率。4. 抗凍蛋白（抗凍蛋白（afp）v由基礎(chǔ)液和一定量的冷凍保護(hù)劑配制而成。由基礎(chǔ)液和一定量的冷凍保護(hù)劑配制而成。v臺(tái)氏液、杜氏磷酸鹽緩沖液（臺(tái)氏液、杜氏磷酸鹽緩沖液（dpbs）、）、tcm-199、牛卵泡液、牛卵泡液、hepes緩沖液或緩沖液或talp液等。液等。v最常用的是經(jīng)過(guò)改良的最常用的是經(jīng)過(guò)改良的pbs液，即液，即mpbs。使用。使用時(shí)通常還加入一定量的同源或異源動(dòng)物滅活血清時(shí)通常還加入一定量的同源或異源動(dòng)物滅活血清或或bsa。v不同種類和濃度的冷凍保護(hù)劑配制成的冷不同種類和濃度的冷凍

19、保護(hù)劑配制成的冷凍保護(hù)液對(duì)各種動(dòng)物胚胎的保護(hù)效果不同凍保護(hù)液對(duì)各種動(dòng)物胚胎的保護(hù)效果不同。即使是同一保護(hù)液對(duì)同一動(dòng)物不同來(lái)源。即使是同一保護(hù)液對(duì)同一動(dòng)物不同來(lái)源和不同發(fā)育時(shí)期的胚胎保護(hù)效果也有差異和不同發(fā)育時(shí)期的胚胎保護(hù)效果也有差異。p此外，用冷凍保護(hù)液對(duì)胚胎凍前處理的時(shí)間此外，用冷凍保護(hù)液對(duì)胚胎凍前處理的時(shí)間、溫度，平衡的時(shí)間和溫度等對(duì)也影響其效、溫度，平衡的時(shí)間和溫度等對(duì)也影響其效果。果。p冷凍保護(hù)液的配制要求無(wú)菌操作，量取選用冷凍保護(hù)液的配制要求無(wú)菌操作，量取選用的保護(hù)劑和滅活犢牛血清，加入的保護(hù)劑和滅活犢牛血清，加入pbs在容量在容量瓶中定容，混合均勻后，用瓶中定容，混合均勻后，用g6

20、濾器抽濾滅菌濾器抽濾滅菌。分裝到。分裝到2ml的安瓿中，火焰封口，的安瓿中，火焰封口，4冰箱冰箱保存?zhèn)溆?。保存?zhèn)溆谩現(xiàn)有保存方法有現(xiàn)有保存方法有4種種常規(guī)冷凍法；常規(guī)冷凍法；一步冷凍法；一步冷凍法；程序冷凍法程序冷凍法玻璃化冷凍化玻璃化冷凍化 著重講述后兩種著重講述后兩種（三）保護(hù)方法（三）保護(hù)方法 也叫慢速冷凍法、逐步降溫法。也叫慢速冷凍法、逐步降溫法。v基本步驟基本步驟： 1. 將采集到的胚胎用培養(yǎng)液洗滌后置入有不同冷凍保護(hù)劑將采集到的胚胎用培養(yǎng)液洗滌后置入有不同冷凍保護(hù)劑（甘油或二甲亞楓（甘油或二甲亞楓（dmso）等）濃度的三種冷凍液中（）等）濃度的三種冷凍液中（冷凍液濃度由低到高，最

21、終濃度冷凍液濃度由低到高，最終濃度1.4m），每種冷凍液中平），每種冷凍液中平衡衡5分鐘。分鐘。 2. 然后將胚胎和冷凍液裝入細(xì)管中封口、標(biāo)記，放入冷凍然后將胚胎和冷凍液裝入細(xì)管中封口、標(biāo)記，放入冷凍儀中進(jìn)行冷凍。冷凍速率先以儀中進(jìn)行冷凍。冷凍速率先以13c分下降至分下降至-6-7，在此溫度誘發(fā)結(jié)晶，平衡，在此溫度誘發(fā)結(jié)晶，平衡10分鐘。分鐘。3. 以以0.3分的速率降溫至分的速率降溫至-35- 38，之后投入液氮，之后投入液氮中保存。中保存。4. 胚胎解凍后，需按胚胎進(jìn)入冷凍液時(shí)的相反濃度，即從胚胎解凍后，需按胚胎進(jìn)入冷凍液時(shí)的相反濃度，即從高到低濃度脫除冷凍保護(hù)劑，每步高到低濃度脫除冷凍保

22、護(hù)劑，每步5分鐘，最后置入含分鐘，最后置入含20血清的血清的pbs保護(hù)液中洗滌保護(hù)液中洗滌3次，徹底脫除冷凍保護(hù)次，徹底脫除冷凍保護(hù)劑。或者將解凍后的胚胎放入劑?；蛘邔⒔鈨龊蟮呐咛シ湃?.5m(或或1.0m)的蔗糖溶的蔗糖溶液中平衡液中平衡10分鐘，再用上述分鐘，再用上述pbs液洗滌液洗滌3次。次。 也叫一步細(xì)管法。v該方法是由慢速冷凍法改進(jìn)而來(lái)，細(xì)管內(nèi)的冷凍液和蔗糖液是分開(kāi)的，因此，在細(xì)管內(nèi)用蔗糖液可一步脫除甘油抗凍劑，從而利于在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。 也叫慢速冷凍法、逐步降溫法。也叫慢速冷凍法、逐步降溫法。v所用冷凍保護(hù)劑一般為：所用冷凍保護(hù)劑一般為： 二甲亞砜（二甲亞砜（dmsodmso）、氨

23、基酸、丙三醇（甘油）、）、氨基酸、丙三醇（甘油）、1,2-1,2-丙丙二醇等。該法采用較低濃度的冷凍保護(hù)劑，對(duì)胚胎毒性損害二醇等。該法采用較低濃度的冷凍保護(hù)劑，對(duì)胚胎毒性損害小，解凍后存活率較高。但因其操作繁瑣，降溫速度慢，致小，解凍后存活率較高。但因其操作繁瑣，降溫速度慢，致使所需時(shí)間長(zhǎng)，需要特殊的降溫裝置，在不具備實(shí)驗(yàn)條件的使所需時(shí)間長(zhǎng)，需要特殊的降溫裝置，在不具備實(shí)驗(yàn)條件的場(chǎng)所不能使用此法進(jìn)行胚胎冷凍。場(chǎng)所不能使用此法進(jìn)行胚胎冷凍。p影響因素影響因素包括：抗凍保護(hù)劑的選擇與濃度、植冰和降溫速度包括：抗凍保護(hù)劑的選擇與濃度、植冰和降溫速度、解凍方法、抗凍的脫出等。、解凍方法、抗凍的脫出等。

24、v將采集到的胚胎在含將采集到的胚胎在含20%小牛血清的小牛血清的pbs溶液中洗滌溶液中洗滌2次次v講洗滌過(guò)的胚胎在室溫條件下加入含講洗滌過(guò)的胚胎在室溫條件下加入含1.4mol|l甘油和甘油和20%小小牛血清的牛血清的pbs的冷凍中平衡的冷凍中平衡20minv將胚胎和冷凍液裝入將胚胎和冷凍液裝入0.25ml胚胎冷凍細(xì)管中，封口，并在細(xì)胚胎冷凍細(xì)管中，封口，并在細(xì)管外標(biāo)記供體號(hào)、胚胎數(shù)量、等級(jí)、冷凍日期等管外標(biāo)記供體號(hào)、胚胎數(shù)量、等級(jí)、冷凍日期等v將裝入胚胎的習(xí)慣放入冷凍儀中，在將裝入胚胎的習(xí)慣放入冷凍儀中，在0平衡平衡10min，以，以1|min的速度降至的速度降至-7-6，并在此溫度下誘發(fā)潔凈

25、，平衡，并在此溫度下誘發(fā)潔凈，平衡10min，然后，然后0.3的速度降溫至的速度降溫至-38-35，投入液氮保存。，投入液氮保存?；静襟E：基本步驟：v解凍時(shí)從冷凍液中取出裝胚胎的細(xì)管，在空氣中平解凍時(shí)從冷凍液中取出裝胚胎的細(xì)管，在空氣中平衡衡10s10s，立即至于，立即至于3737水浴解凍，水浴解凍，1min1min后取出完成解后取出完成解凍過(guò)程。凍過(guò)程。v將細(xì)管中的冷凍液及胚胎推出，在現(xiàn)實(shí)鏡下找到胚將細(xì)管中的冷凍液及胚胎推出，在現(xiàn)實(shí)鏡下找到胚胎并移入解凍液。采用三步法脫除甘油，每步胎并移入解凍液。采用三步法脫除甘油，每步5-5-7min7min。最后用。最后用pbspbs液將胚胎洗液將胚胎洗3-53-5遍，供移植備用。遍，供移植備用?；静襟E：基本步驟：p將胚胎在適當(dāng)?shù)睦鋬霰Ｗo(hù)劑混合液中作短暫處理后將