X連鎖無丙種球蛋白血癥XLAPPT參考課件

1、授課：xxx12021/3/10x-linked agammaglobulinemia btk gene defect授課：xxx22021/3/10brief introduction of xla：x連鎖無兵種球蛋白血癥（x-lingked agammaglobulinemia , xla），又稱bruton無丙種球蛋白血癥，是最早發(fā)現(xiàn)的人類原發(fā)型免疫缺陷?。╬omary immunodeficiency disease ,pid）之一，臨床上以反復(fù)細(xì)菌感染為特征，血清中各類免疫球蛋白明顯降低或缺乏，對抗原刺激不能產(chǎn)生抗體應(yīng)答，血循環(huán)中b 淋巴細(xì)胞減少，淋巴結(jié)及淋巴組織缺乏生發(fā)中心和淋巴濾

2、泡，骨髓中無漿細(xì)胞，但前b 淋巴細(xì)胞數(shù)量正常，t淋巴細(xì)胞數(shù)量及功能正常。授課：xxx32021/3/10btk genexlamutate發(fā)病原因：發(fā)病原因：btk屬于非受體酪氨酸蛋白激酶，該類激酶泛參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)，影響細(xì)胞的存活、增殖和分化，btk是b細(xì)胞發(fā)育成熟的關(guān)鍵因素、 正常人除t細(xì)胞和漿細(xì)胞外均有btk表達(dá)，而btk基因突變只影響b細(xì)胞的數(shù)量，這說明btk存b細(xì)胞的生長發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用。授課：xxx42021/3/10the struction of btk protein：（begin from n terminal）the number of amino acidt

3、he location of each exonbtk包含5個結(jié)構(gòu)域：ph結(jié)構(gòu)域(pleckstrin homology domain)、th結(jié)構(gòu)域(tec homology domain)、sh3結(jié)構(gòu)域(src homology3 domain)、sh2結(jié)構(gòu)域(src homology2 domain)和催化結(jié)構(gòu)域(tyrosine kinase domain)這些結(jié)構(gòu)域可以識別并結(jié)合多種信號分子，為btk參與多種信號通路奠定基礎(chǔ)ph結(jié)構(gòu)域通過識別并結(jié)合膜磷脂的代謝產(chǎn)物磷脂肌醇三磷酸將btk募集到細(xì)胞膜上，參與胞外刺激引發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)7th結(jié)構(gòu)域由btk motif和富含脯氨酸區(qū)域兩部分組成，

4、sh3結(jié)構(gòu)域可特異識別th結(jié)構(gòu)域的富含脯氨酸區(qū)域，因此可以發(fā)生分子內(nèi)部的折疊此外，sh3結(jié)構(gòu)域還可與syk/zap70等分子發(fā)生相互作用，這對下游的pkc激活有重要作用。授課：xxx52021/3/10btk 突變的分子機(jī)制突變的分子機(jī)制：btk是許多受體的信號傳遞所必需的，如b細(xì)胞抗原受體(bcr)、cd38、白介素一5受體(il5r)和il10r，并作為il6和fcari信號傳遞途徑的組成部分。而bcr對維持成熟b細(xì)胞的數(shù)量和對抗原的反應(yīng)能力是必不可少的。當(dāng)bcr被交聯(lián)(crosslinking)后，btk可以被激活。目前已知，在btk的信號傳導(dǎo)途徑中，涉及其上游的btk激活分子和下游的b

5、tk效應(yīng)分子兩部分:作用于btk的上游激活分子包括：(1)src家族激酶。研究表明，當(dāng)bcr交聯(lián)后，最早發(fā)生的事件是激活src家族激酶，后者可使btk激酶區(qū)中的y551酪氨酸殘基位點磷酸化，導(dǎo)致btk激酶活性增高和sh3區(qū)的y223酪氨酸殘基位點自身磷酸化，進(jìn)一步對下游效應(yīng)蛋白產(chǎn)生作用。(2)作用于btk ph區(qū)的協(xié)同激活分子。通過失功能或獲得功能性突變已證明，btk中的ph區(qū)是調(diào)節(jié)btk活性的關(guān)鍵區(qū)域。結(jié)合在btk ph區(qū)的多種蛋白和脂質(zhì)配體包括異三聚體g蛋白的亞單位,這些分子與btkph區(qū)相互作用的結(jié)果，可促進(jìn)btl(的細(xì)胞膜定位，使src家族激酶激活btk。此外，由于許多ph區(qū)的配體涉及

6、g蛋白偶聯(lián)受體(gpcr)信號，提示btl(可作為gpcr信號途徑的一個成分，與bcr協(xié)同或獨立于b隙信號途徑發(fā)揮作用。授課：xxx62021/3/10 btk被上游激活分子激活后，可通過激活多個下游效應(yīng)分子，發(fā)揮復(fù)雜的生物效應(yīng)，包括： (1)磷脂酶c(plc)7激活、bcr介導(dǎo)的ca2+內(nèi)流和ip3釋放。許多實驗系統(tǒng)已經(jīng)證實了btk具有介導(dǎo)bcr誘導(dǎo)的ca2+內(nèi)流作用。bcr交聯(lián)后可激活btk，后者可激活plcy。激活后的plcy可引起ip，釋放和隨后的ca2+內(nèi)流。 (2)絲裂原激活蛋白(map)激酶通路的激活。btk可激活c-jun蛋白n端激酶(jnk)和p38。實驗研究表明，在bcr缺

7、陷的雞紅細(xì)胞或xid及btk缺陷的鼠中，p38和卟k的活性下降。在btk的信號通路中，p38和jnk的作用可能是參與調(diào)節(jié)bcr信號的閾值。 (3)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和凋亡。調(diào)節(jié)細(xì)胞生存和細(xì)胞周期的基因?qū)儆赽tk信號通路的下游成分。在xid鼠的b細(xì)胞中，bcr交聯(lián)后對抗凋亡基因bclxl的誘導(dǎo)受損。此外，參與btk信號通路的相關(guān)細(xì)胞周期蛋白包括odk2，odk4，cyclins d2和a等。 (4)btk底物及未知功能的結(jié)合伴侶分子。仍有大量的蛋白分子可以在體外與btk的某些亞區(qū)結(jié)合，或與btk免疫共沉淀，或依賴于btk磷酸化。它們可能是btk的調(diào)節(jié)分子或效應(yīng)分子，但對其功能目前尚缺少直接的實驗數(shù)據(jù)b

8、tk 突變的分子機(jī)制突變的分子機(jī)制：授課：xxx72021/3/10btk基因拼接點突變致基因拼接點突變致xla的基因診斷：的基因診斷：流式細(xì)胞儀檢測單核細(xì)胞btk表達(dá)：采集患者及其家庭成員肝素抗凝的外周血，密度梯度離心分離外周血單個核細(xì)胞(pbmc)。使用抗btk單克隆抗體標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)btk。流式細(xì)胞儀分析pbmc上的btk表達(dá)。 基因組dna 和cdna 的制備及其pcr擴(kuò)增： 每人抽取外周血5 ml(肝素抗凝)，按本實驗室常規(guī)方法提取基因組dna和rna，逆轉(zhuǎn)錄合成edna。根據(jù)基因庫(genbank)中btk 基因組dna(序列號u78027)及mrna(序列號x58957)的基因序列，

9、自行設(shè)計了18對包括btk基因19個外顯子編碼區(qū)和側(cè)翼拼接點基因組dna 的pcr引物，3對包括btk mrna全長的edna引物，進(jìn)行21次pcr反應(yīng)，每次反應(yīng)用0.1/lg基因組dna或edna作為模板。對擴(kuò)增出的cdna 片段(命名為f、m、b)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，比較其各片段的大小。dna的pcr擴(kuò)增和序列分析采用pcr直接測序法，用正義、反義兩對引物進(jìn)行雙向測序。上述pcr反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀純化后，分別以上述引物和含內(nèi)含子側(cè)翼的內(nèi)引物，總共21對止義和反義測序引物，用測序試劑盒(peapplied biosystems)直接進(jìn)行雙向測序。所用pcr和測序引物。用abi prism

10、 377全自動測序儀(測序。授課：xxx82021/3/10btk基因拼接點突變致基因拼接點突變致xla的基因診斷的基因診斷結(jié)論結(jié)論：單核細(xì)胞上btk蛋白的表達(dá)：流式細(xì)胞儀測得患兒單核細(xì)胞上的btk蛋白表達(dá)為0，同齡對照、母親和父親分別為7242 、3067 、5868 。btk cdna 片段電泳結(jié)果：電泳結(jié)果顯示患兒btkcdna m 片段的長度較其父母的長約81個堿基?；純焊赣H、患兒母親、患兒的btk cdna f、m、b電泳分析授課：xxx92021/3/10btk基因拼接點突變致基因拼接點突變致xla的基因診斷的基因診斷結(jié)論結(jié)論：btk基因測序結(jié)果：患兒btk基因全基因分析，發(fā)現(xiàn)內(nèi)含

11、子142位點堿基替換突變a g(ivs142，a g)。外祖母、母親btk基因內(nèi)含子142位點堿基替換ag雜合突變，為攜帶者。父親btk基因正常。btk mrna基因分析基因，發(fā)現(xiàn)患兒外顯子14與15之間拼接異常，分析到異常變大(多81個堿基)的mrna。母親、外祖母、父親外顯子14與15之間分析到正常大小turna。這些測序結(jié)果與國際遺傳免疫缺陷病數(shù)據(jù)庫報道的btk基因突變類型比較證實為新型的btk基因突變。a：患兒btk基因15外顯子反向測序結(jié)果：內(nèi)含子142位點堿基 替換突變ag(ivsi42，ag）；b：正常(父親lbtk基因15外顯子反向測序結(jié)果；c、d：分別為患兒母親和外祖母的bt

12、k基因15外顯子反向測序結(jié)果btk基因內(nèi)含子142位點鹼基替換ag雜合突變。為攜帶者；e：患兒btk cdna反向測序結(jié)果比正常btk cdna長81個堿基；f、g：分別為患兒父母btk cdna反向測序結(jié)果為正常的btk cdna授課：xxx102021/3/10xla的診斷的診斷在年長兒或成人中，低水平的lgg(2l)和低水平或無iga、igm是xla的典型表現(xiàn)”。xla患者血循環(huán)中缺乏成熟b細(xì)胞，可通過流式細(xì)胞攸測定免疫熒光標(biāo)記的cdl9和(或)cd20b細(xì)胞表達(dá)抗原此法對6十月前嬰兒診斷尤為重要。預(yù)防接種后抗體的檢測：接種滅活疫苗后無或產(chǎn)生較弱的抗體；或注入新抗原，噬菌體, xl74，

13、可發(fā)現(xiàn)由于無抗體產(chǎn)生或抗體合成受抑而導(dǎo)致的抗原清除延遲。btk基因的突變分析是xla的確診實驗授課：xxx112021/3/10有關(guān)有關(guān)xla產(chǎn)前檢查產(chǎn)前檢查n因為正常人血循環(huán)中的b細(xì)胞有兩種，1種是來自母親有活性的x染色體，另1種是來自父親的有活性的x染色體；而攜帶者僅有1種來自父親的有活性的x染色體來源母親的x染色體是失活的x染色體失活型可以通過其甲基化型來檢測，即通過連接xla突變位點臨近區(qū)多態(tài)性或研究雜合子選樣性保留的有活性染色體來發(fā)現(xiàn)攜帶者。n通過檢測突變基因來發(fā)現(xiàn)攜帶者。用連鎖分析的方法(如碰用dxsl78 作為分子探針)來直接分析。n產(chǎn)前分析包括連鎖分析和羊水細(xì)胞和(或)臍血b淋

14、巴細(xì)胞計數(shù)的方法。應(yīng)用基阻序列分析發(fā)現(xiàn)攜帶者亦可為產(chǎn)前診斷提供重要信息授課：xxx122021/3/10 免疫球蛋白替代療法（治標(biāo)） ivig; imig; allobmt（治本）治療治療:授課：xxx132021/3/10ivig治療xla,其起始量一般為400600m/kg，然后根據(jù)患兒對治療的反應(yīng)束調(diào)整用藥劑量及給藥間隔和頻率必領(lǐng)個體化，使免疫球蛋白維持在正常的上限水平；一研究機(jī)構(gòu)比較了不同劑量的ivig與肌肉注射免疫球蛋白(imig)的療效差別，結(jié)果顯示每3周接受大劑量ivig(400mg/kg)并保持血清igg正?；蚪咏Ｖ档拖?4g/l)組的患兒住院率、感染率較每3劇接受低劑量i

15、vig(200mg/kg)或imig明顯減少。早期開始大劑量ivig治療的患兒其肺炎、化膿性腦膜炎及胃腸道感染的發(fā)生率明顯降低?；谶@些原困許多研究中心在嬰兒期(生后后6個月)就開始ivig治療。免疫球蛋白替代療法免疫球蛋白替代療法（治標(biāo)）（治標(biāo)）授課：xxx142021/3/10免疫球蛋白替代療法免疫球蛋白替代療法缺陷：缺陷：盡管免疫球蛋白冶療是xla的重大進(jìn)展，但它只能替代igg而不能建立主動免疫；雖然ivig可明顯降低患兒感染的頻率和嚴(yán)重程度，卻不能杜絕感染。授課：xxx152021/3/10 allo-bmt（治本） 若不采用替代治療，約有半數(shù)患者在10歲前死亡；采用丙種球蛋白替代治療

16、，費用昂貴且須替代終生。但是通過異基因骨髓移植（allo-bmt）治療免疫缺陷性疾病，可重建正常的免疫系統(tǒng)，目前為止是根治此病的唯一方法。授課：xxx162021/3/10 allo-bmt（治本）的討論及預(yù)后（治本）的討論及預(yù)后通過allo-bmt治療免疫缺陷性疾病，可重建正常的免疫系統(tǒng)?？梢詮浹a(bǔ)丙種球蛋白替代治療的缺陷：治療費用昂貴，且長期應(yīng)用，患者的依從性差。后重建體液免疫多年健康存活，不再需要替代治療，生活質(zhì)量得到明顯提高，因此allo-bmt治療是有意義的。預(yù)處理有的使用tbi方案，確保bu有效血藥濃度，會出現(xiàn)難以接受的不良反應(yīng)。但多數(shù)是采用改良的bucy方案，用bu1620mg/kgcy20