專接本生物工程導(dǎo)論考試題目

1、（一）36.限制性內(nèi)切酶識別和切割dsdna分子內(nèi)特殊核苷酸順序的酶統(tǒng)稱為限制性內(nèi)切酶，簡稱限制酶37.代謝工程利用基因重組技術(shù)強(qiáng)化細(xì)胞中某一代謝途徑或賦予細(xì)胞新的代謝能力是代謝工程的主要研究內(nèi)容38.愈傷組織植物體受到切割等傷害后會產(chǎn)生愈傷組織，愈傷組織的形成實際上是一種創(chuàng)傷反應(yīng)，使植物脫分化的結(jié)果，產(chǎn)生愈傷組織的植物器官可以是種子，根，莖葉等。39.神經(jīng)干細(xì)胞 神經(jīng)干細(xì)胞位于成體神經(jīng)組織中，具有再生神經(jīng)元。星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突狀細(xì)胞的潛在能力40.基因組重排育種基因組重排技術(shù)可以用來改造細(xì)菌的基因組，實現(xiàn)表型的改良。重排技術(shù)具有多親本雜交的優(yōu)勢。對細(xì)菌群體進(jìn)行重復(fù)的基因組重排可以有

2、效構(gòu)建新菌株的組合文庫。如果將它應(yīng)用到帶表型篩選的細(xì)菌群體中，就會產(chǎn)生很多表型有顯著改良的新菌株酵母菌的生長特性酵母菌是一類最簡單的真核微生物。細(xì)胞中有結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞核。絕大多數(shù)酵母菌是單細(xì)胞，但體積比細(xì)菌要大得多，一般呈球形，卵形或檸檬型。出芽生殖是酵母菌最常見的生殖方式。有些酵母細(xì)胞也能以與細(xì)菌類似的裂殖方式來產(chǎn)生后代。這兩種生殖方式都是無性繁殖。很多酵母菌還能通過產(chǎn)生子囊孢子的形式進(jìn)行有性繁殖。若出芽形成的字細(xì)胞未能與母細(xì)胞分開，又長了新芽，形成成串的細(xì)胞，看起來像絲狀，稱為假菌絲，這類酵母稱為假絲酵母。酵母菌在自然界中分布很廣，尤其喜歡偏酸性且含糖較多的環(huán)境。我們每天吃的面包饅頭，喝的

3、啤酒葡萄酒等各類酒類飲料，是酵母菌參與制造的，酵母菌還可以用于生產(chǎn)微生物，甘油，酶制劑，菌體蛋白?；蚪M文庫的篩選方法構(gòu)建基因文庫后，就要鑒定出文庫中帶有目的基因序列的克隆。有三種通用的鑒定方法：1是用標(biāo)記的dna探針進(jìn)行dna雜交。2是用抗體對蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫雜交。3是對蛋白質(zhì)的活性進(jìn)行鑒定1）dna雜交法：熱處理或減變性后的雙鏈dna分子會變成單鏈dna分子。加熱后若緩慢降低溫度，那么dna雙鏈結(jié)構(gòu)就會在堿基配對作用下重新恢復(fù)（復(fù)性）退火后的dna分子探針和目的序列之間的堿基應(yīng)能形成穩(wěn)定的堿基配對2）免疫反應(yīng)法：若一目的基因dna序列可以轉(zhuǎn)錄或翻譯成蛋白質(zhì)，那么只要出現(xiàn)這種蛋白質(zhì)，甚至只需要

4、該蛋白質(zhì)的一部分，就可以用免疫的方法檢測3）酶活性法，若目的基因編碼一種酶，而這種酶又是宿主細(xì)胞所不能編碼的，那么就可以通過檢查酶活性來篩選目的基因的重組子微生物工程的發(fā)展史人類利用微生物的歷史非常悠久。我們的先人很早就知道一些采摘的野果存放一段時間后會有酒味。大約在9000年前就已經(jīng)開始了原始的啤酒生產(chǎn) 。公元前2400年左右，埃及第五王朝的墓葬壁畫上，就有烤制面包和釀酒的大幅浮雕。我國利用微生物釀酒起源于公元前2200-2600年，已經(jīng)有4000多年的歷史。早期的發(fā)酵源自對于自然發(fā)酵的模擬。17世紀(jì)下半葉，隨著顯微鏡的發(fā)明，人們才逐漸認(rèn)識到微生物的存在。19世紀(jì)中葉，法國著名生物學(xué)家巴斯德

5、證明酒精發(fā)酵是活的酵母引起。其他發(fā)酵過程也是各種微生物作用的結(jié)果。隨著人們對發(fā)酵過程原理的認(rèn)識逐步加深，以及純種培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)明，從19世紀(jì)末-20世紀(jì)30年代，相繼出現(xiàn)了乳酸，丙酮/丁醇，甘油等工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)品。特別是丙酮-丁醇發(fā)酵和甘油發(fā)酵的出現(xiàn)，標(biāo)志著人類開始有目的的利用人工篩選的微生物生產(chǎn)新的工業(yè)產(chǎn)品。20世紀(jì)40年代的抗生素革命，它標(biāo)志發(fā)酵工程作為一門獨立的工程學(xué)科誕生，具有劃時代的意義。近30年來，隨著人類在基因水平上改造微生物的技術(shù)-基因工程，代謝工程，組合生物合成等技術(shù)的突飛猛進(jìn)，發(fā)酵工業(yè)的應(yīng)用領(lǐng)域迅速擴(kuò)展，研究內(nèi)容也日益豐富。酶的活力酶是催化劑，酶的活力是指酶催化特定底物轉(zhuǎn)

6、化成產(chǎn)物的速率。一般而言，酶活力是在規(guī)定的環(huán)境條件，化學(xué)因素和生物因素下，根據(jù)酶所催化反應(yīng)的初速度而測定的。酶活力的單位一般是：單位時間，單位質(zhì)量酶蛋白所催化的底物反應(yīng)或產(chǎn)物生成的物質(zhì)的量（或質(zhì)量）。胚胎干細(xì)胞干細(xì)胞的研究最早是從胚胎干細(xì)胞開始的。3-5天的胎兒（或囊胚中），有幾十個內(nèi)層細(xì)胞是非常特殊的細(xì)胞，經(jīng)過6個月的增殖，這幾十個內(nèi)層細(xì)胞能分化出千萬個不同的細(xì)胞。這些內(nèi)層細(xì)胞就是胚胎干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞具有形成所有組織和器官的能力，具有全能性。造血干細(xì)胞 造血干細(xì)胞分布于骨髓，外周血和臍血中。尤其臍血中含有豐富的造血千細(xì)胞，造血干細(xì)胞是造血細(xì)胞的“種子”，體內(nèi)所有血細(xì)胞，包括紅細(xì)胞

7、白細(xì)胞血小板等部由它分化發(fā)育而來，它是人們認(rèn)識最早的干細(xì)胞之一。在間歇發(fā)酵過程中如何結(jié)合微生物的生長特征實現(xiàn)發(fā)酵過程中的優(yōu)化操作。在間歇培養(yǎng)中，當(dāng)微生物種子罐接種到發(fā)酵罐后，為了適應(yīng)新的環(huán)境需要一段緩沖期稱為遲滯期。為接下來的快速生長做好必要的準(zhǔn)備工作，適應(yīng)了新的環(huán)境后，微生物數(shù)量開始成倍增長，這個時期稱為指數(shù)生長期。在間歇培養(yǎng)過程中，當(dāng)微生物對數(shù)生長期維持一段時間后，由于某些養(yǎng)分消耗殆盡，微生物生長代謝過程中產(chǎn)生了抑制微生物生長的代謝產(chǎn)物，以及因為微生物密度已經(jīng)很高造成氧供應(yīng)不足等原因，微生物生長速度開始減慢，而同時有一部分微生物逐漸死亡。此時為了延長細(xì)胞處于穩(wěn)定期的時間，極大可能的增加某些

8、代謝產(chǎn)物的生成，有必要對發(fā)酵罐內(nèi)為環(huán)境進(jìn)行調(diào)整，比如補加酸堿以維持恒定的ph環(huán)境，補加c,n以滿足微生物生長代謝的營養(yǎng)需要，這都要求對發(fā)酵過程的參數(shù)進(jìn)行實時控制和優(yōu)化。過程控制是保證發(fā)酵過程穩(wěn)定，降低成本，提高效益的主要手段之一。過程控制的兩個基本要素如下：1過程參數(shù)的測量與操作變量的調(diào)節(jié)。準(zhǔn)確的參數(shù)測量是了解和掌握過程當(dāng)前狀態(tài)的基礎(chǔ)，操作變量的調(diào)節(jié)技術(shù)是實現(xiàn)控制的基本手段，這些都構(gòu)成過程控制的硬件2過程的模型化與控制策略。通過模型可以將不同的過程參數(shù)動態(tài)的關(guān)聯(lián)起來，了解這些參數(shù)反映的過程變化情況。根據(jù)控制目標(biāo)和實際狀況的差別，可以采用合適的策略調(diào)節(jié)某些可以控制的參數(shù)。過程參數(shù)的測量是了解發(fā)酵

9、過程的窗口?？蓽y量的參數(shù)可分為環(huán)境參數(shù)和操作變量兩大類。在環(huán)境參數(shù)方面，ph值，溫度，溶氧值，出口co2濃度的在線測量技術(shù)已經(jīng)成熟。菌體濃度和部分底物或產(chǎn)物的在線測量技術(shù)也已經(jīng)基本成熟。操作變量方面，攪拌轉(zhuǎn)速，通氣量，冷卻水流量，罐壓，酸堿泵流速，流加速率等的測定和控制也已經(jīng)不存在技術(shù)問題。只要知道了間歇培養(yǎng)時細(xì)胞生長的動力學(xué)模型和細(xì)胞生長和次級代謝生成兩者之間的關(guān)系，就可以通過參數(shù)優(yōu)化控制的方式進(jìn)行發(fā)酵過程的優(yōu)化操作如何實現(xiàn)基因工程菌的高效表達(dá)要實現(xiàn)基因工程菌的高效表達(dá)，第一要選擇適宜的啟動子。真核細(xì)胞的啟動子不能被大腸桿菌rna聚合酶識別，因此必須將外源基因置于大腸桿菌啟動子控制下。翻譯水

10、平影響外源基因表達(dá)的重要因素是翻譯起始區(qū)。二目的基因的不溶性高效表達(dá)。采用目的蛋白與帶純化標(biāo)記的細(xì)菌蛋白融合的新策略，所得到的融合蛋白不僅能夠抵抗蛋白酶的進(jìn)攻，而且可以利用純化標(biāo)簽的蛋白與相應(yīng)的抗體之間的親和反應(yīng)，實現(xiàn)目的蛋白的高效親和分離。三目的基因的高效可溶性表達(dá)。若目的蛋白能夠抵抗蛋白酶的進(jìn)攻或采用蛋白酶缺失的宿主菌，目的基因有可能在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行高水平的可溶性表達(dá)。四目的基因的高效分泌型表達(dá)。當(dāng)采用大腸桿菌作為表達(dá)系統(tǒng)時，如果在質(zhì)粒設(shè)計時加上一段信號肽基因，就有可能實現(xiàn)目的蛋白質(zhì)的分泌型表達(dá)。五基因工程宿主菌的改造。通過代謝工程的方法改變宿主菌的代謝途徑以提高目的產(chǎn)物的合成六利用細(xì)胞培養(yǎng)工

11、程手段提高基因表達(dá)水平。1提高工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性。2。實現(xiàn)重組菌的高密度培養(yǎng)。3 減少乙酸等抑制性副產(chǎn)物的形成。4。提高目的蛋白表達(dá)的質(zhì)量（二）逆轉(zhuǎn)錄酶是從mrna逆轉(zhuǎn)錄形成互補dna（cdna）的酶，或稱為依賴于rna的dna聚合酶。分子印跡技術(shù)是指制備對某一特定分子具有選擇性的聚合物的過程，該特定分子通常稱為印跡分子或模版。分子印跡技術(shù)借助模板在高分子物質(zhì)上形成特異的識別位點和催化位點。誘變育種的基本原理是利用一些物理或化學(xué)的因素處理微生物細(xì)胞，使其遺傳性狀發(fā)生隨機(jī)的突變，得到大量形狀各異的突變株，然后再從眾多突變株中以一定的方法篩選出生產(chǎn)性能改善的個體。用于處理微生物以使其發(fā)生突變的物理

12、或化學(xué)因素稱為誘變劑。 組織工程的研究幾乎遍及肌體的所有組織和器官。組織工程安組織器官的構(gòu)筑方式可以分為兩個部分：組織再生工程和組織替代工程。組織再生工程采用自體細(xì)胞，借助人工細(xì)胞外基質(zhì)，在各種生長因子的促進(jìn)下使細(xì)胞分裂，增殖，分化，以構(gòu)建患者自己的組織。植物細(xì)胞具有全能性，即單一的離體細(xì)胞在一定環(huán)境下能分化成不同的細(xì)胞組織乃至整個植株。胚胎干細(xì)胞也具有全能性，它具有形成所有組織器官的能力。非水系統(tǒng)的酶催化特點與傳統(tǒng)的水溶液中酶催化反應(yīng)相比，非水系統(tǒng)的酶催化有以下的一些特點：1絕大多數(shù)有機(jī)化合物在非水系統(tǒng)中的溶解度高于水溶液2。根據(jù)熱力學(xué)原理，一些在水中不可能進(jìn)行的反應(yīng)，有可能在非水

13、系統(tǒng)中進(jìn)行3。與水相比，酶在非水系統(tǒng)中的穩(wěn)定性比較高4。從非水系統(tǒng)中回收反應(yīng)產(chǎn)物比水相中容易。5在非水系統(tǒng)中酶很容易回收和反復(fù)使用。酶的修飾方法酶的結(jié)構(gòu)決定了酶的性質(zhì)和功能，只要酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的變化，就能使酶的特性和功能隨之改變。在研究酶的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，在分子水平上對酶進(jìn)行化學(xué)修飾的方法有：金屬離子置換修飾，大分子結(jié)合修飾，肽鏈有限水解修飾，酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾，氨基酸置換修飾以及物理修飾等。金屬離子置換修飾是通過改變酶分子所含的金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變。大分子結(jié)合修飾利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變。蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)修飾可以改變蛋白質(zhì)表面電荷和

14、疏水性，從而影響其催化活性和穩(wěn)定性。酶蛋白中個別氨基酸的置換可以采用點突變的方法很容易就可以完成。點突變是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的重要工具。 動物細(xì)胞培養(yǎng) 動物細(xì)胞培養(yǎng)分貼壁與懸浮培養(yǎng)兩種。只有在固體基質(zhì)上付著才能增長或存活的細(xì)胞稱為貼壁依賴型細(xì)胞，而可在懸浮狀態(tài)下生長的細(xì)胞為非貼壁型細(xì)胞。而動物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)方式有間歇培養(yǎng)，補料-分批培養(yǎng)和灌流培養(yǎng)等從基因表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建和目的基因表達(dá)過程兩個方面分析，目的基因的表達(dá)效率不僅取決于宿主菌的特性和表達(dá)載體的構(gòu)建，還取決于重組菌的培養(yǎng)工程。從表達(dá)系統(tǒng)來看，主要表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個水平上。影響活性淤泥活性的主要因素影響活性淤泥活性

15、的主要因素包括:溶解氧，營養(yǎng)物，ph值和溫度1溶解氧。氧是好氧微生物生存和代謝的必要條件，供氧不足會妨礙微生物代謝過程，造成絲狀菌等耐低溶解氧的微生物滋長，是污泥不易沉淀，這種現(xiàn)象稱為污泥膨脹。2營養(yǎng)物。微生物生長繁殖需要一定的營養(yǎng)物。碳元素的需要量以bod5負(fù)荷率表示，它直接影響到淤泥增長，有機(jī)物降解速率，需氧量和沉淀性能。3ph和溫度，為維持活性淤泥法處理設(shè)施正常運轉(zhuǎn)，混合液的ph值應(yīng)控制在6。5-9。0范圍內(nèi)，溫度是20-30c為宜。純種培養(yǎng)的意義微生物細(xì)胞從環(huán)境中吸收營養(yǎng)物后，通過細(xì)胞的新陳代謝作用合成新的細(xì)胞成分，并向環(huán)境釋放代謝產(chǎn)物，某些細(xì)胞組分和代謝產(chǎn)物就成了我們需要的目標(biāo)產(chǎn)物。

16、不同微生物的代謝產(chǎn)物不同，而混菌培養(yǎng)時由于爭奪養(yǎng)分，或者受不同微生物代謝產(chǎn)物的抑制或殺害作用。會造成一次工業(yè)生產(chǎn)過程，投入和目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)出不能符合工業(yè)經(jīng)濟(jì)預(yù)期值的問題，甚至在某些情況下，由于生長繁殖能力的差異，會造成目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生菌在生長過程中完全處于抑制狀態(tài)，而非目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生菌大量繁殖，這會造成極大的工業(yè)損失。所有這一切都要求我們在發(fā)酵過程中完成純種培養(yǎng)。干細(xì)胞是一類極特殊的來自胚胎或成體的未分化細(xì)胞,同時具有不斷增長繁殖的功能以及向多種功能細(xì)胞分化的潛能.正是這種雙重功能,干細(xì)胞具有可用于組織器官生產(chǎn)或新藥篩選的巨大潛能.機(jī)體的各種細(xì)胞,組織和器官,甚至完整的生物都是通過干細(xì)胞分化發(fā)育而成的

17、.干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞和組織干細(xì)胞.胚胎干細(xì)胞干細(xì)胞研究最早是從胚胎干細(xì)胞開始.3-5天的胎兒（或囊胚中），有幾十個內(nèi)層細(xì)胞是非常特殊的細(xì)胞，經(jīng)過6個月的增殖，這幾十個內(nèi)層細(xì)胞能分化出千萬個不同的細(xì)胞。這些內(nèi)層細(xì)胞就是胚胎干細(xì)胞，具有形成所有組織和器官的能力，具有全能性。多能干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞逐漸定向分化，朝著特定的組織器官發(fā)展，失去全能性而變得比較專一，他們能繼續(xù)發(fā)育成器官組織，它們只能發(fā)育分化成一個系統(tǒng)中的幾種細(xì)胞，但不能生成其它系統(tǒng)的細(xì)胞，因此這些干細(xì)胞稱為“多能干細(xì)胞”。專能干細(xì)胞多能干細(xì)胞繼續(xù)分化發(fā)育,將生成更加專門化的細(xì)胞,即他們只能再增殖分化為一種類型的終端細(xì)胞,如紅細(xì)胞,肌細(xì)胞,

18、神經(jīng)細(xì)胞等.多能及專能干細(xì)胞統(tǒng)稱為組織干細(xì)胞,如造血干細(xì)胞,皮膚干細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞干細(xì)胞的研究進(jìn)展主要集中在胚胎干細(xì)胞,造血干細(xì)胞,神經(jīng)干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞.胚胎干細(xì)胞不能發(fā)育成單獨的生物體,但可以發(fā)育成多個組織器官的多能性細(xì)胞。（三）36原代細(xì)胞原代細(xì)胞是直接從組織器官中分離得到的，原代細(xì)胞培養(yǎng)一般由組織器官解剖分離解聚和離體細(xì)胞培養(yǎng)三個步驟組成。37. 核酸酶20世紀(jì)80年代初cech和altman各自獨立的發(fā)現(xiàn)了rna具有生物催化功能，人們發(fā)現(xiàn)除蛋白質(zhì)具有酶的催化功能外，某些rna 和dna分子也具有催化功能，這種具有催化功能的核酸就是核酸酶38. dna的復(fù)制dna攜帶著生物細(xì)胞的全部

19、遺傳信息，作為遺傳物質(zhì)，dna分子必須能夠準(zhǔn)確地自我復(fù)制一個dna分子可以通過半保留復(fù)制機(jī)制精確的復(fù)制完成兩個完全相同的dna分子，并分配到兩個子細(xì)胞中，從而將親代細(xì)胞所含的遺傳信息原原本本的傳導(dǎo)子代細(xì)胞39. 細(xì)菌細(xì)菌是單細(xì)胞原核生物，各體極小，沒有成型的細(xì)胞核，一般以典型的“一分為二“的裂殖方式繁殖。40. dna重排dna重排的基本原理是首先將同源基因（單一基因或基因家族）切成隨機(jī)dna片斷，然后進(jìn)行pcr重聚。那些帶有同源性但核苷酸序列有差異的隨機(jī)dna片段，在每一輪pcr循環(huán)中互為引物和模板，經(jīng)多次pcr循環(huán)后能迅速產(chǎn)生大量的重組dna，創(chuàng)造出新基因發(fā)酵過程操作方式根據(jù)發(fā)酵過程操作方

20、式的不同，可以將工業(yè)發(fā)酵分為三種模式：間歇發(fā)酵，連續(xù)發(fā)酵和流加發(fā)酵。間歇發(fā)酵階段，將發(fā)酵罐和培養(yǎng)基滅菌后，向發(fā)酵罐中接入種子，開始發(fā)酵過程。在發(fā)酵過程中，除氣體進(jìn)出外，一般不與外界發(fā)生其他物質(zhì)交換，在某些情況下，根據(jù)發(fā)酵體系的要求，須對發(fā)酵過程的ph值進(jìn)行控制。發(fā)酵結(jié)束后，整批放罐。連續(xù)發(fā)酵是在發(fā)酵過程中向生物反應(yīng)器連續(xù)的提供新鮮培養(yǎng)基（進(jìn)料）并排出發(fā)酵液（出料）的操作方式。穩(wěn)定操作時，進(jìn)料和出料的流量基本相等，因而反映器內(nèi)發(fā)酵液體積和組成保持恒定。流加發(fā)酵介于間歇發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵之間的一種操作方式。流加發(fā)酵的特點是在流加階段按一定規(guī)律向發(fā)酵罐中連續(xù)的補加營養(yǎng)物和或前體，發(fā)酵罐不向外排放產(chǎn)物，罐

21、中發(fā)酵液體積不斷增加，直到規(guī)定體積后放罐。流加發(fā)酵適合于細(xì)胞高密度培養(yǎng)也廣泛用于次級代謝產(chǎn)物的生成。微生物的生長特征微生物的個體雖然微小，但由于其群體數(shù)量驚人的龐大，因而具有極強(qiáng)的代謝能力。微生物大都具有極大的比表面積，這使得微生物與外部環(huán)境之間進(jìn)行物質(zhì)和能量交換的能力非常強(qiáng)。這樣強(qiáng)的代謝能力也使微生物具有驚人的繁殖速率。當(dāng)然當(dāng)微生物數(shù)量接近某一限制量時，由于微生物相互競爭養(yǎng)分和氧氣等，使微生物數(shù)量難以繼續(xù)增加。微生物個體小，繁殖快，數(shù)量多，使微生物具有分布廣，種類多，容易變異，適應(yīng)能力強(qiáng)等特點。微生物代謝能力強(qiáng)，生長繁殖快的特點使其非常適于工業(yè)和其他領(lǐng)域。地球上微生物種類繁多，性能各異，針對

22、特定的用途，通過大范圍的篩選，我們能夠從環(huán)境中找到所需代謝途徑的微生物?；蚪M重排技術(shù)基因組重排技術(shù)可以用來改造細(xì)菌的基因組，實現(xiàn)表型的改良。重排技術(shù)具有多親本雜交的優(yōu)勢。對細(xì)菌群體進(jìn)行重復(fù)的基因組重排可以有效構(gòu)建新菌株的組合文庫。如果將它應(yīng)用到帶表型篩選的細(xì)菌群體中，就會產(chǎn)生很多表型有顯著改良的新菌株。dna重排的基本原理是首先將同源基因（單一基因或基因家族）切成隨機(jī)dna片斷，然后進(jìn)行pcr重聚。那些帶有同源性但核苷酸序列有差異的隨機(jī)dna片段，在每一輪pcr循環(huán)中互為引物和模板，經(jīng)多次pcr循環(huán)后能迅速產(chǎn)生大量的重組dna，創(chuàng)造出新基因。在重聚pcr過程中，當(dāng)來自一種拷貝的小片斷與另一種

23、拷貝的小片斷相互為引物時，即可發(fā)生模板的移位，這樣可使親本基因群中的突變發(fā)生多種組合，導(dǎo)致各種各樣的突變體，這些變異的dna分別轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞后，就會形成很多具有不同性狀的重組菌株，從中可以篩選出符合目標(biāo)的陽性突變重組子。常見的反應(yīng)器發(fā)酵工業(yè)常用細(xì)胞為微生物細(xì)胞，而動植物細(xì)胞也已成為最常用發(fā)酵對象。在發(fā)酵工業(yè)中攪拌器是最常用的反應(yīng)器。在機(jī)械攪拌式反應(yīng)器中，實現(xiàn)物質(zhì)混合傳遞最常用的部件是攪拌漿。用空氣分布器實現(xiàn)發(fā)酵罐中細(xì)胞對于氧氣的需求。根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞對于剪切力耐受能力的不一樣，對于植物細(xì)胞和動物細(xì)胞培養(yǎng)時，他們的攪拌器和微生物細(xì)胞培養(yǎng)的攪拌器常做了不同的改進(jìn)，特別是動物細(xì)胞，他所用的是籠式攪拌器

24、裝置以保證發(fā)酵過程中動物細(xì)胞不受剪切力的損傷。其他鼓泡塔和氣升式反應(yīng)器也是最常見的生物反應(yīng)器類型。而對于固定化的微生物細(xì)胞或者植物細(xì)胞除了普通的攪拌罐外還可以采用流化床反應(yīng)器和填充床反應(yīng)器或中空纖維與膜反應(yīng)器。根據(jù)動物細(xì)胞培養(yǎng)分為懸浮培養(yǎng)和貼壁依賴型培養(yǎng)，可以用中空纖維進(jìn)行動物細(xì)胞的固定化培養(yǎng)或者使用微載體進(jìn)行動物細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)，但后者是動物細(xì)胞才具有的培養(yǎng)類型誘變育種誘變育種的基本原理是利用一些物理或化學(xué)的因素處理微生物細(xì)胞，使其遺傳性狀發(fā)生隨機(jī)的突變，得到大量形狀各異的突變株，然后再從眾多突變株中以一定的方法篩選出生產(chǎn)性能改善的個體。用于處理微生物以使其發(fā)生突變的物理或化學(xué)因素稱為誘變劑。

25、常見的誘變劑類型及其特征常見的誘變劑可以分為物理誘變劑和化學(xué)誘變劑兩大類。常見的物理誘變劑如紫外線，x射線,r射線，快中子，常見的化學(xué)誘變劑如堿基類似物，羥化劑，脫氨劑，烷化劑和誘發(fā)移碼突變的誘變劑。他的缺點是可以引起微生物dna發(fā)生突變的誘變劑往往也能造成人和動物dna的變異。經(jīng)過誘變處理后，變異細(xì)胞一般只占存活細(xì)胞的百分之幾甚至更低，由于誘變劑誘發(fā)的突變是隨機(jī)的，可發(fā)生正突變或副突變，而誘變造成的變異位點位于dna的一條鏈上，而一個dna分子有兩條鏈，多核微生物體內(nèi)還有多個相同功能的dna分子，因此誘變處理后需要對微生物進(jìn)行短時間的培養(yǎng)，以保證每個細(xì)胞中基本上只含有一種類型的dna，篩選突

26、變株的工作量十分巨大，可分為初篩和復(fù)篩兩種。酶的來源酶的來源可以是從動植物細(xì)胞，微生物細(xì)胞或微生物的發(fā)酵液中產(chǎn)生的酶。對于胞內(nèi)酶必須經(jīng)過細(xì)胞破碎，固液分離，提純濃縮和產(chǎn)品精致幾個階段。而對于胞外酶除了不需要細(xì)胞破碎外，其他步驟一致。除了天然酶外，還可以通過酶修飾的方式來獲得一些結(jié)構(gòu)和功能獲得改進(jìn)或提高的酶。這些方法包括金屬離子置換修飾，大分子結(jié)合修飾，肽鏈有限水解修飾，酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾，氨基酸置換修飾以及物理修飾等。金屬離子置換修飾是通過改變酶分子所含的金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變。大分子結(jié)合修飾利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變。蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)修飾可以改變蛋白

27、質(zhì)表面電荷和疏水性，從而影響其催化活性和穩(wěn)定性。酶蛋白中個別氨基酸的置換可以采用點突變的方法很容易就可以完成。根據(jù)酶的作用原理，用人工方法合成的具有活性中心和催化作用的非蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的化合物稱為人工合成酶或人工模擬酶，簡稱人工酶或模擬酶。最簡單的模擬酶無疑是利用現(xiàn)有酶或蛋白質(zhì)為母體，并在此基礎(chǔ)上引入相應(yīng)的催化基團(tuán)。也可以參照酶的活性結(jié)構(gòu)合成一些簡單的小肽作為模擬酶，包括利用環(huán)糊精構(gòu)建模擬酶和分子印跡制備出的人工酶。環(huán)糊精可提供一個疏水的結(jié)合部位并能與一些無機(jī)和有機(jī)分子包接形成絡(luò)合物，以此影響和催化一些反應(yīng)?；蛘咧苽淇贵w酶?？贵w酶是指通過一系列化學(xué)與生物方法制備的具有催化活性的抗體。這種抗體除了具

28、有相應(yīng)的免疫學(xué)性之外，還具有類似于酶催化某些反應(yīng)的特性，因此也稱為催化抗體?；蛘呃镁哂写呋δ艿哪承﹔na 和dna分子，即核酸酶。以及從自然界中存在著一類能在超常生態(tài)環(huán)境下生存的嗜極微生物里尋找大量適應(yīng)極端條件的極端酶。分子印跡技術(shù)是指制備對某一特定分子具有選擇性的聚合物的過程，該特定分子通常稱為印跡分子或模版。分子印跡技術(shù)借助模板在高分子物質(zhì)上形成特異的識別位點和催化位點。常見轉(zhuǎn)基因動物方法常見轉(zhuǎn)基因動物方法有顯微注射法,逆轉(zhuǎn)錄病毒法與干細(xì)胞法等1） 顯微注射法.利用顯微操作系統(tǒng)和顯微注射技術(shù)將外源基因直接注入實驗動物的受精卵原核,將外源基因整合到動物基因組,再通過胚胎移植技術(shù)將整合外源

29、基因的受精卵移植到手提的子宮里繼續(xù)發(fā)育,進(jìn)而得到轉(zhuǎn)基因動物。2） 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法.對于雞受精卵,無法對其進(jìn)行顯微注射操作,適合采用逆轉(zhuǎn)錄病毒的操作方式3） 胚胎干細(xì)胞法.胚胎干細(xì)胞打靶技術(shù)的成熟,為利用胚胎干細(xì)胞建立轉(zhuǎn)基因動物獲得了進(jìn)展4)精子載體法.將外源基因與精子共同培養(yǎng),再通過電穿孔或脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將外源基因?qū)氤墒斓木?使精子攜帶的外源dna進(jìn)入卵中并受精，從而使外源dna整合到染色體中5）體細(xì)胞核移植法，該技術(shù)以動物體細(xì)胞為受體，將目的基因?qū)肽軅鞔囵B(yǎng)的動物體細(xì)胞，再以這些動物體細(xì)胞為核供體，進(jìn)行動物克隆，進(jìn)而得到帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動物（四）36.造血干細(xì)胞造血干細(xì)胞分布于

30、骨髓，外周血和臍血中。尤其臍血中含有豐富的造血千細(xì)胞，造血干細(xì)胞是造血細(xì)胞的“種子”，體內(nèi)所有血細(xì)胞，包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等都由它分化發(fā)育而來，它是人們認(rèn)識最早的千細(xì)胞之一?；蛭膸旎蛭膸?，也叫cdna文庫。首先獲得mrna，反轉(zhuǎn)錄得cdna，經(jīng)克隆后形成文庫。cdna文庫和基因庫的不同之處在于 ，cdna文庫在mrna拼接過程中已經(jīng)除去了內(nèi)含子等成分，便于dna重組時直接使用。38. 人工模擬酶根據(jù)酶的作用原理，用人工方法合成的具有活性中心和催化作用的非蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的化合物稱為人工合成酶或人工模擬酶，簡稱人工酶或模擬酶。39. 生物修復(fù)生物修復(fù)就是利用生物的吸收，富集，代謝等功能作用將

31、污染物轉(zhuǎn)化或降解為無害物質(zhì)甚至有用物質(zhì)，從而加速消除環(huán)境污染物，恢復(fù)生態(tài)系統(tǒng)的一種生物技術(shù)40. 蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程是通過定位突變的方法使所表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，根據(jù)需要設(shè)計新的蛋白質(zhì)氨基酸序列。真核生物基因組比原核生物要大得多，一般選擇識別6個或更多個堿基序列的限制性內(nèi)切酶來酶解真核生物基因組dna。可通過cdna方法，化學(xué)合成法和pcr法來獲得真核生物目的基因放線菌是最主要的抗生素產(chǎn)生菌，它是原核生物，細(xì)胞構(gòu)造和細(xì)胞壁的化學(xué)組成都與細(xì)菌類似。因其菌落呈放射狀而得名。放線菌具有很多真菌家族的特點，如菌絲呈纖細(xì)的絲狀，有分枝。從生物進(jìn)化的角度，他介于細(xì)菌與真菌之間的過渡類型。

32、而霉菌是一類比酵母更高級也更復(fù)雜的小型絲狀真菌，他在培養(yǎng)基上形成絨毛狀，網(wǎng)狀或絮狀的菌絲體。菌絲比細(xì)菌和放線菌的細(xì)胞粗幾倍到幾十倍。代謝工程，又稱為代謝途徑工程或途徑工程，是基于代謝流分析和基因重組技術(shù)改善菌主遺傳性狀的一種先進(jìn)的工程技術(shù)。代謝工程可以在對細(xì)胞的整個代謝網(wǎng)絡(luò)的代謝流進(jìn)行定性，定量分析的基礎(chǔ)上，找出制約目標(biāo)產(chǎn)物積累的關(guān)鍵酶催化反應(yīng)，并利用基因重組技術(shù)直接對代謝途徑中的關(guān)鍵酶進(jìn)行修飾，相對于誘變育種來說，這種方法具有方向性強(qiáng)，目標(biāo)明確，效率高，技術(shù)手段先進(jìn)，過程可控性和重復(fù)性很好的優(yōu)點，缺點是對相應(yīng)微生物的代謝和遺傳機(jī)理知識以及基因操作工具的依賴性太強(qiáng)。組織工程的三種基本要素是細(xì)胞

33、、支架材料與調(diào)節(jié)因子。其中每一種酶都有一些特性的抑制劑，通常將這種酶稱為該抑制劑的靶酶。隨著人類基因組計劃完成及對疾病引發(fā)機(jī)理的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)很多疾病的發(fā)生都是由于基因突變引起的酶蛋白表達(dá)水平的變化引起。這樣一來，只要對這些酶蛋白的活性水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，就可能治愈疾病。這種對疾病具有關(guān)鍵作用的酶就是靶酶，篩選得到的能影響和調(diào)節(jié)靶酶活性并能治療疾病的藥物就是酶標(biāo)藥物。為什么要進(jìn)行酶的固定化（酶的固定化的意義）酶是蛋白質(zhì)，在水中具有很高的溶解度，因此傳統(tǒng)酶催化反應(yīng)幾乎在水溶液中進(jìn)行，催化結(jié)束后溶液中的游離酶只能一次性使用，難以回收，造成了酶的浪費，也會增加目的產(chǎn)物分離的難度和費用，并影響到產(chǎn)物的質(zhì)

34、量，此外溶液中酶的穩(wěn)定性差，容易變性和失活。為了適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的需要，人們模仿生物體中酶的作用方式，通過固定化技術(shù)將酶加以改造固定。酶的結(jié)構(gòu)決定了酶的性質(zhì)和功能，只要酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的變化，就能使酶的特性和功能隨之改變。在研究酶的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，在分子水平上對酶進(jìn)行化學(xué)修飾的方法有：金屬離子置換修飾，大分子結(jié)合修飾，肽鏈有限水解修飾，酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾，氨基酸置換修飾以及物理修飾等。金屬離子置換修飾是通過改變酶分子所含的金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變。大分子結(jié)合修飾利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變。蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)修飾可以改變蛋白質(zhì)表面電荷和疏水性，從而

35、影響其催化活性和穩(wěn)定性。酶蛋白中個別氨基酸的置換可以采用點突變的方法很容易就可以完成。點突變是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的重要工具。重組體篩選的方法重組體篩選的方法很多，歸納起來可分為：在核酸水平和蛋白質(zhì)水平上篩選。從核酸水平篩選克隆子可以通過核酸雜交的方法。這類方法根據(jù)dna-dna,dna-rna堿基配對的原理，以使用基因探針技術(shù)為核心，發(fā)展了原位雜交，southern雜交,northern雜交等方法。從蛋白質(zhì)水平上篩選克隆字的方法主要有：檢測抗生素抗性及營養(yǎng)缺陷型，觀測嗜菌斑的形成，檢測目標(biāo)酶的活性，目標(biāo)蛋白的免疫特性和生物活性等。即：1、 利用抗生素抗性基因2、 營養(yǎng)缺陷互補法3、核酸雜

36、交法4、通過免疫反應(yīng)篩選5、通過酶活性篩選（五）抗體酶是指通過一系列化學(xué)與生物方法制備的具有催化活性的抗體。這種抗體除了具有相應(yīng)的免疫學(xué)性之外，還具有類似于酶催化某些反應(yīng)的特性，因此也稱為催化抗體?；驇?，也叫基因組文庫，是指用克隆的方法將一種生物的全部基因組長期以重組體方式保存在適當(dāng)?shù)乃拗髦?。?xì)胞株細(xì)胞系中往往存在有若干表型相似或相異的細(xì)胞世系，若其中一世系，經(jīng)過選殖克隆，物理性細(xì)胞分離，或其他選擇技術(shù)，而在培養(yǎng)的細(xì)胞群體中辨識出其特殊表型性質(zhì)，該細(xì)胞系便稱為細(xì)胞株。能夠種間共處的微生物各自利用不同的營養(yǎng)物質(zhì)，他們釋放到環(huán)境中的代謝產(chǎn)物也不會影響其它微生物的生長。在間歇培養(yǎng)中，首先將細(xì)胞接種

37、入培養(yǎng)基中，伴隨細(xì)胞的生長過程，細(xì)胞逐漸消耗著培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物，同時，又分泌著產(chǎn)物和副產(chǎn)物。當(dāng)培養(yǎng)基營養(yǎng)物消耗殆盡或者不良副產(chǎn)物積累過多時，細(xì)胞停止生長。污水的生化處理污水的生化處理過程分為好氧和厭氧處理兩大類。污水好氧生化處理過程利用好氧微生物群和原生生物群的共同作用將有機(jī)物降解，降低污水的bod和cod。污水的厭氧生化處理是利用厭氧微生物將污水中的有機(jī)物分解降解的方法。很多厭氧微生物還具有降解一般好氧微生物很難代謝的有機(jī)化合物或有毒物質(zhì)。廢水進(jìn)入?yún)捬鯀^(qū)，由廉性厭氧發(fā)酵菌在厭氧環(huán)境下將可生物降解有機(jī)物轉(zhuǎn)化為較低分子量的揮發(fā)性脂肪酸，聚磷菌將其體內(nèi)的聚磷酸鹽分解釋放能量供轉(zhuǎn)性好氧聚磷微生物吸收

38、并降解有機(jī)基質(zhì)，以phb形式在其體內(nèi)儲存。然后進(jìn)入缺氧區(qū)，反硝化細(xì)菌利用好氧區(qū)回流液中硝酸鹽以及廢水中的有機(jī)基質(zhì)進(jìn)行反硝化，達(dá)到同時降低bod5和脫氮的目的，在好氧區(qū)，聚磷菌通過分解其體內(nèi)phb所釋放的能量維持生長，同時過量攝取環(huán)境中的溶解態(tài)磷，使水中溶解磷濃度降低。bod生化需氧量。在氧的存在下，微生物將有機(jī)物降解并且達(dá)到穩(wěn)定化所消耗的氧量。一般以20度、5天的生化需氧量作為度量污染水體中的有機(jī)物濃度。cod化學(xué)需氧量。指在一定條件下水中有機(jī)物與強(qiáng)氧化劑作用所消耗的氧量。能客觀反映水中有機(jī)物的含量?；蚬こ梯d體外源基因必須先同某種傳遞者結(jié)合后才能進(jìn)入細(xì)菌和動植物受體細(xì)胞，這種能承載外源dna片斷（基因）并帶入受體細(xì)胞的傳遞者就是基因工程載體?；蚬こ梯d體的類型基因工程載體決定了外源基因的復(fù)制，擴(kuò)增，傳代乃至表達(dá)。目前已構(gòu)建應(yīng)用的基因工程載體有：質(zhì)粒載體，噬菌體載體，病毒載體以及由它們相互結(jié)合或與其他基因組dna組合合成的載體。這些載體可分為克隆載體和表達(dá)載體，其中表達(dá)載體又分細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá)兩種。根據(jù)載體轉(zhuǎn)移的受體細(xì)胞不同，可分為真核細(xì)胞和原核細(xì)胞表達(dá)載體，根據(jù)載體功能不同可分為測序載體，克