胰酶消化貼壁細胞

1、貼壁細胞的消化處理貼壁細胞的消化處理及注意事項及注意事項貼壁細胞: 在體外培養(yǎng)條件下，必須貼附于支 持物表面才能生長的細胞。如cho細胞。消化：使經(jīng)過分散的組織或貼壁的培養(yǎng)物相互或與介質(zhì)解離，形成單細胞或小的細胞團的操作。貼壁細胞的消化貼壁細胞的消化 貼壁細胞在培養(yǎng)瓶中長成致密單層后，繼續(xù)生長的空間不足，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成份也消耗較多，同時代謝廢物也有較多堆積，需要分瓶培養(yǎng)，擴增、傳代 。貼壁較緊的細胞如hela，hepg2，cho等，則需要以細胞消化液消化后，才能脫落和分散，擴瓶 。常用的消化液為胰蛋白酶，edta等 主要消化方式一、酶消化法 ( 胰酶trypsin )二、離子螯合劑 ( ed

2、ta )一、酶消化法 ( 胰酶trypsin )1 ) 胰酶消化原理:胰酶是一種蛋白酶。通過在特定位置上降解蛋白，使細胞膜上和培養(yǎng)皿壁結(jié)合處蛋白降解，使兩者分離。這時細胞由于自身內(nèi)部細胞骨架的張力以及培養(yǎng)液表面張力作用下成為球形。 細胞消化用胰蛋白酶常用的工作濃度為0.25，ph為7.2-7.4之間。 2) 酶消化法操作過程：（以下操作均必須嚴格按無菌操作的要求進行） 將長成致密單層細胞的細胞瓶中原來的培養(yǎng)液棄去； 加入0.25胰酶溶液，視細胞瓶的大小加入體積為0.5ml或更多（依培養(yǎng)器皿的大小而定），以使充分浸潤； 一般消化時間約為1至3分鐘，肉眼觀察瓶底由半透明（細胞單層連接成片）轉(zhuǎn)為點狀

3、透明（出現(xiàn)細小空隙）時，棄去胰酶，并加入適量的有血清培養(yǎng)液終止消化，吹打分散。 圖示：cho貼壁細胞 經(jīng)過48小時培養(yǎng)成為致密單層加入0.25%胰酶后細胞逐漸皺縮變圓，細胞間隙增大不再致密 細胞明顯皺縮變小，細胞間隙增大不再致密，部分細胞維持正常形態(tài)，部分細胞皺縮變圓。細胞基本皺縮變圓 此時細胞吹打可下 細胞完全皺縮變圓此時應棄去胰酶，加入培養(yǎng)基后輕搖可將細胞從細胞瓶壁上洗下，將細胞懸液用吸管吹散后傳代 有經(jīng)驗后，可肉眼對光觀察貼壁半透明的細胞層，判斷消化程度。如消化過頭，會見到許多細胞脫落隨棄去的胰酶溶液流失,甚至造成細胞破碎。也可以在倒數(shù)第二、三步時棄去胰酶，用瓶中殘留的胰酶繼續(xù)作用至最后

4、一步的消化程度，這樣略有點過也影響不大 注意事項1在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩(wěn)定 。2. 在使用胰酶細胞消化液的過程中要特別注意避免消化液被細菌污染。 3. 胰酶細胞消化液消化細胞時間不宜過長，否則細胞鋪板后生長狀況會較差。消化不足則細胞難于從瓶壁上吹下，反復吹打同樣也會損傷細胞活性。4. 在37時,胰酶活性最強。5. 溶液中的ca2+、mg2+和血清中的非特異性胰蛋白酶抑制劑會降低胰酶活力消化過頭，所以加入有血清培養(yǎng)基可以終止反應常見問題: 用胰蛋白酶消化后，細胞還是成團，原因可能是什么？消化時間不

5、夠； 吹打力度不夠； 胰酶消化液濃度不夠； 胰酶本身問題； 細胞密度過高;二、離子螯合劑：（edta）1) edta消化 原理: edta是一種螯合劑，因為細胞表面很多和培養(yǎng)皿結(jié)合的蛋白都帶有ca2+, 或者mg2+ ，而edta就是螯合ca2+, 或者mg2+ 的，從而加速細胞和培養(yǎng)皿的脫離 。2) edta消化液使用注意事項 1. 常用濃度在0.02%左右。 2. 在弱堿性條件下才易溶,配制時應調(diào)節(jié)好酸堿度。 3. edta能顯著影響ph值,且不會被終和,所以消化下來的細胞要拿pbs洗一遍3)適用范圍因為edta不破壞細胞表面分子，僅與ca2+,mg2+螯合。所以適用于需檢測細胞表面分子的

6、細胞消化。細胞凍存: 細胞保存的主要方法之一。 利用凍存技術(shù)將細胞置于-196液氮中 低溫保存，使細胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復蘇細胞用于實驗。細胞復蘇：將凍存的細胞解凍，再進行傳代培養(yǎng)。要獲得好的凍存與復蘇效果，必須了解以下幾個問題：冷凍速率復溫速率冷凍保護劑冷凍保存溫度1 1、 冷凍速率冷凍速率 冷凍速率是指降溫的速度，是活細胞能否被冷凍到一個能永久保存的溫度的一個主要因素。冷凍速率太快或太慢都會造成細胞的損傷，只有以最適的冷凍速率冷凍細胞，才能獲得最佳的冷凍保存效果。2 2、復溫速率、復溫速率 復溫速率是指細胞復蘇時溫度升高的速度。冷凍保存的細胞復蘇時，

7、復溫速率不當也會降低冷凍存活率。一般來說復溫速度越快越好，37水浴中，12分鐘內(nèi)要完成復溫。3 3、冷凍保護劑、冷凍保護劑冷凍保護劑是指可以保護細胞免受冷凍損傷的物質(zhì)，常被加到一定的溶液中進行配制，作為冷凍保護液。常用的冷凍保護劑 ：4 4、冷凍保存溫度、冷凍保存溫度 冷凍保存溫度是指能長久保存細胞的一個深低溫度。在這樣的溫度下，細胞生化反應極其緩慢或停止，但經(jīng)長期保存和復蘇后仍能保持正常的結(jié)構(gòu)和功能。從實際和效益的觀點出發(fā)，液氮溫度（196）是目前最佳冷凍保存溫度：是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外，在胞外形成冰

8、晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷 。的濃度必須=10%,大于這個濃度即使在低溫對細胞也有毒性作用。有些細胞不能用dmso，可用甘油。 細胞凍存程序1細胞凍存前24-48小時傳代培養(yǎng)，使細胞處于 指數(shù)生長期 2經(jīng)胰酶消化后，加入適量培養(yǎng)基，吹打成細胞 懸液 3加入新生牛血清4加入經(jīng)過除菌過濾的5混勻6將懸液加入滅菌凍管中，1-2 ml/支，嚴密封口后，注明細胞名稱 7置4度冰箱中，30分鐘后轉(zhuǎn)入-20度冰箱中，30分鐘后轉(zhuǎn)入液氮口，小時后轉(zhuǎn)入液氮中保存8.復蘇一支細胞，檢測細胞活力及有無污染 細胞復蘇程序取出貯存細胞，37水浴中快速融化 直接用完全生長培養(yǎng)基鋪板細胞。1ml凍存細胞使用1020ml完全生長培養(yǎng)基 .24小時