流式配色及分析

1、流式配色分析及實驗設(shè)計流式配色分析及實驗設(shè)計pefitc 熒光素是具有熒光特性的染料熒光素是具有熒光特性的染料 只在特定波長激光照射后才發(fā)出自身熒光只在特定波長激光照射后才發(fā)出自身熒光 發(fā)出的熒光顏色（波長）也是固定的發(fā)出的熒光顏色（波長）也是固定的什么是熒光素什么是熒光素關(guān)于流式抗體流式細胞技術(shù)：流式細胞技術(shù)：在細胞分子水平上；在細胞分子水平上；通過單克隆抗體；通過單克隆抗體；對單個細胞或其他生物粒子；對單個細胞或其他生物粒子；進行多參數(shù)；進行多參數(shù)；快速的；快速的；定量分析。定量分析。光學系統(tǒng)：經(jīng)熒光染色的細胞在激光的照射下產(chǎn)生散射光和熒光信號，同光學系統(tǒng)：經(jīng)熒光染色的細胞在激光的照射下產(chǎn)

2、生散射光和熒光信號，同時被前向光電二極管和一組光電倍增管（時被前向光電二極管和一組光電倍增管（pmt）接收，熒光信號經(jīng)一系列）接收，熒光信號經(jīng)一系列雙色性反射鏡和帶通或長通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號雙色性反射鏡和帶通或長通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號光源液流通路信號和數(shù)據(jù)信號和數(shù)據(jù)光源光源液流通路液流通路液流系統(tǒng)：鞘液包繞著單行排列的細胞依次高速通過流動池，而激液流系統(tǒng)：鞘液包繞著單行排列的細胞依次高速通過流動池，而激光聚焦于流動池中心的樣本流上，隨后經(jīng)檢測的樣本和鞘液流向廢光聚焦于流動池中心的樣本流上，隨后經(jīng)檢測的樣本和鞘液流向廢液桶。液桶。前向角散射光信號前向角散

3、射光信號側(cè)向角散射光信號側(cè)向角散射光信號外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖（紅細胞溶解后）（紅細胞溶解后）熒光信號熒光信號 使用不同熒光標記的單克隆抗體染色，做多色使用不同熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析分析 熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量光學系統(tǒng)：濾光片光學系統(tǒng)：濾光片 如何將一束混合的熒光區(qū)分開來，分別進行收集呢？如何將一束混合的熒光區(qū)分開來，分別進行收集呢？ 濾光片置于熒光探測器前，限定其接收的熒光的波長范圍濾光片置于熒光探測器前，限定其接收的熒光的波長范圍 longpass(lp) shortpass(sp)

4、bandpass(bp)460 500 540460 500 540460 500 540流式結(jié)果除了染色的每個熒光抗體的表達情況，還包含了細胞的大小和復雜流式結(jié)果除了染色的每個熒光抗體的表達情況，還包含了細胞的大小和復雜程度的情況程度的情況fsc：前向角散射光，值越大，細胞越大：前向角散射光，值越大，細胞越大ssc：側(cè)向角散射光，值越大，細胞越復雜：側(cè)向角散射光，值越大，細胞越復雜雙參數(shù)散點圖雙參數(shù)散點圖單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖多色組合原則強弱搭配強弱搭配避免補償減少偶聯(lián)染料避開自發(fā)熒光流式細胞術(shù)中常見的熒光抗體一覽熒光素熒光素激發(fā)波長激發(fā)波長發(fā)射波長發(fā)射波長發(fā)射光顏色發(fā)射光顏色bv421(

5、v450)405450藍bv510(v500)500綠bv605605紅fitc(af488,bb515)488(561）530綠pe(pi)578橙percpcy5.5695紅pe-cy7780遠紅apc(af647,ef660)635(640)660紅apc-cy7(apc-h7,ef780)780遠紅熒光素熒光素顏色顏色calibur/c6verse，cantoii，ariafortesa，新新cantofc500cytoflexbv421(v450)藍可選可選可選bv510(v500)綠可選可選可選bv605紅可選可選fitc(af488,bb515)綠11111pe(pi)橙2222

6、2percpcy5.5紅33333pe-cy7遠紅444可選apc(af647,ef660)紅45534apc-cy7(apc-h7,ef780)遠紅664可選常見流式儀可用熒光抗體一覽熒光素熒光素顏色顏色verse，cantoii，ariabv421(v450)藍7bv510(v500)綠8bv605紅fitc(af488,bb515)綠1pe(pi)橙2percpcy5.5紅3pe-cy7遠紅4apc(af647,ef660)紅5apc-cy7(apc-h7,ef780)遠紅6可以也僅可以最多選擇8個熒光抗體去標記抗原；需要注意：同一通道不可以選2種熒光抗體，例如：af488，bb515,

7、fitc 不可以同時使用；cd5cd8染料的亮度與抗原表達強度相匹配染料的亮度與抗原表達強度相匹配三大類三大類:primary: 很好鑒定，容易區(qū)分陰陽性細胞群，陰陽性峰分得很開examples: cd3, cd4, cd45secondary: 很好鑒定，較高水平表達，經(jīng)常連續(xù)性表達examples: cd27, cd28, cd45ra, cd45rotertiary: 低水平表達，激活性marker，或者表達區(qū)分不明顯example: cd25cd4cd45racd25染料的亮度與抗原表達強度相匹配染料的亮度與抗原表達強度相匹配染料的亮度與抗原表達強度相匹配染料的亮度與抗原表達強度相匹配

8、強弱搭配：即弱表達的抗原搭配強熒光，強表達的抗原搭配弱熒光熒光素的強弱：強4：apc, pe,pe-cy7 bv421弱4：fitc percpcy5.5 apc-cy7 bv510抗原的強弱：強的：cd3,cd4,cd8,cd45等弱的：大部分胞內(nèi)/核內(nèi)因子（il系列，foxp3等）； cd25,大部分cd大于100（cd127,cd133等）；染料的亮度與抗原表達強度相匹配染料的亮度與抗原表達強度相匹配染料的亮度與抗原表達強度相匹配染料的亮度與抗原表達強度相匹配panel1染料的亮度與抗原表達強度相匹配染料的亮度與抗原表達強度相匹配panel2染料的亮度與抗原表達強度相匹配染料的亮度與抗原

9、表達強度相匹配panel1染料的亮度與抗原表達強度相匹配染料的亮度與抗原表達強度相匹配panel2避免補償cd45-fitcdim cd4-pecd45 fitc 漏到 pe， cd4 pe 弱信號分不開cd45- percpdim cd4-pecd45 percp 不漏到 pe ，弱 cd4 可以分開uncompensatedcompensateddata spread due to spillover避免補償1 1）采用多激光激發(fā)減少重疊）采用多激光激發(fā)減少重疊2 2）避免雙激發(fā)熒光染料）避免雙激發(fā)熒光染料488激發(fā)：fitc pe percpcy5.5 pe-cy7635激發(fā)：apc a

10、pc-cy7405激發(fā)：bv421 bv510cd3/cd4/cd8 可選 fitc apc-cy7 bv510減少pe-cy5，amcyan等熒光抗體的使用率；0 hours2 hours22.5 hourspecd8cd3pe-cy5pe-cy7樣本曝光時間percp減少偶聯(lián)染料的使用率：選擇更穩(wěn)定的偶聯(lián)染料：自發(fā)熒光多的選擇用635激發(fā)的染料bd horizontmv500cd45bdtm apc-h7cd14fitccd8percp-cytm5.5cd4bd horizontm v450cd3apccd19pe-cy7cd56pecd80fluorochromeantigenperfe

11、ct!多色組合原則1、要用什么抗體？要用多少種抗體？要用什么抗體？要用多少種抗體？最多8種 4+2+22、強弱搭配強弱搭配染料的亮度與抗原表達相匹配3、避免補償不同激光器激發(fā)/ 避免雙激發(fā)染料4、減少偶聯(lián)染料使用更穩(wěn)定的偶聯(lián)染料5、自發(fā)熒光高的樣本：紅激光激發(fā)優(yōu)寧維流式免費課堂優(yōu)寧維流式免費課堂流式實驗上機前的準備流式實驗上機前的準備cd19cd4cd56cd14cd16cd8cd(cluster of differentiation) marker:用于鑒定白細胞的分類，不同的白細胞表面帶有不同的cdmarker通過帶有熒光標記的抗體和抗原特異性結(jié)合：cd19cd4cd56cd14cd16c

12、d8流式鑒定白細胞的各種亞型：表面蛋白流式檢測步驟：stainanalyzewash*2檢測胞內(nèi)細胞因子:胞內(nèi)因子流式檢測步驟：fixpermeabilizestainanalyze表面染色和胞內(nèi)染色的區(qū)別？cd4 ifn-rth1細胞cd4ifn-r正常染色情況下，由于抗體無法穿過完整的細胞膜，胞內(nèi)因子無法被染上顏色，僅表面marker染色成功；通過固定破膜建立胞內(nèi)染色通道ifn-rth1細胞表面染色固定破膜胞內(nèi)染色固定劑和破膜劑固定劑：起穩(wěn)定細胞膜、保持細胞膜表面抗體與抗原結(jié)合的作用；起穩(wěn)定細胞膜、保持細胞膜表面抗體與抗原結(jié)合的作用；破膜劑：使流動的、完整的細胞膜產(chǎn)生小孔以利于抗體進入細胞

13、；使流動的、完整的細胞膜產(chǎn)生小孔以利于抗體進入細胞；（少量沉淀正常，皂角苷沉降）（少量沉淀正常，皂角苷沉降）破膜的位置不同，破膜劑的選擇不同：對于核內(nèi)/轉(zhuǎn)錄因子的檢測，我們需要采用針對破核的破膜劑；固定劑和破膜劑this kit enables the fixation and permeabilization of cells which is necessary for staining intracellular cytokines with fluorochrome-conjugated anti-cytokine antibodies. the bd pharmingen trans

14、cription factor buffer set is optimized for fixing and permeabilizing cells prior to immunofluorescent staining and flow cytometric analysis of cells that express specific intracytoplasmic and intranuclear proteins. 胞內(nèi)因子和核內(nèi)因子的同時檢測：問：同時檢測th1/th2/th17和treg這幾個細胞時是否有推薦的 buffer？答：核內(nèi)因子和胞內(nèi)因子共測時一般推薦使用bd:562

15、574轉(zhuǎn)錄/核內(nèi)因子固定破膜試劑盒；但是：經(jīng)驗證，foxp3 與 il-4無法同時檢測 ，但 foxp3和il-17a、 ifn-一起染色良好。故當需要同時檢測th2/treg時需要準備2種固定破膜試劑盒并分開檢測。胞內(nèi)因子的含量與檢測效果為何同時檢測treg和th，th的陽性率很低而treg正常？胞內(nèi)因子的含量與檢測效果為何同時檢測treg和th，th的陽性率很低而treg正常？ 僅活化狀態(tài)下的t細胞才會特異性的分泌相關(guān)分泌型細胞因子，而正常情況下大部分t細胞處于未活化狀態(tài)； foxp3本身屬于轉(zhuǎn)錄因子，始終存在于treg細胞之中；如想要鑒定到th中的細胞因子，則必須對其進行“開源”與“節(jié)流

16、”。胞內(nèi)因子的含量與檢測效果如想要鑒定到th中的細胞因子，則必須對其進行“開源”與“節(jié)流”。開源：刺激活化t細胞。方法有二：1:pma（pha/lps.)ionomycin:pma能自由透過細胞膜，因此能繞過細胞膜受體直接激活pkc;ionomycin則能使細胞膜外ca2+進入膜內(nèi)增加，導致細胞內(nèi)游離鈣濃度升高；只有pma+ionomycin聯(lián)合應(yīng)用才是使t細胞進入細胞周期的最有效的方法.2.cd3/cd28：通過包被cd3和添加游離的cd28來封閉抗原提呈，從而一定程度上可以促進t細胞增殖；但是效果不如pma+離子霉素，并且對于某些t細胞亞型的活化效果也不好；胞內(nèi)因子的含量與檢測效果如想要鑒

17、定到th中的細胞因子，則必須對其進行“開源”與“節(jié)流”。節(jié)流：阻斷細胞內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)運：1:monensin：莫能霉素是一種離子載體(ionophore)，可以破壞高爾基體，抑制細胞內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)運；2.bfa:全稱brefeldin a（布雷霉素），是一種常用的蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑，特異性地可逆地阻斷蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(er)轉(zhuǎn)運到高爾基體(golgi)胞內(nèi)因子的含量與檢測效果the leukocyte activation cocktail, with bd golgiplug is a ready -to-use polyclonal cell activation mixture containing

18、the phorbol ester, pma (phorbol 12-myristate 13-acetate), a calcium ionophore (ionomycin) and the protein transport inhibitor bd golgiplug (brefeldin a). 胞內(nèi)因子的含量與檢測效果經(jīng)過“開源”和“節(jié)流”之后的樣本和先前的實驗結(jié)果對比：未刺激活化刺激活化后流式實驗上機模版設(shè)流式實驗上機模版設(shè)置和結(jié)果分析置和結(jié)果分析流式實驗上機模版設(shè)置流式實驗上機模版設(shè)置設(shè)置上機模版需要用到：空白對照管：去除自發(fā)熒光空白對照管：去除自發(fā)熒光同型對照管：去除非特異性

19、熒光同型對照管：去除非特異性熒光單陽補償管：去除熒光泄漏單陽補償管：去除熒光泄漏實驗樣本管：檢測樣本實驗樣本管：檢測樣本一、空白對照管：即只有樣本的對照管；一、空白對照管：即只有樣本的對照管；用來排除細胞的自發(fā)熒光，調(diào)節(jié)閾值、電壓，設(shè)定陰用來排除細胞的自發(fā)熒光，調(diào)節(jié)閾值、電壓，設(shè)定陰性區(qū)域；性區(qū)域；同型對照（同型對照（isotype control）：使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同）：使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細胞表面而產(chǎn)生的結(jié)合到細胞表

20、面而產(chǎn)生的 背景染色。背景染色。二、同型對照管：即樣本二、同型對照管：即樣本+同型對照抗體孵育的實驗管；同型對照抗體孵育的實驗管；用來排除細胞和抗體用來排除細胞和抗體fc段非特異性結(jié)合產(chǎn)生的熒光段非特異性結(jié)合產(chǎn)生的熒光非特異熒光非特異熒光產(chǎn)生原因分兩類，一類是抗體fc段與細胞表面的fc受體非特異結(jié)合上的熒光染料受光照發(fā)出的熒光，可使用fcr阻斷劑阻斷；另細胞損傷也會導致非特異性染色，此類染色無法阻斷，需用同型對照對比或進行死細胞排除。例如：針對紅細胞的抗體當使用fcr阻斷劑進行阻斷后同型對照依舊有較強雜信號和非特性干擾時，可用pi,7-aad,fvs等染料進行死活細胞染色排除干擾；選擇選擇bd

21、 fixable viability stain reagents（fvs染料）：染料）：v fvsfvs染色不會被固定，破膜以及洗滌步驟影響；染色不會被固定，破膜以及洗滌步驟影響；v fvsfvs的光譜多樣，適合多種染色組合的搭配，發(fā)射波普也非常集中；的光譜多樣，適合多種染色組合的搭配，發(fā)射波普也非常集中；選擇選擇bd fixable viability stain reagents（fvs染料）：染料）：熒光補償：熒光補償：所謂所謂“補償補償”就是除去某一熒光素誤入到其它熒光通道中的發(fā)射光信號。就是除去某一熒光素誤入到其它熒光通道中的發(fā)射光信號。通過調(diào)節(jié)儀器完成這一步驟。往往我們通過檢測帶

22、有單一熒光素的樣本來通過調(diào)節(jié)儀器完成這一步驟。往往我們通過檢測帶有單一熒光素的樣本來減除誤入其他熒光通道的信號。既單陽管。減除誤入其他熒光通道的信號。既單陽管。三、單陽管：帶有單一熒光抗體的樣本管三、單陽管：帶有單一熒光抗體的樣本管用來排除熒光補償* * *注意，實驗用到幾種熒光，就要制備幾種單陽管注意，實驗用到幾種熒光，就要制備幾種單陽管* * *完整的流式實驗方案完整的流式實驗方案包括：空白對照管：去除自發(fā)熒光空白對照管：去除自發(fā)熒光同型對照管：去除非特異性熒光同型對照管：去除非特異性熒光單陽補償管：去除熒光泄漏單陽補償管：去除熒光泄漏實驗樣本管：檢測樣本實驗樣本管：檢測樣本陰性對照與陽性

23、對照通過設(shè)置陰性對照和陽性對照更好的界定實驗組的樣本表達情況；流式上機時的儀器條件設(shè)置閾值設(shè)定光電倍增管電壓設(shè)定補償調(diào)節(jié)門與設(shè)門閾值設(shè)定流式細胞分析的對象主要是細胞和微球，但實際上細胞碎片，顆粒性雜質(zhì)也會被檢測到。通過設(shè)定閾值可以減少后者的干擾；每個通道閾值都可以設(shè)定。通常選擇fsc通道進行閾值的設(shè)定，特定情況下會同時/或設(shè)定其他通道的閾值；通常使用空白對照空白對照調(diào)整閾值；電壓設(shè)定每一個流式通道都有自己特定的光電倍增管，其電壓獨立調(diào)控，在初次上機時一定都要調(diào)節(jié)到位，例如行fitc/pe雙染，需調(diào)節(jié)fsc，ssc，fitc，pe4個通道的各自電壓；通常使用空白對照空白對照進行設(shè)定電壓偏低電壓合

24、適電壓偏高在行多色實驗時，電壓應(yīng)該盡可能的合適甚至是稍微偏低，否則會影響到補償調(diào)節(jié)；電壓必須先于補償調(diào)節(jié)，改變電壓補償亦會隨之改變；補償設(shè)定通常使用單陽管單陽管進行設(shè)定光譜重疊會導致不同熒光通道間干擾，通過補償調(diào)節(jié)將干擾信號減去，從而保證流式分析結(jié)果的正確；調(diào)節(jié)補償是按照“被減原則”進行；relative intensity650 nm700 nm500 nm550 nm600 nmwa v el e n gt h (n m )detector - % signalfitc compensationfl1530/30fl2585/42fitc compensation24.8% of the signalsensed in fl2650 nm700 nm500 nm550 nm600 nmrelative intensitywavelength (nm)figure cfl1530/30fl2585/42650 nm700 nm500 nm600 nmrela