腦干熱休克蛋白70的表達(dá)與實(shí)驗(yàn)性腦損傷猝死的相關(guān)性Word

1、腦干熱休克蛋白70的表達(dá)與實(shí)驗(yàn)性腦損傷猝死的相關(guān)性 摘要：目的  了解腦損傷后熱休克蛋白70 (heat-shock protein 70, hsp70) 蛋白質(zhì)及mrna在腦干局部的改變，及其對(duì)維持腦干生命中樞功能的作用。方法  用頭顱打擊器制成大鼠腦損傷猝死模型，免疫組化法分別測定損傷組損傷前和損傷后1、3、6、12 h及損傷猝死組腦干hsp70的數(shù)量和分布變化；逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)檢測各組相應(yīng)部位hsp70 mrna水平。 結(jié)果  在腦損傷15 min后腦干hsp70 mrna水平顯著升高， hsp70蛋白質(zhì)需36

2、 h才大量表達(dá)；損傷后猝死的鼠腦中僅見hsp70 mrna升高，hsp70蛋白質(zhì)與對(duì)照組無差異。結(jié)論  腦損傷后hsp70合成迅速增加，清除損傷因素，維持自穩(wěn)狀態(tài)；當(dāng)損傷嚴(yán)重時(shí)，應(yīng)激蛋白質(zhì)的合成障礙，抗損傷的保護(hù)機(jī)制不能發(fā)揮，腦干生命中樞的功能紊亂，生命喪失。因此， hsp70 mrna-蛋白質(zhì)分離可作為神經(jīng)細(xì)胞致死性損傷的標(biāo)志。關(guān)鍵詞： 熱休克蛋白類； 腦損傷； 免疫組織化學(xué)； 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)相關(guān)幫助需要相關(guān)抗體試劑的可以訪問fantibody全球抗體搜索引擎fantibody全球抗體搜索引擎是一個(gè)供公共檢索的抗體數(shù)據(jù)庫，其抗體信息數(shù)據(jù)來源于全球范圍的研究機(jī)構(gòu)與商業(yè)公司。

3、該引擎由商品化抗體數(shù)據(jù)庫與抗體應(yīng)用評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫兩部分組成，以幫助研究者更高效的尋找并評(píng)估該抗體的性能。全球抗體搜索引擎是繼基因與蛋白數(shù)據(jù)庫之后更為復(fù)雜的應(yīng)用型檢索平臺(tái)需要相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備、生物試劑、醫(yī)療器械、制藥設(shè)備、醫(yī)藥原料、體外診斷試劑及耗材與技術(shù)服務(wù)信息的，可以訪問探生網(wǎng)biomean進(jìn)行咨詢，期待您的加入腦損傷致死的機(jī)制涉及腦外傷危重程度的判定、搶救措施的實(shí)施及法醫(yī)鑒定等。一般認(rèn)為腦死亡的原因是位于腦干的生命中樞的生理活動(dòng)停止。因腦干體積較小，損傷多不易發(fā)現(xiàn)，故何種程度的損傷為致死性損傷無確切標(biāo)準(zhǔn)。熱休克蛋白(heat-shock proteins, hsps)作為應(yīng)激反應(yīng)的重要物質(zhì)

4、基礎(chǔ)和標(biāo)志，腦損傷后其表達(dá)增強(qiáng)已有報(bào)道13。作者發(fā)現(xiàn)腦干針刺損傷后，局部神經(jīng)元中hsp70表達(dá)增強(qiáng)對(duì)于腦干開放性機(jī)械損傷具有定位價(jià)值。閉合性腦損傷時(shí)hsp70在腦干表達(dá)又如何，與生存是否相關(guān)？本研究通過觀察腦損傷后大鼠腦干hsp70的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，探討致死性腦損傷的機(jī)制。    1  材料與方法    1.1  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物    健康wistar大鼠45 只，體質(zhì)量180250 g，雌雄不拘。   

5、60;1.2  試劑    鼠抗鼠骨髓瘤 hsp70 抗體(santa cruz 公司)、high-sabc免疫組化染色試劑盒 (武漢博士德公司)、dab顯色試劑盒(武漢博士德公司)、rnagents total rna isolation system(promiga公司)、oligodt (15)(promiga公司)、逆轉(zhuǎn)錄酶m-mulv reverse transcriptase(new england公司)、taq酶(基因公司)phix174 dna /hea markers(promiga公司)。  &

6、#160; 參考文獻(xiàn)56，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，確定hsp70、-actin pcr擴(kuò)增引物：5'-ctcgtgcgtggccgtgttcc-3'，5'-tcgcccttgtagttcacctg-3' (285 b p)； 5'-actcctacgtgggcgacgag-3'，5'-aggtccagacgcaggatggc-3'(388 bp)(sangon公司)。    1.3  實(shí)驗(yàn)方法    1.3.1 

7、60;動(dòng)物模型   大鼠吸入乙醚麻醉，剪去枕部的毛，伏臥固定在自制的大鼠顱腦彈射打擊裝置上，打擊錘與枕骨結(jié)節(jié)相對(duì)。拉動(dòng)手柄，壓縮彈簧，使擊錘回退，讀取擊桿上彈簧壓縮的距離(x)，松開手柄，擊錘借彈簧推動(dòng)打在枕骨結(jié)節(jié)上。該處顱骨較厚，承受打擊時(shí)不易骨折，且下方是小腦延髓，易造成延髓橋腦損傷。根據(jù)虎克定律計(jì)算出鼠腦受到的打擊力。將大鼠分3組：第1組為正常對(duì)照組(5只)，大鼠麻醉后直接處死；第2組為損傷組(5×6只)，打擊時(shí)彈簧的x為58 cm，打擊力1.022.61 kn；第3組為損傷猝死組(10 只)，x為912 cm，打擊力3.315.88 kn。 &#

8、160;  1.3.2  取材  打擊后按預(yù)定時(shí)間剪大鼠心臟處死，取腦。福爾馬林固定延髓，石蠟包埋，其余腦干稱重。采用promiga公司的rnagents total rna isolation system抽提總rna。    1.3.3  he及high-sabc免疫組化染色  取延髓冠狀面切出5 m的組織切片。常規(guī)he染色，免疫組化染色按試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行。400倍光鏡下計(jì)數(shù)cv、 cd hsp70免疫活性陽性神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量

9、(每一處按上下左右及中央選擇5 個(gè)視野)。    1.3.4  rt-pcr   隨機(jī)引物oligodt (15)逆轉(zhuǎn)錄鼠腦cdna全序列，再用特異引物(hsp70、-actin)復(fù)合擴(kuò)增。退火溫度為61 ，循環(huán)30次。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8% 聚丙烯酰胺凝膠電泳后，銀染，干膠，marker為phix174 dna/hea 。電泳結(jié)果用掃描儀輸入計(jì)算機(jī)，經(jīng)image master vds (3.0) 圖像分析軟件包處理，測出每條帶的d()值，以同一樣本的hsp70與內(nèi)對(duì)照-actin的積分值的百分比值作為計(jì)量hsp70 mr

10、na的標(biāo)準(zhǔn)。所有數(shù)據(jù)用spss 8.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理。    2  結(jié)果    2.1  大體標(biāo)本及he染色    損傷組大鼠打擊后一般昏迷35 min，其中20只醒后出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)體征。分別于打擊后15、30 min 和1、3、6、12 h取腦，鏡下見13只大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血，腦實(shí)質(zhì)小灶出血，損傷超過6 h者見腦水腫。損傷猝死組中8 只深昏迷，出現(xiàn)呼吸暫停，抽搐、角弓反張，昏迷815 min后相繼死亡。其中2 只蛛網(wǎng)膜下腔出血嚴(yán)重

11、，鏡下見大腦頂枕葉有明顯的腦挫傷、出血；其余6 只雖也有少量的蛛網(wǎng)膜下腔出血，但腦實(shí)質(zhì)未見明顯的挫傷、出血，he示延髓微血管充血，神經(jīng)元腫脹。    2.2  損傷前后腦干中hsp70蛋白質(zhì)的表達(dá)    免疫組化示hsp70蛋白質(zhì)出現(xiàn)在神經(jīng)元、血管內(nèi)皮及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿、生物膜。鼠腦機(jī)械損傷后短期內(nèi)，延髓的hsp70陽性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增加(f =4.285, p<0.001)；血管內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量也迅速增加(f =5.735, p<0.01)。延髓神經(jīng)元中hsp70免疫陽性增強(qiáng)

12、，最早出現(xiàn)在傷后1 h (t=2.133, p<0.05) (圖1，見封三)，并持續(xù)到傷后12 h。而嚴(yán)重?fù)p傷后猝死鼠腦腦干中hsp70陽性細(xì)胞種類和數(shù)量均無明顯改變(表1)。     圖1  腦損傷后大鼠延髓神經(jīng)元中hsp70蛋白表達(dá)增強(qiáng)(he 染色，×200)    fig.1  enhanced hsp70 expression in the neurons of the bulbus medulla after injury(he staining,&

13、#215;200)    2.3  損傷前后腦干中hsp70 mrna的變化    正常腦干hsp70 mrna水平為(7.05±0.41)。腦損傷后(15 min、30 min、1 h、3 h、6 h)hsp70 mrna 大量增加，15 min腦干內(nèi)的hsp70 mrna水平比對(duì)照組上升數(shù)倍(t=12.428, p<0.001)(圖2)，且重傷猝死大鼠腦干中hsp70 mrna水平亦明顯增高(t=5.381, p<0.01)，但未達(dá)到損傷組的峰值(t=5.530, p&

14、lt;0.001)，傷后6 h損傷組 hsp70 mrna仍維持較高水平(表2)。腦干損傷后hsp70 mrna表達(dá)迅速增強(qiáng)，說明局部增加的hsp70 蛋白質(zhì)為內(nèi)源性的，且hsp70 mrna對(duì)應(yīng)激損傷的反應(yīng)明顯比蛋白質(zhì)迅速。     圖2  腦損傷后大鼠腦干中hsp70 mrna含量    fig.2  the levels of hsp70 mrna in the brain stem after injury    3 

15、 討論    應(yīng)激反應(yīng)是生物體對(duì)趨于打亂其自穩(wěn)狀態(tài)的各種不良刺激的生物反應(yīng)的總和，此代償反應(yīng)不足或不適當(dāng)，就會(huì)造成生物穩(wěn)態(tài)的破壞。而hsps貼切地說應(yīng)稱(熱)應(yīng)激蛋白(heat) stress proteins，是生物體在高溫及其它應(yīng)激條件下合成的一組蛋白質(zhì)，它們能增加生物體對(duì)各種損傷因子的耐受性，對(duì)生物體在嚴(yán)酷環(huán)境下生存起重要作用。在應(yīng)激反應(yīng)中，hsps充當(dāng)信息傳遞的介質(zhì)和對(duì)抗損傷的保護(hù)因子。顱腦損傷時(shí)誘導(dǎo)hsps表達(dá)增強(qiáng)的因素包括：(1)物理因素，如擠壓、牽拉、切割造成的組織細(xì)胞損傷；(2)化學(xué)因素， 如缺氧、電解質(zhì)紊亂、興奮性物質(zhì)，最重要

16、的是各種蛋白質(zhì)的異常，包括變性、聚積、錯(cuò)裝、錯(cuò)疊、未折疊和蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)外的異常轉(zhuǎn)移；(3)血管因素，如血管痙攣導(dǎo)致栓塞、缺血、腦水腫、出血及血腫形成壓迫等。最早發(fā)現(xiàn)hsp70在腦損傷后表達(dá)增強(qiáng)的是brown， 隨后不同的作者也先后證實(shí)不同類型腦損傷后，損傷局灶邊緣及一些對(duì)損傷敏感的結(jié)構(gòu)如海馬ca1-ca3等處hsp70會(huì)明顯增加。hsp70表達(dá)增強(qiáng)與損傷程度相關(guān)，一般出現(xiàn)在損傷后324 h。那么，升高的hsp70是否是損傷局部神經(jīng)細(xì)胞對(duì)損傷因素的自身反應(yīng)呢？動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明腦損傷后hsp70基因的轉(zhuǎn)錄迅速增強(qiáng)，短時(shí)間內(nèi)hsp70 mrna水平上升數(shù)倍到十幾倍。表明神經(jīng)細(xì)胞在應(yīng)激因素作用下，hsp70基因的轉(zhuǎn)錄被啟動(dòng)，hsp70大量表達(dá)。    本研究側(cè)重于腦外傷時(shí)腦干的損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一定程度的閉合顱腦損傷，即使大體及組織病理學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)腦干明顯異常，腦干延髓的hsp70 mrna及蛋白質(zhì)水平也明顯升高，且表達(dá)增強(qiáng)的規(guī)律與開放性腦干損傷的基本相似。說明閉合性腦外傷時(shí)，各種損害因素同樣也會(huì)作用于腦干，而hsp70對(duì)受損神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用可維持神經(jīng)細(xì)胞的基本功能，對(duì)腦干延髓生命中樞而言，表現(xiàn)為生命活動(dòng)得以維持。損傷后猝死的大鼠腦干中，hsp70 mrna短時(shí)內(nèi)也明顯升高，hsp70蛋白卻未見相應(yīng)升高。作者